5.2- Antibiogramme standard

L’ANTIBIOGRAMME STANDARDLa CMI peut aussi être déterminée par une méthode par diffusion sur gélose grâce à un antibiogrammestandard. Mais son principal avantage est de permettre la détermination directe de la sensibilité ou de larésistance d’une souche à un antibiotique.1. PrincipeL’antibiogramme par diffusion permet de déterminer la sensibilité des bactéries à croissance rapide vis-àvisd’un panel d’antibiotiques.Des disques imprégnés d’antibiotiques sont déposés à la surface d’un milieu de culture standardisé(milieu de Mueller-Hinton) préalablement ensemencé avec une dilution calibrée de la bactérie à tester.L’arrêt de la croissance à distance du disque se produit en présence de la concentration minimaleinhibitrice de l’antibiotique.2. Technique standardisée2.1. Matériels2.1.1. Milieu Mueller – HintonMilieu standardisé de 4 mm d’épaisseur.Il peut être additionné de 5 % de sang de cheval ou de mouton pour les bactéries plus exigeantes.2.1.2. Les disques d’antibiotiquesIls doivent être conservés à 2 - 8 °C avec un déshydratant.Le diamètre des disques est de 6,35 mm.2.1.3. Les distributeurs5 à 6 disques pour les boîtes de Pétri rondes de 90 mm de diamètre.12 à 16 disques pour les boîtes de Pétri carrées de 120 mm de côté.Ils peuvent être autoclavées (120 °C pendant 15 minutes) en cas de contamination.2.2. InoculumL’inoculum est calibré de façon à obtenir après incubation des colonies juste confluentes.2.2.1. Réalisation d’une suspension d’opacité équivalente à 0,5 Mac FarlandPrélever sur une gélose nutritive un nombre de colonies suffisant afin d’obtenir 5 mL desuspension en eau physiologique d’opacité équivalente à celle de l’étalon 0,5 Mac Farland c’est-àdireà environ 10 8 bactéries par mL.2.2.2. Ajustement de l’inoculum afin d’obtenir un tapis de colonies jointivesRéaliser une dilution au 1/10 de la suspension précédente : on obtient une suspension ajustéeà environ 10 7 bactéries par mL.Pour cela, introduire 1 mL (soit 30 gouttes de pipette Pasteur de 33 µL) de la suspensiond’opacité équivalente à 0,5 Mac Farland dans un tube à essai contenant 9 mL d’eau physiologique.2.3. Ensemencement par écouvillonnagePlonger l’écouvillon stérile dans la suspension ajustée à environ 10 7 bactéries par mL.Le sortir du tube en l’essorant doucement sur les parois.Ensemencer la boîte en frottant l’écouvillon sur toute la surface de la gélose et en tournant la boîte 3fois de 60°.C. LARCHER Antibiogramme standard – Page 1 / 4 –

2.4. Application des disques et incubationAppliquer les disques à l’aide d’un distributeur ou d’une pince stérile (suivre le plan de dépôts cidessous).Figure 1 : schéma d’applications des disques d’antibiotiquesdans le cas de boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre2.5. IncubationIncuber 24 heures à 37 °C.Incuber en anaérobiose si nécessaire.NB : dans tous les cas, le jour du bac, suivre le protocole fourni.Réaliser les différentes dilutions en vous aidant du tableau suivant :Suspension en eau physiologique d’opacité Mac Farland0,5 ou 1Dilution Volume de suspension Volume d’eau physiologique1/10 30 gouttes (soit 1 mL) 9 mL1/100 3 gouttes (soit 0,1 mL) 10 mL1/1000 1 anse de 1 µL 10 mLC. LARCHER Antibiogramme standard – Page 2 / 4 –

3. Lecture et interprétation3.1. Droite de concordanced : diamètre du disque d’antibiotique (6,35 mm)∅ : diamètre d’inhibition mesuré∅dTapis bactériende colonies juste confluentesGélose Mueller-Hintonde 4 mm d’épaisseurDisque d’antibiotiqueFigure 2 : schéma en coupe d’une gélose Mueller-Hintonutilisée pour un antibiogramme standardL’antibiotique diffuse en profondeur puis latéralement à partir du disque pré-imprégné d’une masseconnue d’antibiotique (appelée charge du disque) en créant un gradient de concentration standardisé.Il existe pour chaque antibiotique une relation linéaire entre le logarithme de la concentration enantibiotique et le diamètre du cercle concentrique au disque d’antibiotique appelée droite de concordance(figure 3).On peut placer sur cette droite de concordance les concentrations critiques en antibiotique et endéduire les diamètres de diffusion correspondants (figure 3).Logarithme de la concentrationen antibiotiqueCCsupCCinfd(CCsup)D(CCinf)Diamètre du cercle concentrique audisque d’antibiotiqueFigure 3 : droite de concordance entre logarithme de la concentration en antibiotiqueet diamètre de diffusion de l’antibiotiquePlus on s’éloigne du disque d’antibiotique plus la concentration en antibiotique diminue.La CCinf est plus petite que la CCsup donc D(CCinf) est plus grand que d(CCsup).C. LARCHER Antibiogramme standard – Page 3 / 4 –

3.2. Lecture et interprétationL’arrêt de la croissance à distance du disque se produit en présence de la concentration minimaleinhibitrice de l’antibiotique.Le diamètre de la zone d’inhibition correspond donc à la CMI de l’antibiotique.Il faudrait comparer la CMI aux concentrations critiques inférieure et supérieure afin de déterminerles caractères sensible, intermédiaire ou résistant de la bactérie vis-à-vis de cet antibiotique (voir TP 10sur la détermination de la sensibilité et de la résistance à partir de la CMI).Grâce à la droite de concordance, déterminer la sensibilité et la résistance revient pour unantibiogramme réalisé dans les conditions standards à comparer le diamètre d’inhibition mesuré(∅ mesuré) et les diamètres critiques d(CCsup) et D(CCinf).3.2.1. Mesure du diamètre d’inhibitionMesurer le diamètre de la zone d’inhibition (∅ mesuré) et le comparer aux diamètres desconcentrations critiques inférieure et supérieure (d(CCsup) et D(CCinf)) et afin de déterminer lasensibilité et la résistance comme indiqué dans le tableau ci-dessous.∅ mesuré ≥ D(CCinf)∅ mesuré < d(CCsup)d(CCsup) ≤ ∅ mesuré < D(CCinf)SensibleRésistantIntermédiaireTableau 1 : interprétation de la sensibilité et de la résistance d’une souche à un antibiotique3.2.2. Utilisation de l’abaque PasteurL’institut Pasteur devenu BioRad fourni des abaques de lecture de la sensibilité et de larésistance d’une souche à différents antibiotiques. Ces abaques sont une représentation de la droitede concordance entre concentration et diamètre.Tableau 2 : exemple de lecture d’antibiogramme à l’aide d’un abaque3.3. Rédaction des résultatsLe compte-rendu des résultats d’un antibiogramme standard sera réalisé en reportant les diamètresd’inhibition mesurés pour chaque antibiotique et les diamètres critiques dans un tableau. Une colonnepermettra d’interpréter la résistance ou la sensibilité de la souche pour chaque antibiotique.AntibiotiqueSigle∅ mesuré(mm)d(CCsup)(mm)D(CCinf)(mm)InterprétationS, I ou RAcide fusidique FA 26 15 22 SAmoxicilline AMX 16 14 21 IGentamicine GM 12 16 18 RTableau 3 : exemple de tableau de rendu des résultats d’un antibiogramme standardC. LARCHER Antibiogramme standard – Page 4 / 4 –