Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.2 Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro
2.2.5 Mesure de l’effet des PVKDs sur la prolifération des cellules par
incorporation de BrdU
La prolifération des cellules de la SVZ a été évaluée par mesure de l’incorporation de
BrdU, un analogue de la thymidine utilisé pour marquer les cellules en division. Lorsqu’il est
ajouté dans les cultures ou administré à des animaux, le BrdU s’intègre dans l’ADN des
cellules en division lors de la phase S du cycle cellulaire. Afin d’évaluer l’influence de la Swarfarine
sur la prolifération des CSN, les cellules de rats nouveau-nés obtenues après 5 jours
de culture dans du SFM contenant 20 ng.ml −1 d’EGF sont placées en présence de S-warfarine
pendant 24 heures. Le BrdU (10 μM, Sigma) est ajouté pendant les 4 dernières heures de
culture. Les cultures sont fixées dans du PFA 4%, rincées avec du PBS puis perméabilisées
avec une solution de triton X-100 à 0,5 % pendant 30 minutes. L’ADN est dénaturé afin de
permettre le démasquage du BrdU par une incubation pendant 3 minutes en présence de 0,125
mg.ml −1 de pepsine dans une solution d’HCl à 0,1N, puis par deux incubations dans du HCl
0,1N pendant 20 minutes à 4°C suivie de HCl 2N pendant 1 heure à 40°C. L’acidité est
neutralisée par une incubation pendant 10 minutes à température ambiante dans du tampon
borax (Na2B4O7/10H2O 0,1 M ; H3BO3 0,1 M, pH 8,4). Le BrdU est ensuite révélé par
immunocytochimie. Pour cela, les cellules sont préincubées pendant une heure dans un
tampon de blocage composé de 1% BSA et 0,1 % triton X-100 puis placées en présence de 5
μg.ml −1 d’anticorps monoclonaux rat anti-BrdU (Harlan Sera Lab, Royaume-Uni) durant une
nuit à 4°C. Après rinçage, les cellules sont incubées pendant 2 heures à température ambiante
en présence de 7 μg.ml −1 d’anticorps biotinylés de lapin anti-rat (Vector). Puis, les
péroxydases endogènes sont bloquées avant la révélation de l’activité peroxydase exogène et
le montage des lamelles sont montées comme précédemment décrit. Le comptage des cellules
est réalisé sous microscope en utilisant le logiciel Neurolucida. La prolifération est exprimée
en pourcentage de cellules immunomarquées au BrdU par rapport au nombre total de cellules.
2.2.6 Mesure de l’effet des PVKDs sur l’apoptose par marquage TUNEL
Afin d’évaluer l’effet des PVKDs sur la mort cellulaire, nous avons procédé à une
détection des cellules en apoptose. Lors de l’apoptose, l’ADN est dégradé en fragments qu’il
est possible de détecter à l’aide de la technique TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End
Labelling). Pour cela, les cellules sont traitées avec 1 µg.ml -1 de S-warfarine pendant 24
heures. A l’issue du traitement, les cellules sont fixées pendant 1 heure dans du PFA 4% puis
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