Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.1 Culture des CSN issues de la SVZ et caractérisation immunocytologique
Milieux Compositions des milieux et références
Milieu de dissection
Milieu de culture des cellules de SVZ chez le rongeur
nouveau-né (SFM)
Milieu de culture des cellules de SVZ chez le rongeur
adulte
Tableau IV : Composition des milieux de culture.
2.1.2 Caractérisation immunocytologique
Hank’s sans Ca 2+ ni Mg 2+ (Gibco) additionné de
HEPES 15 mM (Gibco), pénicilline 100 U.ml -1 et
streptomycine 100 µg.ml -1 (Gibco) et D-Glucose 25
mM (Sigma)
MEM alpha (Gibco) additionné de D-Glucose 25 mM,
Pyruvate de sodium 1 mM (Sigma), HEPES 15 mM,
pénicilline 100 U.ml -1 et streptomycine 100 µg.ml -1
(Gibco), B27 1% (Gibco)
Neurobasal (Gibco) complété avec du B27 1%, de la
glutamine 200 µM (Sigma), pénicilline 100 U.ml -1 et
streptomycine 100 µg.ml -1
Les cultures de cellules de la SVZ sont constituées de différents types cellulaires à
savoir des cellules souches, des cellules progénitrices, des neuroblastes et des neurones. Ces
cellules peuvent être identifiées par immunomarquage de marqueurs spécifiques (Tableau V):
- les cellules de type souche expriment la nestine, protéine des filaments intermédiaires et
LeX/SSEA1, un carbohydrate membranaire;
- les neurones matures expriment la MAP-2 et la βIII-tubuline, des protéines du cytosquelette.
La MAP-2 est associée aux microtubules et la βIII-tubuline est présente dans les microtubules
de ces neurones.
- les astrocytes expriment la GFAP (glial fibrillary acidic protein), une protéine des filaments
intermédiaires du cytosquelette;
- les oligodendrocytes produisent une protéine membranaire spécifique, O4.
Pour les immunomarquages, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde (PFA)
à 4% dans du PBS (Phosphate-buffered saline, pH 7,4) pendant 1 heure à 4°C. Après 3
rinçages dans du tampon PBS, les cellules sont perméabilisées avec une solution de triton X-
100 à 0,5% dans du PBS pendant 30 minutes. Après une incubation d’une heure dans une
solution de blocage constituée de 1% BSA et 0,1% triton X-100 dans du PBS, les cellules sont
placées en présence des anticorps primaires dilués dans du PBS pendant une nuit à 4°C. Les
dilutions utilisées pour chaque anticorps primaire sont répertoriées dans le tableau V. Pour
54