Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

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3.4 Capacité des cellules souches neurales à phagocyter : implication de la protéine S Figure 39 : La protéine S favorise la phagocytose de billes de latex par les cultures de SVZ in vitro. Marquage du cytosquelette d’actine (en rouge) et des billes de latex (en vert) dans les cellules de SVZ de rats nouveau-nés (a) dans des conditions contrôles, (b) en présence de la protéine S et (c) en présence de la protéine Gas6 visualisées dans les plans XY, XZ et ZY. Les billes de latex phagocytées se trouvent à l’intersection des lignes verticales et horizontales. Les noyaux sont révélés par du TOPRO-3 (en bleu). Barre d’échelle : 20 µm. L’observation en microscopie confocale nous permet de visualiser l’internalisation de billes de latex fluorescentes mais ne nous permet pas de la quantifier. Nous avons donc décidé de quantifier ce processus par cytométrie en flux. La limite de cette technique réside dans le fait que l’appareil ne différencie pas la fluorescence accrochée aux cellules de celle y étant internalisée. Afin de remédier à ce problème nous avons eu recours à une méthode d’extinction de la fluorescence en utilisant du bleu trypan. Ce colorant, exclu des cellules vivantes, va éteindre la fluorescence avec laquelle il est en contact, c'est-à-dire la fluorescence présente à l’extérieur de la cellule (Lehmann et al., 2000). Seule la fluorescence « internalisée » due à la phagocytose des billes sera alors détectée. Afin de vérifier la capacité des cellules de SVZ à phagocyter, les cellules sont incubées 1 heure avec des billes de latex couplées au FITC puis analysées par cytométrie en flux. Dans des conditions basales, cette technique nous a permis de voir que les cultures de SVZ sont très hétérogènes en termes de taille et de granularité (Figure 40a, population P1). Il semble néanmoins qu’elles soient composées de deux sous-populations majeures, à savoir, une population P2 de faible taille et granularité (en vert) et d’une population P3 (en bleu) de faible granularité mais de taille plus importante (Figure 40a). 108
3.4 Capacité des cellules souches neurales à phagocyter : implication de la protéine S Figure 40 : Analyse par cytométrie en flux de la phagocytose des billes de latex par des cellules de la SVZ. (a) Analyse par cytométrie en flux de la taille (FSC pour Forward scatter) et de la granularité (SSC pour Side scatter) des cellules de la SVZ en conditions basales. Analyse par cytométrie en flux des CSN (b-c) en absence ou (d-g) en présence de billes de latex. (b, d, f) Représentation graphique de la quantité de cellules en fonction de la quantité de fluorescence phagocytée. Les cellules ayant incorporées de la fluorescence se trouvent dans la fenêtre P4. (c, e, g) Représentation de la quantité de fluorescence phagocytée (fenêtre Q1 et Q2) ou non (fenêtre Q3 et Q4) en fonction de la taille des cellules. (d-e) Analyse par cytométrie en flux de la capacité des CSN à phagocyter dans des conditions contrôles ou (f-g) en présence de la protéine S. (h) Pourcentage de cellules de la SVZ ayant phagocyté en absence ou en présence de la protéine S. n=2 ; **P
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THÈSE Pour l’obtention du Grade
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Mes remerciements s’adressent bie
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AVANT-PROPOS La coagulation du sang
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RCS : Royal College of Surgeons RMS
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Gène invalidé Système nerveux Sy
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1.4 Modèles utilisés pour l’ét
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