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2.1 Culture des CSN issues de la SVZ et caractérisation immunocytologique Milieux Compositions des milieux et références Milieu de dissection Milieu de culture des cellules de SVZ chez le rongeur nouveau-né (SFM) Milieu de culture des cellules de SVZ chez le rongeur adulte Tableau IV : Composition des milieux de culture. 2.1.2 Caractérisation immunocytologique Hank’s sans Ca 2+ ni Mg 2+ (Gibco) additionné de HEPES 15 mM (Gibco), pénicilline 100 U.ml -1 et streptomycine 100 µg.ml -1 (Gibco) et D-Glucose 25 mM (Sigma) MEM alpha (Gibco) additionné de D-Glucose 25 mM, Pyruvate de sodium 1 mM (Sigma), HEPES 15 mM, pénicilline 100 U.ml -1 et streptomycine 100 µg.ml -1 (Gibco), B27 1% (Gibco) Neurobasal (Gibco) complété avec du B27 1%, de la glutamine 200 µM (Sigma), pénicilline 100 U.ml -1 et streptomycine 100 µg.ml -1 Les cultures de cellules de la SVZ sont constituées de différents types cellulaires à savoir des cellules souches, des cellules progénitrices, des neuroblastes et des neurones. Ces cellules peuvent être identifiées par immunomarquage de marqueurs spécifiques (Tableau V): - les cellules de type souche expriment la nestine, protéine des filaments intermédiaires et LeX/SSEA1, un carbohydrate membranaire; - les neurones matures expriment la MAP-2 et la βIII-tubuline, des protéines du cytosquelette. La MAP-2 est associée aux microtubules et la βIII-tubuline est présente dans les microtubules de ces neurones. - les astrocytes expriment la GFAP (glial fibrillary acidic protein), une protéine des filaments intermédiaires du cytosquelette; - les oligodendrocytes produisent une protéine membranaire spécifique, O4. Pour les immunomarquages, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans du PBS (Phosphate-buffered saline, pH 7,4) pendant 1 heure à 4°C. Après 3 rinçages dans du tampon PBS, les cellules sont perméabilisées avec une solution de triton X- 100 à 0,5% dans du PBS pendant 30 minutes. Après une incubation d’une heure dans une solution de blocage constituée de 1% BSA et 0,1% triton X-100 dans du PBS, les cellules sont placées en présence des anticorps primaires dilués dans du PBS pendant une nuit à 4°C. Les dilutions utilisées pour chaque anticorps primaire sont répertoriées dans le tableau V. Pour 54
2.1 Culture des CSN issues de la SVZ et caractérisation immunocytologique l’étude par microscopie confocale, les cellules sont ensuite rincées plusieurs fois avec du PBS puis placées en présence des anticorps secondaires adéquats couplés à un fluorochrome. Les dilutions d’anticorps secondaires sont répertoriées dans le tableau V. Les noyaux des cellules sont colorés à l’aide d’intercalants de l’ADN, le TOPRO-3 (1/1000) ou le DAPI (1/2000). Après rinçages les lamelles sont montées dans un milieu de montage aqueux (Mowiol). Antigène recherché Nestine GFAP βIII-tubuline O4 MAP-2 Nature de l’antigène recherché Protéine du cytosquelette exprimée dans les filaments intermédiaires des cellules indifférenciées (Lendahl et al., 1990) Protéine des filaments intermédiaires du cytosquelette exprimée par les astrocytes (Abd-el-Basset et al., 1992) Protéine des microtubules du cytosquelette des neurones immatures (Handford et al., 1990) Protéine exprimée à la surface des progéniteurs des oligodendrocytes (Kuhlmann- Krieg et al., 1988) Protéines associées aux microtubules des neurones matures (Johnson and Jope, 1992) Tableau V: Antigènes recherchés et anticorps utilisés pour la caractérisation immunocytochimique des cultures de SVZ. 55 Anticorps primaires, fournisseur et dilution Souris monoclonal (Chemicon), 1/1000 Lapin polyclonal (Dako),1/1000 Souris monoclonal (Chemicon), 1/1000 Souris monoclonal (Sigma), 1/500 Souris monoclonal, (R&D), 1/1000 Souris monoclonal, (Sigma), 1/300 Anticorps secondaires, fournisseur et dilution Chèvre anti-souris Alexa Fluor 568 (Molecular probes), 1/200 Chèvre anti-lapin Alexa Fluor 568 (Molecular probes), 1/200 ou Chèvre anti-souris biotinylé (Calbiochem) 1/200 Chèvre anti-souris Alexa Fluor 568 (Molecular probes), 1/200 ou Chèvre anti-souris biotinylé (Vector), 1/200 Chèvre anti-souris biotinylé (Vector), 1/200 Chèvre anti-souris Alexa Fluor 568 (Molecular probes), 1/200
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