du développement folliculaire ovarien précoce chez la brebis - GeT

Identification de "Biomarqueurs" dudéveloppement folliculaire ovarien précoce chez labrebisAgnès Bonnetjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

I. Contexte scientifiqueLa folliculogenèse ovarienneFolliculogenèse tardiveFolliculogenèse précoceJamieson S , Fuller P J Endocrine Reviews 2012;33:109-144journées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

I. Contexte scientifiqueQuels sont les mécanismes qui régulent lafolliculogenèse précoce- Peu de données- Des différences entre espècesOvocyteCellules de Granulosa40µm 75µm 130 µm200 µmReservefolliculairefolliculeprimordialfolliculeprimairefolliculesecondaireFollicule à petitantrumjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

Objectifs- Caractériser les répertoires d’expression et les mécanismesimpliqués dans la folliculogenèse précoce chez une espècemono ovulante : la brebis.- Identifier des transcrits caractéristiques(« biomarqueurs » de compartiments ou de stades)journées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

II. MéthodesIsolement des différents stades etcompartimentsDouble amplification des ARNsMise en évidence del’expression géniqueMicrodissection à Capture Laser (100x) :a) selection des cellules de granulosab) Cellules de granulosa prélevéesc) Follicule après la captureValidations :PCR quantitativeVue globale :RNA-seqjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

III. Résultats LCM1- Capture des échantillons et amplification des ARN32 échantillons d’ARN amplifiés4 stades folliculairesPDPMSECSA2 compartimentsOocyte/cellules granulosa4 repliquesOG1 2 3 4 1 2 3 4OG1 2 3 4 1 2 3 4OG1 2 3 4 1 2 3 4OG1 2 3 4 1 2 3 4+ 3 échantillons muti-tissus (12 tissus différents)Validation de leur spécificité- QPCR- Puce Affymetrix bovinejournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats RNA-seq1- Analyse bio-informatique(SIGENAE: Cédric Cabau)journées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NM.G. Grabherr et al , 2011A G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats RNA-seqAnalyse bio informatique:Stratégie d’annotationParticularités du jeu de données :-ARN amplifiés distribution des lectures en 3’ destranscrits-Génome ovin peu annoté et 3’ des transcrits mal définiATGTAAARNmLi et al, 2010journées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats RNA-seqAnalyse bio informatique:Couverture des transcrits: ZP4Assemblage sur génomiqueGénome bovin5’ 3’Transcrit bovinFragments génomiques4/1000(8% dans le cerveauhumain, Ameur 2011)Nombre de lecturesFragment le plus représentatif del’expression du gènejournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats RNA-seqAnalyse bio informatique:Bilan assemblage36M de séquences pairées / échantillons (48M /MT)Taille médiane des fragments obtenus: 440pbPlusieurs fragments/gènes (8 en moyenne)stratégie génomestratégie assemblage de novonombre de contigs/fragments >20 lectures381 600 252 630nombre de gènes identifiés 18015 16310% de gènes en commun 80,5% 89%% de lectures annotées 42.1 33.71- Stratégie génome:Comparer des conditionsPlus de gènes identifiésPlus de lectures annotées2- Stratégie assemblage de novo :Rechercher les transcrits alternatifsMoins de contigsIdentification de gènes sans séquence deréférencejournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats RNA-seq2. Analyse exploratoiredes niveaux d’expression conservésjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats RNA-seqNiveaux d’expression des gènes contrôleR > 0.95PDO PMO SecO SAOR~0.8PDG PMG SecG SAGPD: primordialPM: primairejournées retours d'expériences SEC secondaire GeT2 juillet 2012SA: petit antrumA G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats RNA-seq2. Analyse exploratoireUne bonne classification des échantillons1 er axe explique 52% de la variabilité d’expression et sépare les compartimentsjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats RNA-seq2. Analyse exploratoireUne bonne classification des échantillonsPDPMSECSA2eme axe explique 15% de la variabilité d’expression et sépare les4 stades de développementjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats2. Analyse exploratoireUn répertoire global de transcrits15350 gènes exprimés : 62 % des gènes connus bovins26.5 % des gènes connus humainsOocyteGranulosa150001400013000120001100010000900080007000600014 270 gènesexprimés dansl’oocyte de souris14500 gènesjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats2. Analyse exploratoireUn transcriptome complexe% de lecturesutilisées100908070605040302010016% des lecturestotales4.6% des lecturestotales10 100 500 1000 2500 5000 7500 10000 16000+ -Nombre de gène /expression décroissanteMuscle et foie 20-40% Testicule cerveau :5 à 10%Ramsköld et al,2009PDOPDGMTjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats3. Analyses statistiquesDes différences d’expression entre types cellulairesDifférentiel d’expression global (FDR 0.5%, FC>2)10009008007006005004003002001000SCN5AEffet compartiment : 25 % (3891 gènes)Effet stade de développement : 6 % (911 gènes)Effets AdditifsEffets d’interactionPD PM SEC SAgranulosaoocyte5000450040003500300025002000150010005000KCNN3PD PM SEC SAoocytegranulosajournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats3. Analyses statistiquesUne dynamique d’expression différente entre lescompartimentsNombre de gènesdifférentiels45040035030025020015010050oocytegranulosaFDR global

30002500200015001000500BMP15IV. Résultats4- Validations• 4 oocyte-specific genes (MATER, VASA, GDF9, BMP15)• 4 granulosa-specific genes (GATA4, KITLG, AMH, FST)FDR

IV. Résultats5. Annotation fonctionnelleUne pertinence des fonctionsChangement de forme des cellulesOvocyteMultiplication des cellulesAugmentation du volume de l’ovocyteBlocage du cycle cellulaireRégulation de la transcriptionCellulesgranulosaFormation et morphologie desgamètesInfertilitéMise en place de la stéroidogenèseCancer de l’ovaire et cellules degranulosajournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. Résultats5. Annotation fonctionnelleIdentification de mécanismes spécifiquesDans l’oocyte:- régulation du cycle cellulaire (duplication des chromosomes et passage G2/M)- Voie de signalisation GABADans les cellules de la granulosa:- régulation du cycle cellulaire (passage G1/S)- voies de signalisation: TGFB, BMP ….journées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

Des dialogues moléculaires entre compartimentsLe système IGFIV. Résultats5. Annotation fonctionnelleIGFRovocytegranulosaIGF et IGFBPjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. RésultatsUne expression spatio-temporelleFGF1KitlgBMP3connexin43FOXL2FSTFSHRLHCGRAMHAMHR2FGFRL1…FGF16NOBOXBMP6BMP15GDF9FGF18MATERVASAWEE2folliculeprimordialfolliculeprimairefolliculesecondairefolliculeÀ petit antrumjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. RésultatsDes transcrits spécifiques de compartimentExpression enrichie (fold change 10-100)Cellules de Granulosa : 13 gènes différentiels/ 13 tissus (FST, Neurexin2,IMPG2,…)Oocytes: 146 gènes différentiels/ 13 tissus (BMP15,VASA,FGF18,WEE2, ZPBP…)O G OV MT1 MT2 MT3 H2O O G OV MT1 MT2 MT3 H2O700070000600060000500040003000DEFB112oocytegranulosa500004000030000BTG4oocytegranulosa2000200001000100000PD PM SEC SA0PD PM SEC SAjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

IV. RésultatsDes biomarqueurs du développement folliculaire?3 à 4 marqueurs par conditionjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A G R I C U L T U R EA L I M E N T A T I O NE N V I R O N N E M E N T

V. Conclusions1- Des répertoires d’expression ovocytaire et cellules de granulosa séparément aucours du développement : un transcriptome complexe.2- Des différences d’expression entre ovocyte et cellules de granulosa et unedynamique d’expression au cours du développement folliculaire précoce3- Des fonctions en adéquation avec le devenir des 2 types cellulaires.4- De nouvelles voies de signalisation et dialogues moléculaires au cours dudéveloppement folliculaire.4- Des « biomarqueurs » de compartiments et de stades de développementjournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T

RemerciementsTechnical collaborationINRA PICTGemC. Bevilacqua;P. MartinLCM experimentsREFOLLIS projectF. Benne; J. Sarry; Florent Woloszyn;G. Tosser-klopp;L. Bodin; B. Mandon-PepinTechnical supportGeT platformBiopuces platformImagerie platformRNA-seqBioFoll projectJ. Sarry, O. Bouchez;N. MarsaudFinancial supportANR/AIP BioressourcesBioinformatics andData analysisC. Cabau; M. SanCristobaljournées retours d'expériences GeT2 juillet 2012A L I M E N T A T I O NA G R I C U L T U R EE N V I R O N N E M E N T