Ce que la métagénomique nous apprend de la microflore laitière.

CE QUE LA MÉTAGÉNOMIQUE NOUSAPPREND DE LA MICROFLORELAITIÈREDenis Roy*, Gisèle LaPointe,Geneviève Gagné et Émilie Desfossés-FoucaultUniversité LavalColloque STELA 2013 / STELA Symposium 201313 mai 2013Hotel Delta Centre-Ville, Montréal

Plan de la présentation• Métagenomique: définition/méthodes• Séquençage à haut débit: microflore laitière• Dynamique des lactocoques et deslactobacilles dans le fromage cheddar• Activité des lactocoques et des lactobacillesdans le fromage cheddar

“Détectomics!”Le microbiologiste laitier est toujours à la recherche de méthodesmoléculaires pour:• Détection• Identification fiable• Suivi et déterminationDes microorganismes dans l’environnement laitierFerme ou à l’usineFermentsou culturesFromageEcolini D 2013. High-throughput sequencing and metagenomics: a step in the culture independent analysis of food microbial ecology. ApplEnviron Microbiol.

Génomique des communautésmicrobiennesMéta-génomique ou génomique écologique•discipline qui emploie des méthodes génomiques pour analyserles communautés écologiques naturelles.Métagénomique•Méthode de séquençage et de l’analyse de l’ensemble desgénomes (ADN) des populations bactériennes d'un milieudonné.“Cheese-omics”•Diverses méthodes génomiques pour étudier la diversité,l’activité et le métabolisme des diverses populations del’écosystème du fromage sans les cultiver

“*-Omics”Influence des populationsmicrobiennesDiversité Dynamique ActivitéADN : Populations totalesARN : Populations actives5

Vue d’ensemble des techniquesmoléculairesCultureÉchantillonde lait oufromage+ -ExtractionADN/ARNqPCRAmplification parPCR de l’ARNr 16SSéparation de l’ARNr 16S parélectrophorèse sur gel(DGGE, T-RFLP, ARISA)Séquençage desamplicons d’ARNr16S clonésSéquençage directedes ampliconsd’ARNr 16S parPyroséquençage(Roche 454)

Séquençage à haut débit (HTS)LAITMicrobiomeHTSStrainmonitoringStructure dumicrobiote

Séquençage de l’ARNr 16S

HTS d’échantillons laitiers ciblantle gène de l’ARNr 16SÉchantillonlaitierLait mammitebovineLaitcru/fromagedanoisFromageMozzarellade buflesseFromageartisanalirlandaisRégionvariableLongueurampliconPlateformeséquençageRésolutiontaxonomiqueRéférenceV1-V2 250 bp 454 FLX Famille/genre Oikinomou et al.,PloS one. 2012;7.V3-V4 450 bp 454 FLX Genre/espèce Masoud et al.2011. Int Dairy J21,142Masoud et al. 2012Int J FoodMicrobiol 153, 192V1-V3 500 bp 454 FLX Espèce Ercolini et al. 2012,Appl EnvironMicrobiol 78:8142V4 250 bp 454 FLX Genre Quigley et al. 2012.Appl EnvironMicrobiol 78, 5717

Diversité microbienne de lait mammiteux bovin par pyroséquençage d’ADNr 16SmétagénomiqueStreptococcusLactobacillusStaphylococcusPropionibacteriumStrepEn santéStaphOikonomou G, Machado VS, Santisteban C, Schukken YH, et al. (2012) Microbial Diversity of Bovine Mastitic Milk as Described by Pyrosequencing ofMetagenomic 16s rDNA. PLoS ONE 7(10): e47671.

Lait cruAcinetobacterAerococcusStreptococcusthermophilus,Lactococcus lactis,Staphyloccussaprophyticus,Lactobacillusrhamnosus,Brevibacteriumlinens,Corynebacteriumcasei, AcinetobacterCorynebacteriumEnterococcusFacklamiaPseudomonasStaphylococcusStreptococcusMasoud et al. 2012 Int J Food Microbiol 153, 192

Fromage au lait cru danoisDNAStreptococcus,Lactococcus andLactobacillusStaphylococcusMetabolicallyactivecDNA95-99% Lb. helveticusRest: Lb. casei, Lb.delbrueckii and Lb.fermentumMasoud et al. Characterization of bacterial populations in Danish raw milk cheeses made with different starter cultures by denaturating gradient gel electrophoresis andpyrosequencing. International Dairy Journal. 2011;21.

200Анали Правног факултета у Београду, година LVIII, 2/2010старатеља детету. Родитељи су у овом поступку тужена страна и немогу заступати дете. 58Увидом у упоредноправна решења о заступању детета у случајусукобљавања његових интереса са родитељским, уочљиво је да се уконтинетналним правним системима начело официјелности снажнијепримењује кроз овлашћење суда да процени потребу за постављањемстаратеља, док је у земљама са англосаксонском правном традицијомсуд обавезан да постави стратеља. 59 Taко, у немачком праву суд имаовлашћење да постави посебног старатеља (Plegerbestellung) који поправилу не мора бити адвокат, већ то може бити социјални радник,педагог, дететов сродник. 60 У Енглеској постоји двострука заштитадетета: социјални радник (Guardian ad litem) кога поставља суд ичија је дужност да утврди чињенице везане за дете, и правни заступникдетета (Advocate) који предузима процесно заступање детета. 61У Енглеском праву могуће је да истовремено постоји старатељство,а да родитељи врше нека права из корпуса родитељских права. 62 Иу нашем праву могуће је да дете буде стављено под старатељску заштиту,а да родитељи и даље врше родитељско право (у случају делимичноглишења родитељског права). Енглеско право омогућава,уз процену суда, да и малолетно дете може бити постављено заколизијског старатеља. 63 У Канади, пак, постоји трострука заштитадетета, коју чине дечији адвокат (Child advocate), посебан старатељ(Guardian ad litem) и пријатељ суда (Amicus curiae). Н. Петрушић нарочитоподвлачи чињеницу да се у САД сматра да дете има право напосебног старатеља у случају сукоба интереса са родитељима, доксудска власт неких федералних држава не испитује могућност сукобаинтереса детета и родитеља, сматрајући потоње искључивим застуницимадетета. 6458Имамо у виду да је реч о лишењу родитељског права оба родитеља. Ако јеу питању лишење родитељског права само једног родитеља, други родитељ заступадете, те нема потребе за постављањем колизијског старатеља. Ипак и када дете имадругог родитеља који врши родитељско право, суд и орган старатељства могу дететуодредити колизијског старатеља. Тако, С. Бубић, Интервенција друштва у породичнимодносима, Београд 1988, 163.59Опширније о томе Н. Петрушић, „Заступање детета у парници“, Правниживот 10/2006, 169–191.60Осим у немачком праву, и у праву Шведске и aмеричке савезне државеМериленд, након извршених реформи не постоји пуно старатељство, вид. I. Doron,„Elder Guardianship Koleidoscope – A Comparative Legal Prospective“, InternationalJournal of Law, Policy, and the Family, vol. 16, 3/2002, 387.61Н. Петрушић, 173.62Ј. Herring, Family Law, Oxford 2007, 660.6364Ibid.,661.Н. Петрушић, 175.

Diversité bactérienne et abondance relativede deux lots de fromage mozzarellaAcinetobacterClostridiaCorynebacteriumPseudomonasStreptococcusErcolini D et al. Appl. Environ. Microbiol. 2012;78:8142-8145

Microbiote du fromage au niveau genre(a) pâte molle; (b) pâte semi-ferme; (c) pâte ferme; (d) crôuteQuigley L et al. Appl. Environ. Microbiol. 2012;78:5717-5723

Fromage artisanal irlandaisRindPseudomonasStaphylococcus2182CorynebacteriumStreptococcusFacklamia

Dynamique des lactocoquesCheddar CheeseLog genome copynumber/g of cheese131211109813SEPasteurized0 1 2 3 4 5 6131211109813SEThemized0 1 2 3 4 5 6Total LABLactococciLog cDNA copynumber/g of cheese12111098SE0 1 2 3 4 5 612111098SE0 1 2 3 4 5 6Ripening time (months)

Dynamique des lactobacilles1110984 °CPasteurized111098Cheddar CheeseThemized77Log cDNA copy number/g of cheese654111098765411109SE0 1 2 3 4 5 67 °CSE0 1 2 3 4 5 612 °C654111098765411109SE0 1 2 3 4 5 6SE0 1 2 3 4 5 6LactobacilliLb. casei/paracasei88776654SE0 1 2 3 4 5 654SE0 1 2 3 4 5 6Ripening time (months)

Activité: ModèlesLactococcus lactis ssp.cremoris SK11Lactobacillus casei ATCC334Préculturedans le lait(16h à 22 °C)Inoculation10 9 cfu/g SK1110 6 cfu/g 33410 9 cfu/g SK1110 6 cfu/g 334X 3repModèles fromagersFabrication : Test de PearceMaturation : CaillésTempératureT0T132°CT238 °C T335 °CTempsT4SalageT525 g de poudre de fromage(lyophilisée et irradiée)Homogénéisation avec la/lesbactéries et flush à l’azoteMaturation pendant 3, 6, 9 et 12jours à 30 °C

RT-qPCR HTRNA extraction - cDNAcDNAClassificationMétabolisme des sucresMétabolisme des a.a.Dégradation (a.a. et peptides)Réponse au stressFonctions cellulairesLipolyseGènes spécifiques à SK11Gènes spécifiques à ATCC 334GenesdeoC, pfk, adh, ldh, gapA, serA, galKcysK, metC, argH, aspB, hisC, glmS, nifS, glyA, luxSbcaT, araT, oppD, prtP, pepM, pepN, pepQ, pepXclpC, dnaJ, groEL, groES, htrAdnaG, ftsE, dacA, purDestAacpD, busAA, cysE, holin, optD, argD, serC, trpGycjM, aldB, aspA, fpb, gdh, lacG, opuA, lipAQuantificationrelative (parrapport à T0)

L. Lactis ssp. cremoris SK11Surexpression d’un gène lié à lalipolyse (estA) après le salage.Surexpression des gènes dumétabolismes des acides aminés(cysK, aspB et hisC).PearceASurexpression du gène prtP(protéinase) en début de maturation.Surexpression ldh, adh, gapA et pepM,pepN en fin de maturationSurexpression du gène de stressgrosES (protéine chaperone) en culturesimple ou mixte.En mixte, surexpression des gènesgalK, serA (métabolisme des sucres) etftsE (division cellulaire).SlurryMixed

L. casei ATCC 334BSurexpression du gèneftsE (division cellulaire)au cours de la simulationde la fabrication et de lamaturation.PureSurexpression du gène fbp(fructose 1,6biphosphatase).MixedSurexpression du gènemetC en slurrySurexpression des gènespepQ, pepM et pepX à lafin de la maturation.

Active non cultivableMembraneintacteIPropidium monoazideMembraneendommagéePMAViableVNCfantômeMembraneendommagéeIICultivableMétaboliquementactiveIntactPhotoactivationIIIIVPCR amplification

Monitoring de souches de lactocoquesqPCRPMA qPCRLog gene copy number/mlTest Pearce/ autolytique

PerspectivesTraçabilitéContrôle de qualité(monitoring)Innovation desprocédés

RemerciementsTous les collaborateurs, étudiants, chercheurs et stagiaires28