Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.2 Détermination de l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ in vitro
traitées. Chacun des traitements a été réalisé en quadruplicat et l’ensemble des expériences a
été répété 3 à 5 fois.
L’étude de l’effet des PVKDs sur la croissance des cultures de SVZ a été réalisée
par traitement des cellules pendant 5 jours avec :
- de la warfarine R+S (de 0 à 500 µg.ml -1 , Sigma), de la S-Warfarine (0 à 10 µg.ml -1 , Sigma)
et /ou de la vitamine K1 (10 µg.ml -1 , Roche) dans du SFM.
- des milieux conditionnés, provenant de cellules cultivées 5 jours dans du milieu SFM
complémenté ou non de vitamine K1 ou de warfarine et dont la préparation est décrite cidessus.
Le facteur de dilution de ces milieux conditionnés tient compte de son taux de
concentration ainsi que du nombre de cellules ayant conditionné ce milieu de culture.
- de la protéine S humaine exogène à une concentration finale de 140 nM (Calbiochem).
- de la protéine Gas6 de souris purifiée au laboratoire (se reporter à la partie 2.5.1) diluée au
final au 1/200.
2.2.3 Vérification de l’élimination de la vitamine K et de la warfarine des
milieux conditionnés par HPLC
Un échantillon de chaque milieu conditionné est prélevé avant et après concentration.
Pour mesurer l’éfficacité de l’élimination de la warfarine, les échantillons sont injectés
directement sur une colonne analytique HPLC en phase inverse Kromasil C8 (5 μm, 100 Å,
4.6 x 250 mm, AIT). L’élution est suivie par la mesure de l’absorbance à 305 nm. La
séparation est effectuée en utilisant un système de solvant eau/acétonitrile/acide
trifluoroacétique 0,1% (vol/vol). Après un lavage de 5 minutes avec de l’eau, l’élution est
achevée par le passage d’un gradient linéaire d’acétonitrile de 0 à 100% à une vitesse de 0,8
ml.min -1 pendant 20 minutes, suivi par un lavage d’acétonitrile 100% pendant 15 minutes.
Pour mesurer l’éfficacité de l’élimination de la vitamine K1, une extraction liquideliquide
est réalisée avant la séparation sur HPLC (Elmadfa, 1996). Pour cela, 10 ml de
dichlorométhane-méthanol (2:1 v/v) sont ajoutés à 15 ml de milieu conditionné. Le tout est
vortexé vigoureusement pendant 1 minute puis centrifugé 5 minutes à 4000 g. La couche de
dichlorométhane inférieure est collectée. 10 ml du solvant d’extraction sont à nouveau ajoutés
à la phase supérieure aqueuse, l’ensemble est à nouveau vortexé et centrifugé. La nouvelle
couche de dichlorométhane est ajoutée à la première. Après évaporation de la fraction de
dichlorométhane, les résidus sont dissous dans 5 ml d’hexane. Un volume équivalent de
méthanol /eau (9:1 v/v) est ajouté, les échantillons sont vortexés avant centrifugation. La
57