Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.2 Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro
perméabilisées avec une solution de PBS contenant 0,5% de triton X-100 pendant 30 minutes.
L’activité des peroxydases endogènes est bloquée avec une solution d’H2O2 à 3% dans du
PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Après rinçages, les cellules sont incubées
pendant 1 heure à 37°C en présence de 0,25 U.µl −1 d’enzyme Terminal Transferase
(Boerhinger, Allemagne) et de 6 μM de dUTP biotinylé (Boehringer) dans un tampon
contenant 30 mM de Tris HCl, 140 mM de Cacodylate de sodium et 1 mM de CoCl2. La
réaction enzymatique est arrêtée par l’incubation des cellules dans du tampon contenant 300
mM de NaCl et 30 mM de Citrate de sodium pendant 15 minutes à température ambiante.
Après plusieurs rinçages dans du PBS, les dUTPs biotinylés sont détectés par le complexe
Avidine-Biotine, l’activité peroxydase est révélée et les lamelles montées comme
précédemment décrit.
2.2.7 Mesure de l’effet des PVKDs sur la différenciation cellulaire
L’étude de l’effet des PVKDs sur la différenciation des CSN s’est faite par traitement
des cellules pendant 5 jours dans du SFM supplémenté ou non de 1 µg.ml -1 de S-warfarine.
Cet effet a été évalué par l’immunomarquage d’antigènes spécifiques de neurones, de cellules
gliales et d’oligodendrocytes comme décrit dans la partie 2.1.2 de cette partie expérimentale.
2. 3 Détermination du rôle des PVKDs dans la SVZ in vivo
2.3.1 Injection intracérébroventriculaire de warfarine chez la souris
Afin d’étudier in vivo l’effet de la suppression de la sécrétion des PVKDs sur la
prolifération des cellules de la SVZ, 1 μl de warfarine (100 µg) a été injecté dans les
ventricules latéraux du cerveau de souris adultes. Une injection de 1 µl de NaCl 9‰ a été
réalisée comme contrôle.
Pour cela, des souris âgées de 3 à 4 mois sont anesthésiées avec de l’avertine (100
μl.g −1 ) puis placées dans un appareil stéréotaxique. Les injections sont réalisées dans le
ventricule gauche à l’aide d’une seringue Hamilton. La seringue a été introduite aux
coordonnées suivantes par rapport au Bregma : antérieur 0,76 mm ; latéral 0,6 mm ;
profondeur 2,18 mm. 68 heures après l’injection, du BrdU (50 μg.mg −1 ) est administré par
voie intra-péritonéale. Les animaux sont sacrifiés 4 heures après cette injection puis perfusés
avec une solution de PFA à 4%. Les cerveaux sont extraits des boîtes crâniennes et postfixés
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