Barrou Greffe ilots DIU 2009-10 - ASSIM

Historique• 30 avant JC : première évocation• XI° siècle : Willis : "goût sucré des urines"• 1815 : Chevreuil met en évidence la glycosurie• 1869 : Langerhans décrit les îlots• 1889 : Découverte de la relation entre diabète etpancréas (Mering et Minkowski)• 1893 : première greffe d'îlots (Williams)

Historique (2)• 1922 : Découverte de l’insuline par Banting et Best• 1965 : découverte de la collagénase• 1966 : première greffe de pancréas vascularisé(Lillehei, Minneapolis)• 1967 : injection intra-ductale de la collagénase• 1970 : technique de pancréas segmentaire (Dubernard)• 1986 : essor de la transplantation de pancréasvascularisé

- le tissu exocrine représente 98% de la masse tissulairepancréatique alors que les îlots ne représentent que 2% de lamasse totale du pancréas- Le drainage des sécrétions exocrines reste la principalesource de complication des greffes de pancréas- Greffer un pancréas chez un patient diabétique revient doncà greffer 98% de tissu parasite pour seulement 2% de tissuattendu- geste assez lourdMais…

Comment obtenir les îlots ?- prélèvement pancréatique sur les sujets en état demort cérébrale- ablation de tous les vaisseaux, ganglions, etc...- distension pancréatique à l'aide de la collagénase- digestion enzymatique de la glande libérant îlots ettissu exocrine (20 à 30') : durée critique

Résultats de l'isolement :• degré de pureté - 70 à 80 % chez l'homme• volume : 3 à 5 ml• entre 200 000 et 500 000 îlots par pancréas• injectable sous forme d'une suspension cellulaireà l'aide d'une simple seringue• difficiles à reproduire

Est-ce que ça marche ?

Est-ce que ça dure ?

Quels sont les critères de réussite ?

Quels sont les critères de réussite ?

Quels sont les critères de réussite ?

Quels sont les critères de réussite ?

De mieux en mieux…

Année 2000 : un tournant…

Les raisons du succès d ’Edmonton

Expérience d’ Edmonton à distance• à 3 ans : 50 % d’insulino-indépendance• 4 patients ont 5 ans de recul :– 1 seul insulino-dépendant

Peut-on reproduire ces résultats ?• Immune Tolerance Network• 9 centres, 36 patients• Tous n'y arrivent pas :– 80 % d’insulino-indépendance dans les 3 centres les plus engagés(Edmonton, Minneapolis, Miami)– Entre 0 et 63 % dans les autres centres• Peut-on étendre ces résultats à d'autres types de patients ?– Pas sans risques– Nécessité d’arrêter les corticoides– Dégradation de fonction rénale

Registre Nord américain 1999-2006 : CITRAnalyse 2007 CITR

Îlots seuls vs îlots après reinAnalyse 2007 CITR

Nombre de greffonsAnalyse 2007 CITR

Procédure longueAnalyse 2007 CITR

Prévalence de l’insulino-indépendanceAmélioration après laseconde mais pasaprès la troisième…Analyse 2007 CITR

Evolution de la fonction du greffonAnalyse 2007 CITR

Persistance de la fonction du greffonC pep > 0,5 ng/mlAnalyse 2007 CITR

Besoins en insuline aprèstransplantation

Evolution de l’Hb GlyquéeAnalyse 2007 CITR

Fréquence des hypoglycémies sévèresAnalyse 2007 CITR

Insulino-indépendance : analyse multivariéeAnalyse 2007 CITR

Perte du greffon : analyse multivariéeEtanercept (Enbrel®) : protéine de fusion associant la fraction P75 du récepteur solubledu TNF-alpha avec un fragment Fc d'une IgG1Analyse 2007 CITR

Effets secondaires• 337 cas d’effets secondaires rapportés– 40,4 % mettant en jeu le pronostic vital– 46 % nécessitant une hospitalisation– 70 % surviennent durant la première année– 32 % secondaires à l’injection des îlots– 25 % secondaires à l’immunosuppression– 91 % résolution dans séquelles• Cancers : 10 patients– 4 spinocellulaires, 1 basocellulaire– 1 cystadénome mucineux ovarien (Dg à J1)– 1 cancer du sein métatatique (Dq à 22 mois)– 2 carcinomes papillaires de la thyroide– 1 nodule pulmonaire de nature indéterminée, suiviAnalyse 2007 CITR

Risque d’immunisation après greffe d’îlotsCampbell PM et al., AJT 2007, 7: 2311-17• 98 receveurs d’une allogreffe d’îlots• Recherche d’une immunisation par cytofluorométrie• 31 % : apparition de novo de DSA (donor specific antibody)– Alors qu’encore sous immunosuppression (n=23)• 16% sont hyperimmunisés• Après arrêt de l’immunosuppression : 71 % ont un PRA > 50%– PRA median : 89%• dans la plupart des cas, l’immunisation est persistanteDonc, un vrai problème pour l’avenir de ces patients en transplantation…

Risque d’immunisation après greffe d’îlotsCampbell PM et al., AJT 2007, 7: 2311-17

Risques microbiologiques• Of the 634 islet preparations reported to CITR:– nine final preparations showed a positive aerobic culture– five showed a positive anaerobic culture,– eleven showed a positive fungal culture,– one tested positive for mycoplasmaAnalyse 2007 CITR

Les causes d'échecs• Difficultés de l'isolement• Nombre insuffisant d'îlots transplantés• Implantation incomplète• Site inapproprié ?• Destruction non spécifique• Rejet aigu• Toxicité du traitement immunosuppresseur• Récidive de l'auto-immunité

Circuit de digestion

Purification

Îlots Pancréatiques Après Purification

Données du CITRMais gros volume donc risque mécanique si on ne purifie pas…Analyse 2007 CITR

Données du CITR :évolution de la pression portaleAnalyse 2007 CITR

Site inapproprié ?Eich T: Positron emission tomography: a real-time tool to quantify early islet engraftment in apreclinical large animal model. Transplantation. 2007 Oct 15;84(7):893-8.• Utilisation de la TEP pour suivre in vivo les îlots• Modèle porcin• Ilots marqués au 2 deoxyfluoro-glucose• 50% de la radioactivité retrouvée au niveau du foie à la fin de laprocédure d’injection des îlots• Pas de radioactivité ailleurs que dans le foie• Données retrouvées sur d’autres modèles• Grosses pertes très précoces ?

lmmunité acquise…• Des conditions pas optimales• Pas de marqueurs de rejetAnalyse 2007 CITR

Toxicité des immunosuppresseursEffetantiangiogénèse

Qualité du greffon et âge du donneurGSIR = glucose stimulated insulin releaseTransplantation chez la souris nude

Les voies de recherche• Amélioration des techniques d'isolement• Meilleure immunosuppression• Trouver d'autres sites d'implantation• Trouver d'autres sources

L'îlot est un organe qu'il faut protéger…

SCOT : Isolated perfused pig kidneyEurocollinsUniversity ofWisconsinKrebs / P.E.G.proximal tubule cells of pig kidneysafter 48 hour cold-storage and 2 hours reperfusion.Original magnification 3300.T. Hauet, JM Goujon; M.Eugène. Labo RMN St-Louis Paris, INRA Surgères

Long term culture (12 days)HBSS - RPMIS.C.O.T – RPMI + PEGLight microscopy : Magnification: x100

Static IncubationInsulin production detected by RadioImmunoAssay ( 125 I-Insulin)DAY 1***DAY 12*****: p

S.C.O.T prolonged islet allograft survivalAllografts C3H to Balb/cAllo HBSSn=6MST = 7.3 ± 3.6 daysAllo S.C.O.Tn=7MST = 17.3 ± 4.3 daysP< 0.00110 days

Immunomasking effect of PEGImmunofluorescence study• Islets were cultured overnight in RPMI ± PEG 20 kD• Incubation with anti MHC Class I antibody (mouse anti mouse H2-K k)Negative controlRPMI with no PEGRPMI with PEG 20 kDEpifluorescent microscopy: magnification x400

How to make sure that allograft survivalprolongation is not the consequence of a bettermetabolic state of SCOT isolated islets?Donors expressHA on β cellsRecipients: 90 % of CD8 TLexpress a transgenic TCRspecific for HAHAHAHAHA HAHAHACD8HAHAHAHAHAHAHACD8CD8CD8CD8CD8CD8CD8

S.C.O.T prolonged islet allograft survivalin a "superacute" rejection model(InsHA to CL4)Allografts (InsHA to CL4)Allo HBSSn=5MST = 2.4 ± 0.4 daysAllo S.C.O.Tn=2MST = 12.5 ± 0.5 daysP< 0.000110 days

Xénogreffe : avantages• candidat : le porc– insuline a fait la preuve de son efficacité– niveau de régulation glycémique proche– isolement des îlots possible– élevage EOPS possible, larges portées– considérations éthiques– risque de zoonose probablement limité• pas de rejet hyperaigu :– néovascularisation par vx receveur– pas de gal α1-3 gal (au moins sur les îlots néonataux)• pas de récidive de l'autoimmunité• pas de limitation dans le nombre de donneurs

Xénogreffes : problèmes• rejet aigu non résolucaractéristiques allogreffe xénogreffedébut 2-3 j 2-3 jmaximum 5-8 j 4-6 jfibrose ++ ++++infiltrat lymphocytaire T ++++ ++CD8>CD4 CD4>CD8macrophages ++ ++++éosinophiles rares ++++cytokines TH1 TH2• modèles disponibles imparfaits• nouveaux espoirs avec les nouveaux immunosuppresseurs :• Csa + MMF + léflunomide (pig to rat model)• AC humanisé anti CD154 chez le singe

Xénogreffes :risque de transmission de séquences endogènes rétrovirales (PERV)K Paradis, Science 285: 1236; 1999• PERV = retrovirus type C qui s'intègre de façon permanente au génome duporc• 160 patients (recul jusquà 12 ans)– 100 : perfusion extracorporéale splénique– 28 : foie bioartificiel (dont 25 transplantés par la suite)– 15 : greffes de peau– 14 : greffes d'îlots porcins néonataux– 2 : perfusion extracorporelle de rein– 1 : perfusion extracorporelle de foie entier (suivie d'une allogreffe)• 4 laboratoires différents• pas de signes d'infection persistante par PERV chez 97% despatients (les autres étaient non testables pour des raisons techniques)– virémie négative, PBL : PCR nég, RT-PCR nég• microchimérisme persistant (jusqu'à 8,5 ans) chez 23 patients.

pas de preuve in vitrodu caractère infectant des îlots(équipe de P Saî, INRA, Nantes)cocultures lignées humaines(Molt4, Jurkat, K526)avec des lignées porcinesproduisant des PERV(PK15 et G2)avec des îlots porcinsEOPSPCR +RT PCR +PCR -RT PCR -

“Reprogrammation” de cellules autologuesS Ferber, Nature Medicine, 2000; 6(5): 56872)• reprogrammation d'hépatocytes :– même origine endodermique que les îlots– même système de transporteurs du glucose et de kinases– transfert in vivo du gène du facteur de transcription PDX1 de rat à dessouris (adénovirus)– intégration et transcription essentiellement dans le foie (pas dans lepancréas)– dérepression des 2 gènes de l'insuline et d'autres...– insuline dans extraits de foie (1% /extraits de pancréas mais 2500 % /foie normal)– insulinémie : + 300 %– correction partielle du diabète induit par STZ– quelles sous-populations hépatocytaires (ne marche pas in vitro surhépatocytes matures)?– rôle de cellules pluripotentes?– quelle régulation ?– récidive de l'autoimmunité ?

Utilisation de cellules souchesV Ramiya,Nature Medicine, 2000; 6(3): 278-282• néogenése d'îlots :– à partir de cellules souches pluripotentes épithéliales du systèmeexcréteur (souris adultes NOD prédiabétiques)– repiquage au long cours (3 ans) permettant d’augmenter 10 000fois le nombre d’îlots obtenus à partir d’un pancréas– détection de mRNA de insuline 1 et 2, glucagon, somatostatine,GAD 67,...– capables de secréter de l’insuline après stimulation par glucose,notamment en présence de nicotinamide– capable de corriger partiellement le diabète de souris NOD– 2 implantations sous-cutanées : pas de récidive auto-immune

Utilisation de cellules mésenchymateusesisolées de la moelle osseuse chez l’hommeC Moriscot, Stem cells, 2005, 23: 594-604• Cellules mésenchymateuses humaines isolées à partir de la moelle dedonneurs sains• Transfert de gènes par vecteur adénoviral codant pour des facteurs detranscription murins impliqués dans la différenciation en tissu endocrine(IPF1, HLXB9, FOXA2)• Provoquant l’expression du gène de l’insuline• À la condition d’un environnement adapté

Conclusion• Technique encore à la limite labo - clinique• Progrès récents majeurs• Gros potentiel• À comparer aux résultats obtenus avec les pompesimplantables• Trop de greffons pancréatiques encore inutilisés"Mieux vaut être optimiste et avoir tortque pessimiste et avoir raison"

Prévalence de l’insulino-indépendance etde la positivité du peptide CAnalyse 2007 CITR

Survie des greffons(fonction partielle au moins)