Quantification de la stéatose hépatique chez la souris ... - Biogenouest

Quantification de la stéatose hépatique chez lasouris par spectroscopie RMN in vivo et analysed'images histologiquesBernard FROMENTY, INSERM U991Alain FAUTREL, Plate-forme H 2 P 2 , INSERM 991Pierre-Antoine ELIAT, Plate-forme PRISM, UMS BiositUniversité de Rennes 1

La stéatose hépatique Définition: accumulation de lipidesdans les hépatocytes , principalementsous forme de triglycérides. Causes: Obésité et diabète de type 2 +++Intoxication alcoolique ++Médicaments + Evolution: Bénigne à court terme, mais progressionen stéatohépatite et en cirrhose à long terme.

Evolution de la stéatose à long termeStéatose Stéatohépatite CirrhoseStéatosemacrovacuolaireInflammationHuile rougeTrichromeFibrose modérée (périportale)Fibrose extensive avecformation de nodule

Physiopathologie de la stéatohépatiteStéatoseStéatohépatite Stress oxydantDysfonction mitochondrialeInduction du CYP2E1 CytokinesPro-inflammatoires : TNFaPro-fibrosantes : TGFbStéatohépatite apparaissant dans le cadre de l’obésité et dudiabète de type 2 NASH (“nonalcoholic steatohepatitis”)

Traitements actuels de la stéatose et de la NASHliées à l’obésitéAméliorer l’hygiène de vie (régime hypocalorique etexercice physique régulier). Médicaments:Agents améliorant la stéatose :OrlistatMetformineFibratesAgents améliorant le stress oxydant et l’inflammation:Vitamine EAcide ursodésoxycholiquePentoxifylline

Pentoxifylline (PTX) Dérivé de la diméthylxanthine présentant une action“Anti-TNFa” (diminution de la production du TNFa par lesmonocytes et macrophages). Cependant, pas d’amélioration, voire même une aggravation,des lésions de NASH chez certains patients obèses. Une étudeexpérimentale dans un modèle murin de NASH suggère uneaggravation de la stéatose (Koppe et al., J Hepatol 2004). Le but de notre étude a été de déterminer les effets hépatiqueset métaboliques de la PTX dans un autre modèle murin de NASH.6

Modèles animaux utilisés dans notre étudeSouris wild-type(WT )Souris ob/ob(ob/ob)Obésité morbide Insulinorésistance Diabète de type 2 Stéatose massive et lésions modéréesde stéatohépatite (NASH “borderline”) Traitement 21j (eau de boisson) à la dose de 100 mg/kg/j

Quantification des lipides par spectroscopie parrésonnance magnétique (SRM): Plate-forme PRISMSouris wild-typeP.A. EliatF. NourySouris wild-typeImage (IRM)DéterminationVoxel au niveauhépatiqueEauLipidesSpectre localisé(SRM)Détermination durapport lipides/eau(LWR)EauLipidesppmppm

LWRQuantification des lipides par SRMPour ces investigations, une 1 ère mesure a été effectuée avant l’instauration dutraitement (D0) et la 2 ème mesure à la fin des 3 semaines.60§: Différence entre lesgroupes indiqués (p

Lipides (mg/g foie)Triglycérides (mg/g foie)Dosage lipides et triglycérides hépatiques partechnique biochimique conventionnelle2001751501251007550Lipides totaux*différent vs. WT (p

Conclusions de notre étude concernant les effetsde la PTX chez la souris ob/ob Absorption glucosevia GLUT2Pentoxifylline ChREBP HyperglycémiepostprandialeEffets hépatiques délétères de la PTX chezles souris ob/ob malgré ses propriétésanti-TNFa Lipogenèse de novoAggravation de lastéatose chez lessouris ob/obMassart et al., Br. J. Pharmacol. 2012

En Histopathologie :PerspectivesDétermination de la répartition de la taille des goutteletteslipidiques grâce à des logiciels d’analyse d’images (e.g. NISelement). En spectroscopie par résonnance magnétique (SRM):Mesure des différentes classes de lipides, et en particulieracides gras saturés, mono-insaturés et polyinsaturés(différences d’effets biologiques).Mesure de l’ATP par spectroscopie du phosphore 31 (reflet dela fonction mitochondriale qui peut être altérée au cours de lastéatose).

Plateforme d’histopathologieRennesGen2Bio 2012

- Alain Fautrel : IR INSERM- Pascale Bellaud : Tech. Univ.- Roselyne Viel : AJT. UnivAnimateurs Scientifiques- Bruno Turlin : MCU-PH-Marie-dominique Galibert : PU-PHGen2Bio 2012

Imprégnation en paraffineCongélation(isopentane/azote liquide)Inclusion en paraffineGen2Bio 2012

Tissue Micro ArraySpots de600 µmGen2Bio 2012

Microdissection par capture laserGen2Bio 2012

Coloration de routine (HES)Coloration spécifiquesIntestinGraine de colzafibrosePASGen2Bio 2012Elastine

Gen2Bio 2012

Immuno-histochimieBourse de Fabriciusde pouletReinColonImmuno-FluorescenceHybridation in situGen2Bio 2012

Analyse d’imagesColorationsImmuhistochimieGen2Bio 2012

Scanner de lamesGen2Bio 2012

Logiciel d’analyse d’images NIS elementsGen2Bio 2012

VALORISATIONhttp://histopathologie.univ-rennes1.frGen2Bio 2012

H 2 P 2Plateforme d’histopathologieUniversité de Rennes1 - Villejean2 avenue du Professeur Léon BernardBat. 6 – 1 er étagealain.fautrel @ univ-rennes1.fr02 23 23 47 95Gen2Bio 2012

PRISM - une offre dans 4 domaines d’expertise• IRM/SRM du petit animal etapplication clinique• Equipe Metriq• H. Saint Jalmes, PUPH• UMR Inserm LTSI,BioscansAniscans•Imagerie fonctionnelleappliquée à l’animal moyen•C.H Malbert, DR INRA•UR ADNC• RMN structurale etbiologique• Equipe SIM• A. Bondon, DR CNRS• UMR CNRS 6290 IGDRAgroscansBio-RMN• IRM-RMN en agronomie etagro-alimentaire• Equipe IRM-Food• F. Mariette, DR IRSTEA• UR TEREcoordinateur - francois.mariette@irstea.fr

Mutualisation verticaleUne Mutualisation ExpérimentaleIRM/SRMmédecinenucléaireRMNMutualisation longitudinale

Des développements méthodologiquesIRM/SRM•Méthodologie IRM•Capteurs RF•Mise au point de dispositifs•Développement de séquenceImagerieFonctionnelle•Construction d’atlas statistique•IRM in vivo, in vitro, histologie•Traitement d’imageRMN•Métrologie en lien avec la Diffusion•Étude d’interaction moléculaire•Diffusion et structure des milieux poreux

PRISM Bio-SCANs – IRM/SRM pré-cliniqueIRM 4,7TBioSpec® 47/40 (Bruker-BioSpin)Kit « rat »gradients 400mT/mAntenne « corps » 1H détectionen quadrature diamètre 72mmKit « souris »gradients 950mT/mAntenne « corps » 1Hdiamètre 35mm

PRISM Bio-SCANs – IRM/SRM pré-cliniqueIRM et SRM du petit animal in-vivo Imagerie anatomiqueIRM dynamique 3Dcorps entierchez la souris(INSERM U 991) Imagerie dynamique Spectroscopie localiséeGliomeδ = 8,55ppmpHe = 6,7ISUCA1h20minp.i.Quantification du ferhépatique chez la souris(INSERM U 991)Pondération en T 28 6 4 2 0 -2- pp4 mMesure du pHe in vivo chez le rat (CBM Orléans, PIAM Angers,INSERM U 646 Angers) et chez la souris (Irset Rennes)

Capteurs de surface 25 mm et 15 mmIRM anatomique32Oesophage lapin in vivo @ 1,5T1,5mm pixel 120µm x 120µm, 2 minEVE, UMR6552, Rennes 1M. Hausberger, I. George, H. CousillasCerveau d’étourneauépaisseur de coupe 1mmpixel 75µm x 75µm, 25 minLTSI, INSERM U642F. Wendling, B. Martin, C. Huneau, G. DieusetModèle de souris épileptiqueépaisseur de coupe 0.5 mm pixel75µm x 75µm, 16 min

IRM dynamique - évaluation thérapeutique33injection d’un agent de contrasteavantaprèsModèle de tumeur sous cutanéechez la sourisCourbes de rehaussement du signalExtraction deparamètresphysiologiques enrelation avec lavascularisationtumoraleModèle compartimentalCancéropole Grand Ouest : Orléans, Angers, RennesC.RIS Pharma : Projet IDEA - Prestations

Spectroscopie in vivo Quantification des lipides hépatiques par SRM in-vivo Étude préliminaire : validation du protocole Population de 16 souris mâles d’âges variables : 4 souris témoins de 5, 10 semaines 6 souris ob/ob de 5, 8, 10 semaines 6 souris db/db de 5, 8, 10 semainesProtocole de SRM in vivo : lobes hépatiques supérieurs droit et gaucheCoupes histologiques : prélèvement d’échantillons de foie après la SRM in vivo

Spectroscopie in vivo Bobine volumique en quadrature (diam. 72 mm) Acquisition de spectres 1 H localisés mono-voxel- Voxel de 3x3x3 mm 3- PRESS sans suppression du signal de l’eau lipides totaux- TR/TE = 2500/20 ms- 256 accumulations- T acq = 10 min Synchronisation respiratoire T acq ~ 12 min Shim : Δ½ ~ 50 HzEauLipides Calcul de la fraction en lipides (FL) à partir del’intégration des résonances de l’eau et des lipidestotaux.ppm

Spectroscopie in vivoExemples de résultats : SRM in-vivo et histologieEauSouris témoin5 semainesEauSRM localisée in vivoSouris db/db5 semainesEauSouris ob/ob5 semainesEauSouris ob/ob10 semainesFL = 0,007FL = 0,09FL = 0,30FL = 0,65LipidesLipidesLipidesLipidesFL = Fraction en LipidesppmppmppmppmCoupes histologiques – Coloration à l’Huile rougeSouris témoin Souris db/db (5 s) Souris ob/ob (5 s) Souris ob/ob (10 s)

FL (%)FL (%)Étude préliminaireSpectroscopie in vivoAnalyses statistiques des données de SRM et d’histologieSRM****Histologie****Test deMann-Whitney :* p < 0,05** p < 0,01SouristémoinsSourisob/obSourisdb/dbSourisobèsesSouristémoinsSourisob/obSourisdb/dbSourisobèsesTest de Spearman :SRM versus HistologieSRM vs Histologie Total Souris obèsesr 0,95 0,90p p < 10 -6 p < 0,02

PerspectivesDéveloppement de méthodes de SRM in-vivo permettant d’identifier et dequantifier chez la souris les différents types de lipides hépatiques (saturés, mono etpoly-insaturés).Validation de la méthode sur objets-testHuile de colza4,7 TΔ½ ~ 12 HzFoie souris4,7 TΔ½ ~ 40 Hz

ConclusionOptimisation d’une méthode de quantification des lipides hépatiques totaux par SRMin vivo chez la souris.EauLipidesppm