Ce que la métagénomique nous apprend de la microflore laitière.
Ce que la métagénomique nous apprend de la microflore laitière.
Ce que la métagénomique nous apprend de la microflore laitière.
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
CE QUE LA MÉTAGÉNOMIQUE NOUSAPPREND DE LA MICROFLORELAITIÈREDenis Roy*, Gisèle LaPointe,Geneviève Gagné et Émilie Desfossés-FoucaultUniversité LavalCollo<strong>que</strong> STELA 2013 / STELA Symposium 201313 mai 2013Hotel Delta <strong>Ce</strong>ntre-Ville, Montréal
P<strong>la</strong>n <strong>de</strong> <strong>la</strong> présentation• Métagenomi<strong>que</strong>: définition/métho<strong>de</strong>s• Sé<strong>que</strong>nçage à haut débit: <strong>microflore</strong> <strong>la</strong>itière• Dynami<strong>que</strong> <strong>de</strong>s <strong>la</strong>ctoco<strong>que</strong>s et <strong>de</strong>s<strong>la</strong>ctobacilles dans le fromage cheddar• Activité <strong>de</strong>s <strong>la</strong>ctoco<strong>que</strong>s et <strong>de</strong>s <strong>la</strong>ctobacillesdans le fromage cheddar
“Détectomics!”Le microbiologiste <strong>la</strong>itier est toujours à <strong>la</strong> recherche <strong>de</strong> métho<strong>de</strong>smolécu<strong>la</strong>ires pour:• Détection• I<strong>de</strong>ntification fiable• Suivi et déterminationDes microorganismes dans l’environnement <strong>la</strong>itierFerme ou à l’usineFermentsou culturesFromageEcolini D 2013. High-throughput se<strong>que</strong>ncing and metagenomics: a step in the culture in<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt analysis of food microbial ecology. ApplEnviron Microbiol.
Génomi<strong>que</strong> <strong>de</strong>s communautésmicrobiennesMéta-génomi<strong>que</strong> ou génomi<strong>que</strong> écologi<strong>que</strong>•discipline qui emploie <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s génomi<strong>que</strong>s pour analyserles communautés écologi<strong>que</strong>s naturelles.Métagénomi<strong>que</strong>•Métho<strong>de</strong> <strong>de</strong> sé<strong>que</strong>nçage et <strong>de</strong> l’analyse <strong>de</strong> l’ensemble <strong>de</strong>sgénomes (ADN) <strong>de</strong>s popu<strong>la</strong>tions bactériennes d'un milieudonné.“Cheese-omics”•Diverses métho<strong>de</strong>s génomi<strong>que</strong>s pour étudier <strong>la</strong> diversité,l’activité et le métabolisme <strong>de</strong>s diverses popu<strong>la</strong>tions <strong>de</strong>l’écosystème du fromage sans les cultiver
“*-Omics”Influence <strong>de</strong>s popu<strong>la</strong>tionsmicrobiennesDiversité Dynami<strong>que</strong> ActivitéADN : Popu<strong>la</strong>tions totalesARN : Popu<strong>la</strong>tions actives5
Vue d’ensemble <strong>de</strong>s techni<strong>que</strong>smolécu<strong>la</strong>iresCultureÉchantillon<strong>de</strong> <strong>la</strong>it oufromage+ -ExtractionADN/ARNqPCRAmplification parPCR <strong>de</strong> l’ARNr 16SSéparation <strong>de</strong> l’ARNr 16S parélectrophorèse sur gel(DGGE, T-RFLP, ARISA)Sé<strong>que</strong>nçage <strong>de</strong>samplicons d’ARNr16S clonésSé<strong>que</strong>nçage directe<strong>de</strong>s ampliconsd’ARNr 16S parPyrosé<strong>que</strong>nçage(Roche 454)
Sé<strong>que</strong>nçage à haut débit (HTS)LAITMicrobiomeHTSStrainmonitoringStructure dumicrobiote
Sé<strong>que</strong>nçage <strong>de</strong> l’ARNr 16S
HTS d’échantillons <strong>la</strong>itiers cib<strong>la</strong>ntle gène <strong>de</strong> l’ARNr 16SÉchantillon<strong>la</strong>itierLait mammitebovineLaitcru/fromagedanoisFromageMozzarel<strong>la</strong><strong>de</strong> buflesseFromageartisanalir<strong>la</strong>ndaisRégionvariableLongueurampliconP<strong>la</strong>teformesé<strong>que</strong>nçageRésolutiontaxonomi<strong>que</strong>RéférenceV1-V2 250 bp 454 FLX Famille/genre Oikinomou et al.,PloS one. 2012;7.V3-V4 450 bp 454 FLX Genre/espèce Masoud et al.2011. Int Dairy J21,142Masoud et al. 2012Int J FoodMicrobiol 153, 192V1-V3 500 bp 454 FLX Espèce Ercolini et al. 2012,Appl EnvironMicrobiol 78:8142V4 250 bp 454 FLX Genre Quigley et al. 2012.Appl EnvironMicrobiol 78, 5717
Diversité microbienne <strong>de</strong> <strong>la</strong>it mammiteux bovin par pyrosé<strong>que</strong>nçage d’ADNr 16Smétagénomi<strong>que</strong>StreptococcusLactobacillusStaphylococcusPropionibacteriumStrepEn santéStaphOikonomou G, Machado VS, Santisteban C, Schukken YH, et al. (2012) Microbial Diversity of Bovine Mastitic Milk as Described by Pyrose<strong>que</strong>ncing ofMetagenomic 16s rDNA. PLoS ONE 7(10): e47671.
Lait cruAcinetobacterAerococcusStreptococcusthermophilus,Lactococcus <strong>la</strong>ctis,Staphyloccussaprophyticus,Lactobacillusrhamnosus,Brevibacteriumlinens,Corynebacteriumcasei, AcinetobacterCorynebacteriumEnterococcusFack<strong>la</strong>miaPseudomonasStaphylococcusStreptococcusMasoud et al. 2012 Int J Food Microbiol 153, 192
Fromage au <strong>la</strong>it cru danoisDNAStreptococcus,Lactococcus andLactobacillusStaphylococcusMetabolicallyactivecDNA95-99% Lb. helveticusRest: Lb. casei, Lb.<strong>de</strong>lbrueckii and Lb.fermentumMasoud et al. Characterization of bacterial popu<strong>la</strong>tions in Danish raw milk cheeses ma<strong>de</strong> with different starter cultures by <strong>de</strong>naturating gradient gel electrophoresis andpyrose<strong>que</strong>ncing. International Dairy Journal. 2011;21.
200Анали Правног факултета у Београду, година LVIII, 2/2010старатеља детету. Родитељи су у овом поступку тужена страна и немогу заступати дете. 58Увидом у упоредноправна решења о заступању детета у случајусукобљавања његових интереса са родитељским, уочљиво је да се уконтинетналним правним системима начело официјелности снажнијепримењује кроз овлашћење суда да процени потребу за постављањемстаратеља, док је у земљама са англосаксонском правном традицијомсуд обавезан да постави стратеља. 59 Taко, у немачком праву суд имаовлашћење да постави посебног старатеља (Plegerbestellung) који поправилу не мора бити адвокат, већ то може бити социјални радник,педагог, дететов сродник. 60 У Енглеској постоји двострука заштитадетета: социјални радник (Guardian ad litem) кога поставља суд ичија је дужност да утврди чињенице везане за дете, и правни заступникдетета (Advocate) који предузима процесно заступање детета. 61У Енглеском праву могуће је да истовремено постоји старатељство,а да родитељи врше нека права из корпуса родитељских права. 62 Иу нашем праву могуће је да дете буде стављено под старатељску заштиту,а да родитељи и даље врше родитељско право (у случају делимичноглишења родитељског права). Енглеско право омогућава,уз процену суда, да и малолетно дете може бити постављено заколизијског старатеља. 63 У Канади, пак, постоји трострука заштитадетета, коју чине дечији адвокат (Child advocate), посебан старатељ(Guardian ad litem) и пријатељ суда (Amicus curiae). Н. Петрушић нарочитоподвлачи чињеницу да се у САД сматра да дете има право напосебног старатеља у случају сукоба интереса са родитељима, доксудска власт неких федералних држава не испитује могућност сукобаинтереса детета и родитеља, сматрајући потоње искључивим застуницимадетета. 6458Имамо у виду да је реч о лишењу родитељског права оба родитеља. Ако јеу питању лишење родитељског права само једног родитеља, други родитељ заступадете, те нема потребе за постављањем колизијског старатеља. Ипак и када дете имадругог родитеља који врши родитељско право, суд и орган старатељства могу дететуодредити колизијског старатеља. Тако, С. Бубић, Интервенција друштва у породичнимодносима, Београд 1988, 163.59Опширније о томе Н. Петрушић, „Заступање детета у парници“, Правниживот 10/2006, 169–191.60Осим у немачком праву, и у праву Шведске и aмеричке савезне државеМериленд, након извршених реформи не постоји пуно старатељство, вид. I. Doron,„El<strong>de</strong>r Guardianship Koleidoscope – A Comparative Legal Prospective“, InternationalJournal of Law, Policy, and the Family, vol. 16, 3/2002, 387.61Н. Петрушић, 173.62Ј. Herring, Family Law, Oxford 2007, 660.6364Ibid.,661.Н. Петрушић, 175.
Diversité bactérienne et abondance re<strong>la</strong>tive<strong>de</strong> <strong>de</strong>ux lots <strong>de</strong> fromage mozzarel<strong>la</strong>AcinetobacterClostridiaCorynebacteriumPseudomonasStreptococcusErcolini D et al. Appl. Environ. Microbiol. 2012;78:8142-8145
Microbiote du fromage au niveau genre(a) pâte molle; (b) pâte semi-ferme; (c) pâte ferme; (d) crôuteQuigley L et al. Appl. Environ. Microbiol. 2012;78:5717-5723
Fromage artisanal ir<strong>la</strong>ndaisRindPseudomonasStaphylococcus2182CorynebacteriumStreptococcusFack<strong>la</strong>mia
Dynami<strong>que</strong> <strong>de</strong>s <strong>la</strong>ctoco<strong>que</strong>sCheddar CheeseLog genome copynumber/g of cheese131211109813SEPasteurized0 1 2 3 4 5 6131211109813SEThemized0 1 2 3 4 5 6Total LABLactococciLog cDNA copynumber/g of cheese12111098SE0 1 2 3 4 5 612111098SE0 1 2 3 4 5 6Ripening time (months)
Dynami<strong>que</strong> <strong>de</strong>s <strong>la</strong>ctobacilles1110984 °CPasteurized111098Cheddar CheeseThemized77Log cDNA copy number/g of cheese654111098765411109SE0 1 2 3 4 5 67 °CSE0 1 2 3 4 5 612 °C654111098765411109SE0 1 2 3 4 5 6SE0 1 2 3 4 5 6LactobacilliLb. casei/paracasei88776654SE0 1 2 3 4 5 654SE0 1 2 3 4 5 6Ripening time (months)
Activité: ModèlesLactococcus <strong>la</strong>ctis ssp.cremoris SK11Lactobacillus casei ATCC334Préculturedans le <strong>la</strong>it(16h à 22 °C)Inocu<strong>la</strong>tion10 9 cfu/g SK1110 6 cfu/g 33410 9 cfu/g SK1110 6 cfu/g 334X 3repModèles fromagersFabrication : Test <strong>de</strong> PearceMaturation : CaillésTempératureT0T132°CT238 °C T335 °CTempsT4Sa<strong>la</strong>geT525 g <strong>de</strong> poudre <strong>de</strong> fromage(lyophilisée et irradiée)Homogénéisation avec <strong>la</strong>/lesbactéries et flush à l’azoteMaturation pendant 3, 6, 9 et 12jours à 30 °C
RT-qPCR HTRNA extraction - cDNAcDNAC<strong>la</strong>ssificationMétabolisme <strong>de</strong>s sucresMétabolisme <strong>de</strong>s a.a.Dégradation (a.a. et pepti<strong>de</strong>s)Réponse au stressFonctions cellu<strong>la</strong>iresLipolyseGènes spécifi<strong>que</strong>s à SK11Gènes spécifi<strong>que</strong>s à ATCC 334Genes<strong>de</strong>oC, pfk, adh, ldh, gapA, serA, galKcysK, metC, argH, aspB, hisC, glmS, nifS, glyA, luxSbcaT, araT, oppD, prtP, pepM, pepN, pepQ, pepXclpC, dnaJ, groEL, groES, htrAdnaG, ftsE, dacA, purDestAacpD, busAA, cysE, holin, optD, argD, serC, trpGycjM, aldB, aspA, fpb, gdh, <strong>la</strong>cG, opuA, lipAQuantificationre<strong>la</strong>tive (parrapport à T0)
L. Lactis ssp. cremoris SK11Surexpression d’un gène lié à <strong>la</strong>lipolyse (estA) après le sa<strong>la</strong>ge.Surexpression <strong>de</strong>s gènes dumétabolismes <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s aminés(cysK, aspB et hisC).PearceASurexpression du gène prtP(protéinase) en début <strong>de</strong> maturation.Surexpression ldh, adh, gapA et pepM,pepN en fin <strong>de</strong> maturationSurexpression du gène <strong>de</strong> stressgrosES (protéine chaperone) en culturesimple ou mixte.En mixte, surexpression <strong>de</strong>s gènesgalK, serA (métabolisme <strong>de</strong>s sucres) etftsE (division cellu<strong>la</strong>ire).SlurryMixed
L. casei ATCC 334BSurexpression du gèneftsE (division cellu<strong>la</strong>ire)au cours <strong>de</strong> <strong>la</strong> simu<strong>la</strong>tion<strong>de</strong> <strong>la</strong> fabrication et <strong>de</strong> <strong>la</strong>maturation.PureSurexpression du gène fbp(fructose 1,6biphosphatase).MixedSurexpression du gènemetC en slurrySurexpression <strong>de</strong>s gènespepQ, pepM et pepX à <strong>la</strong>fin <strong>de</strong> <strong>la</strong> maturation.
Active non cultivableMembraneintacteIPropidium monoazi<strong>de</strong>MembraneendommagéePMAViableVNCfantômeMembraneendommagéeIICultivableMétaboli<strong>que</strong>mentactiveIntactPhotoactivationIIIIVPCR amplification
Monitoring <strong>de</strong> souches <strong>de</strong> <strong>la</strong>ctoco<strong>que</strong>sqPCRPMA qPCRLog gene copy number/mlTest Pearce/ autolyti<strong>que</strong>
PerspectivesTraçabilitéContrôle <strong>de</strong> qualité(monitoring)Innovation <strong>de</strong>sprocédés
RemerciementsTous les col<strong>la</strong>borateurs, étudiants, chercheurs et stagiaires28