Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.2 Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro
couche supérieure d’hexane est ôtée et évaporée. Les résidus sont resuspendus dans l’éluant et
injectés sur une colonne analytique HPLC en phase inverse Kromasil C8 (5 μm, 120 Å, 4,6 x
250 mm, DIONEX). Une élution isocratique est effectuée par le passage d’un mélange
méthanol/ eau (99,5%/ 0,5%) à la vitesse de 1 ml.min -1 . L’élution est suivie par la mesure de
l’absorbance à 246 nm.
2.2.4 Mesure de l’effet des PVKDs sur la croissance et l’autorenouvellement des
cultures de SVZ
Pour analyser l’influence des PVKDs sur le nombre de neurosphères et sur la
croissance des cultures de SVZ, les cellules sont maintenues en culture dans du SFM seul
(contrôle) ou supplémenté en S-warfarine. A l’issue des traitements, les milieux et les
neurosphères sont collectés. Les cellules sont dissociées mécaniquement et leur nombre est
compté après exclusion à l’aide d’un colorant vital, le bleu Trypan.
La warfarine a également été testée pour son implication dans l’autorenouvellement
des cellules souches de la SVZ. Dans les conditions de cultures réalisées, seules les cellules
aux propriétés de souches sont capables de générer des neurosphères in vitro et chaque
neurosphère obtenue est issue d’une cellule de type souche (Chiasson et al., 1999; Coles-
Takabe et al., 2008; Morshead et al., 2003; Weiss et al., 1996). Pour réaliser ce test qui permet
d’évaluer l’effet d’un traitement sur la population de cellules souches, les cellules de la SVZ
sont mises en culture à raison de 5000 cellules par puits (Coles-Takabe et al., 2008) pendant 5
jours dans du SFM additionné de 20 ng.ml −1 d’EGF supplémenté ou non avec 1 µg.ml -1 de S-
warfarine. Après une semaine, les neurosphères primaires sont comptées. Elles contiennent
des cellules souches et progénitrices. Les cellules souches contenues dans les neurosphères
primaires pourront générer des neurosphères secondaires lorsqu’elles seront placées en
présence d’EGF. Pour cela, les milieux sont collectés et centrifugés et les culots cellulaires
sont resuspendus dans 500 μl de milieu de culture et les cellules sont dissociées
mécaniquement. Les cellules sont colorées au bleu Trypan et comptées sur cellule de
Malassez puis réensemencées dans du SFM supplémenté de 20 ng.ml −1 d’EGF à la densité de
5000 cellules par puits. Après 5 jours, les sphères secondaires se sont développées et leur
nombre est compté, ce qui permet d’évaluer le nombre de cellules de type souches qui étaient
présentes dans les neurosphères primaires.
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