UNIVERSITE D'ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES ...

UNIVERSITE D’ANTANANARIVOFACULTE DES SCIENCESDEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEEMémoire pour l’obtention du Diplôme d’Etudes Approfondies (DEA) deBiochimieOption : Biochimie appliquée aux sciences médicalesETUDES CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DES EXTRAITS DEFEUILLES D’UNE PLANTE MEDICINALE MALGACHEChassalia bojeriana (RUBIACEES)Présenté parRANDRIAMAMPIANINA Lovarintsoa JudicaëlMaître ès sciencesLe 18 septembre 2008Devant la commission d’examen composée de :Président : Professeur ANDRIANARISOA BlandineRapporteur : Professeur JEANNODA VictorExaminateurs : Docteur RAVONINJATOVO MarcDocteur RAMAMONJISOA Daniel

Table des matièresPagesDEDICACE……………………………………………………………………………………iREMERCIEMENTS................................................................................................................iiGLOSSAIRE…………………………………………………………………………………iiiABREVIATIONS………………………………………………………...………………......ivLISTE DES FIGURES…………………………………………………………...…..………vLISTE DES TABLEAUX……………………………………………………………………viINTRODUCTION GENERALE…………………………………………………………….1PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE1 INTRODUCTION………………………………………………………………………….62 MATERIELS ET METHODES…………………………………………………………...62.1 MATERIELS…………………………………………………….…………...….……....62.1.1 LE MATERIEL VEGETAL………………………………………………………………….62.1.1.1 Position systématique…………………………………………………...……......62.1.1.2 Description botanique………………………………………………….………...72.1.1.2.1 Description du genre Chassalia……………………….…………………..…72.1.1.2.2 Description de l’espèce Chassalia bojeriana..................................................72.1.1.3 Distribution géographique de l’espèce Chassalia bojeriana…………………….82.1.1.4 Utilisation empirique de la plante……………………………..…………........…82.1.1.5 Date et lieu de récolte………………………………………..…………….....…..82.1.1.6 Préparation et conservation du matériel végétal…………..…………………......92.1.2 LES PRODUITS CHIMIQUES…………………………………......………….........…92.2 METHODES……………………………………………………………..…..………..…92.2.1 METHODES D’EXTRACTION DES PRINCIPES ACTIFS…………………………….92.2.1.1 Extraction à froid……………………………………………..……………….....92.2.1.2 Extraction à chaud……………………………………………...……………..…92.2.2 METHODES DE PURIFICATION……………………………...………………….…102.2.2.1 Précipitation par l’éthanol 50%. …………………………..……………………102.2.2.1.1 Principe……………………………………………………...……………...102.2.2.1.2 Mode opératoire……………………………………………………...……..102.2.2.2 Fractionnement par l’acétate d’éthyle……………………...……...……….…...102.2.2.2.1 Principe………………………………………………...…………………...10

Table des matières2.2.2.2.2 Mode opératoire………………………………………………...…………..102.2.2.3 Fractionnement par le n-butanol…………………………………..…………....112.2.2.3.1 Principe……………………………………………………………….....….112.2.2.3.2 Mode opératoire……………………………………………………….……112.2.2.4 Précipitation par l’acétate neutre de plomb……….………………….……..….112.2.2.4.1 Principe………………………………………………………...……..…….112.2.2.4.2 Mode opératoire…………………………………………...………………..122.2.2.5 Dialyse……………………………….………………….…….………..............122.2.2.5.1 Principe…………………………………...………………………………...122.2.2.5.2 Mode opératoire……………………………………………………….........122.2.2.5.3 Préparation de la membrane de dialyse………………………………….…132.2.2.5.4 Mise en route de la dialyse……………………………………………….....132.2.2.6 Chromatographie sur résine échangeuse d’ions………………………..…….....132.2.2.6.1 Principe…………………...……………………………………...……….....132.2.2.6.2 Mode opératoire…………………………………………………………….142.2.2.6.2.1 Préparation de la résine…………………………………………………142.2.2.6.2.2 Dépôt de l’échantillon…………………………………………..……....142.2.2.6.2.3 Régénération de la résine…………………………………………….....142.2.2.7 Chromatographie d’exclusion sur colonne de Sephadex G 25………………....142.2.2.7.1 Principe……………………..……………………………...…………….…142.2.2.7.2 Mode opératoire…………………………………………………...………..152.2.3 METHODE DE CONCENTRATION……………………….……………………...…152.2.4 CALCUL DU RENDEMENT…………………………………..…………………..…162.2.5 METHODES D’ANALYSE…………….…………..…………………………………162.2.5.1 Chromatographie sur couche mince………………………...….…………….....162.2.5.1.1 Principe………………………………………………………………….......162.2.5.1.2 Mode opératoire…………………………………………………………….162.2.5.1.2.1 Dépôt des échantillons……………………………………………...…..162.2.5.1.2.2 Développement du chromatogramme……………………….………….162.2.5.1.2.3 Révélation du chromatogramme…………………………………...…...172.2.5.1.2.3.1 Examen sous lampe ultraviolette (UV)…………….……………….172.2.5.1.2.3.2 Réactions colorées……………………..……………...………..…...172.2.5.2 Criblage phytochimique……………………………………...………...…….....172.2.5.2.1 Préparation des extraits à tester……………………………..……....……....17

Table des matières2.2.5.2.1.1 Extrait aqueux……………………………………………………….….172.2.5.2.1.2 Extrait hydroéthanolique………………………….…………..…..…….182.2.5.2.1.3 Extrait chloroformique………….…………………………………..…..182.2.5.2.1.4 Extrait acide………………….………………………………………....182.2.5.2.2 Principes et méthodes…………………………………………………….....182.2.5.2.2.1 Alcaloïdes……………………………………………………………….182.2.5.2.2.1.1 Test de MAYER…………………………………………………….192.2.5.2.2.1.2 Test de DRAGENDORFF…………….................…………………192.2.5.2.2.1.3 Test de WAGNER………………….................…………………....192.2.5.2.2.2 Désoxyoses…………………………………………………………..….192.2.5.2.2.3 Flavonoïdes et leucoanthocyanes……………………………….......…..192.2.5.2.2.3.1 Flavonoïdes : Test de WILSTATER (test à la cyanidine)…….……202.2.5.2.2.3.2 Leucoanthocyanes……………………………………………..…....202.2.5.2.2.4 Stéroïdes et triterpènes……………………………………………...…..202.2.5.2.2.4.1 Test de LIEBERMANN-BURCHARD………………...……….….202.2.5.2.2.4.2 Test de SALKOWSKI………………………………………...……212.2.5.2.2.5 Saponosides : Test de mousse……………………………………...…...212.2.5.2.2.6 Polyphénols et tanins………….……………………………..……..…..212.2.5.2.2.6.1 Test à la gélatine…………….………………………………....…...212.2.5.2.2.6.2 Test à la gélatine salée……………………………………..…..…...222.2.5.2.2.6.3 Test au chlorure ferrique……………………………….….………..222.2.5.2.2.7 Anthraquinones (test de BORNTRÄGER)………………….…….……222.2.5.2.2.8 Iridoïdes……………………………………………………….…...…...223 RESULTATS……………………………………………..………………….…………....233.1 PREPARATION DES EXTRAITS TOXIQUES……………………….………….......233.1.1 EXTRACTION……………………………………………….……………………...233.1.1.1 Extraction à froid…………………………………………..……………...…....233.1.1.2 Extraction à chaud…………………………………………...………………….233.1.2 PURIFICATION………………………………………………..………………....….243.1.2.1 Les méthodes adoptées dans le protocole de purification…………...……….....253.1.2.1.1 Dialyse………………………………………………………...……………253.1.2.1.2 Fractionnement par le n-butanol………………………………….....……...253.1.2.1.3 Chromatographie d’exclusion sur colonne Sephadex G 25…………….…..253.1.2.2 Les méthodes non adoptées dans le protocole de purification……..……….......26

Table des matières3.1.2.2.1 Précipitation par l’éthanol 50%......................................................................263.1.2.2.2 Fractionnement par l’acétate d’éthyle………………………………...…….263.1.2.2.3 Précipitation par l’acétate neutre de plomb…………………………………263.1.2.2.4 Chromatographie sur résine échangeuse de cations Dowex 50W×8……….263.2 ANALYSE DES EXTRAITS PAR CHROMATOGRAPHIESUR COUCHE MINCE …………………………………………………………….….283.3 RENDEMENT DE PURIFICATION…………………….…………………….........…303.4 CARACTERISATION CHIMIQUE………………………….……….………….........303.5.1 PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES……………..………………..…………..…..303.5.2 NATURE CHIMIQUE………………………………..………………………...…….304 CONCLUSION ET DISCUSSION……………………………………………………….32DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE1 INTRODUCTION…………………………………………………….………...…………332 MATERIELS ET METHODES……….…………………………………………...…….332.1 MATERIELS………………………………………………………………….………..332.1.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION…………….………………..……...…….332.1.1.1 Les animaux à sang chaud : les souris……………………………………….…332.1.1.2 Les animaux à sang froid………………………….………….………...……....332.1.1.2.1 Les têtards de grenouille………………….……………………...………....332.1.1.2.2 Les poissons………………………………………………...………………342.1.1.3 Les insectes : les larves de moustique………………………………...……......342.1.2 LES PLANTES D’EXPERIMENTATION……………………………..…………..….342.1.3 LES GERMES UTILISES ET LES MILIEUX DE CULTURE……..…………………..342.1.3.1 Les germes utilisés………………………………………………...……….…...342.1.3.2 Les milieux de culture…………………………………………...………….......362.1.4 LES DISQUES POUR LES TESTS D’ANTIBIOGRAMME…….……………………..362.1.5 LA STERILISATION…………………………………………..……….……….…....362.2 METHODES……………………………………………………………….…...……....362.2.1 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX……..…………………..362.2.1.1 Chez la souris…………………………………………………...……………....362.2.1.1.1 Estimation de la toxicit.…………………………………………….……....362.2.1.1.2 Détermination de la DL 50 (24 h…………………………….……………….37

Table des matières2.2.1.2 Test sur les animaux à sang froid…………………………………...…………..372.2.1.2.1 Principe………………………….………………………………..……..…..372.2.1.2 2 Mode opératoire………………………………………………..……….......37Détermination de la concentration létale 50% (CL 50 24 h)……………...........382.2.1.2.2.1 Test sur les alevins de Baraoa…………………………………….….....382.2.1.2.2.2 Test sur les têtards…………………………………….………….……..382.2.1.3 Test sur les insectes : Expérience sur les larves de moustique………………....382.2.2 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX…………………….….392.2.2.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines……………...……….…392.2.2.2 Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules………………..……….392.2.2.2.1 Principe…………………………………………………………………..….392.2.2.2.2 Mode opératoire………………………………………...………………..…392.2.2.2.2.1 Trempage……………………………………………………….…..…..402.2.2.2.2.2 Germination………………………………………….………………....402.2.2.3 Effets sur la levée de la dominance apicale……………..….……..……………402.2.3 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LA CROISSANCEDES MICROORGANISMES………………………………………..……………...412.2.3.1 Spectre d’activité antimicrobienne des extraits……………..……..……….…..412.2.3.1.1 Principe………………….………………………...……………..…….…...412.2.3.1.2 Mode opératoire………………………………………...………….….…....422.2.3.2 Détermination de la CMI………………………………..……………......…….433 RESULTATS........................................................................................................................433.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX…………………………………………………….….433.1.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD……………….……………….…..433.1.1.1 Etude des effets sur les souris………………………………………..…………433.1.1.1.1 Description des symptômes d’intoxication………………………………....433.1.1.1.2 Détermination de la DL 50 (24 h)……………………….……………………443.1.2 EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID…………………………………..….453.1.2.1 Effets de l’extrait brut sur les têtards..………………………………...……..…453.1.2.2 Effets de l’extrait brut sur les alevins de Baraoa……..…………………...…....463.1.2.3 Effets de l’extrait brut sur les larves de moustique……..…………...………….473.2 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX…………..……………………....473.2.1 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LA GERMINATION DES GRAINES….……....47

Table des matières3.2.2 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LA CROISSANCEDES JEUNES PLANTULES…………………………..……………………................483.2.3 EFFETS DES EXTRAITS SUR LA LEVEE DE LA DOMINANCE APICALE…….......533.3 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES……….…………….…54Spectre d’activité antimicrobienne des extraits…………………………….…544 DISCUSSION ET CONCLUSION…………………………………………………….…55CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES……………………………………...58REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES..………………………………..……………..…59ANNEXES

DédicaceiDédicaceCe mémoire est dédié :A Dieu qui nous a fourni la force, la santé et le courage pour la réalisation de cetravail;A la mémoire de mon grand père qui aurait voulu être parmi nous en ce jour ;A mes parents, pour vos soutiens moral et financier, vos conseils qui n’ont pas étévains, que vous trouviez ici le fruit de vos sacrifices et de votre patience ;A mes frères et sœurs, cousins et cousines, pour toute votre affection etcompréhension ;A mon oncle, Dr RABARISON Solo E. et ma tante, VONINAVOKO Marie C. pour leursoutien matériel et financier ;A toute la famille, que ce mémoire témoigne des efforts que vous avez octroyés pendanttoute ma vie estudiantine ;A tous mes amis, pour votre collaboration et vos conseils qui m’ont été chers, que cemémoire garde ces souvenirs inoubliables ;A tous ceux qui me sont chers.Merci !

RemerciementsiiREMERCIEMENTSLe présent travail a été réalisé aux LABASM (Laboratoire de Biochimie Appliquéeaux Sciences Médicales) et LMA (Laboratoire de Microbiologie) du Département deBiochimie fondamentale et appliquée de la Faculté des sciences de l’Universitéd’Antananarivo.Nous tenons à remercier Monsieur le Professeur JEANNODA Victor, Chef deDépartement de Biochimie fondamentale et appliquée et Chef de LABASM, responsable dela formation 3 ème cycle de biochimie, pour nous avoir accueilli dans son laboratoire, pour sonencadrement, son soutien, ses conseils et son aide dans la réalisation et la finition de cemémoire, malgré ses lourdes et multiples responsabilités. Qu’il trouve ici l’expression denotre considération.Nos sincères remerciements vont à l’endroit de Madame le Docteur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle Aurore Doll, co-encadreur de notre stage, pour nous avoirconseillé et guidé tout au long de notre stage ainsi que pour la qualité de son encadrement aucours de la réalisation de ce mémoire, malgré ses nombreuses occupations.Madame le Professeur ANDRIANARISOA Blandine qui nous a fait l’honneurd’accepter de présider le jury de ce mémoire, malgré ses multiples tâches ; qu’elle en soitremerciée.Nous remercions Monsieur le Docteur RAVONINJATOVO Marc et Monsieur leDocteur RAMAMONJISOA Daniel d’avoir aimablement accepté d’apporter leur compétencedans le jugement de ce travail, malgré leurs emplois du temps chargés.Notre profonde gratitude va à Monsieur le Docteur RANDRIANARIVO HanitraRanjana et à Madame RAKOTOBE Lolona, qui ont fait preuve de beaucoup d’amitié à notreégard, pour tout ce qu’ils ont fait pour nous en particulier pour l’encadrement efficace qu’ilsnous ont prodigués au cours de notre stage.Nous adressons également nos remerciements à tous nos collègues pour l’entraide quin’a pas été vaine.Enfin, tous ceux qui, de près ou de loin, ont participé à la réalisation du présent travail,qu’ils trouvent ici l’expression de notre profonde reconnaissance, en particulier toute lafamille et tous les amis qui ont bien voulu apporter leur aide dans l’élaboration de cemémoire.

GlossaireiiiGLOSSAIREAntibiotique : substance capable d’empêcher le développement des microorganismesAntispasmodique : qui combat les spasmes (contractions musculaires involontaires, intenseset passagères)Breuvage : boisson spécialement composée, médicamenteuse ou nonCholérétique : qui augmente la quantité de bile sécrétée par le foieColique : violente douleur abdominaleContorsion abdominale : étirement de l’animal avec des torsions du corps (traduction d’unedouleur abdominale)Convulsions cloniques : contractions saccadées, brèves et répétées à courts intervallesCosmétique : substance utilisée pour l’hygiène et la beauté de la peau, des cheveuxDécoction : procédé consistant à faire bouillir une substance dans un liquide, pour en extraireles principes solublesDépuratif : propre à purifier l’organismeDiarrhée : évacuation fréquente de selles liquidesDiurétique : qui augmente la sécrétion urinaireDysenterie : maladie infectieuse contagieuse, caractérisée par l’émission de selles fréquentes,abondantes, glaireuses, sanglantes et douloureusesExophtalmie : saillie du globe oculaire hors de son orbiteFébrifuge : qui fait baisser la fièvreGargarisme : action de rincer l’arrière-bouche et la gorge avec un liquide médicamenteuxHyperhémie : rougissement des oreillesLaxatif : médicament utilisé pour évacuer les sellesNévralgie : douleur siégeant sur le trajet d’un nerfPellicules : petites écailles produites par la desquamation du cuir cheveluPharyngite : inflammation de la muqueuse pharyngéePneumonie : inflammation aiguë du poumon causée en général par le pneumocoquePolyurie : émission d’une quantité d’urine supérieure à la normaleStomatite : inflammation de la muqueuse buccaleTonique : qui augmente la vigueur de l’organisme (fortifiant, reconstituant, stimulant)Vulnéraire : qui guérit les blessuresXérophytique : adapté à la sècheresse

AbréviationsivABREVIATIONSANP : acétate neutre de plombB/A/E : Butanol/Acide acétique/EauCCM : chromatographie sur couche minceCL 50 : concentration létale 50%CMI : concentration minimale inhibitriceDa : daltonDL 50 : dose létale 50%EB : extrait bruth : heurei.p. : intrapéritonéaleIPM : Institut Pasteur de MadagascarLABASM : Laboratoire de Biochimie appliquée aux sciences médicalesLMA : Laboratoire de Microbiologie appliquéeM : molairemin : minuteMPE : Maison du petit élevageN : normalp/p : poids par poidsp/v : poids par volumepH : pouvoir hydrogènetr/min : tours par minuteUV : ultravioletv/v : volume par volume°C : degré Celsius

Liste des figuresvLISTE DES FIGURESPagesFigure 1 : Feuilles et fruits de Chassalia bojeriana…………………………………………...8Figure 2 : Schéma récapitulatif des procédés d’extraction et de purificationdes principes toxiques de Chassalia bojeriana………...……………………….27Figure 3 : Chromatogramme récapitulatif montrant l’évolution de l’homogénéitédes différents extraits obtenus lors de l’extraction et de la purification…….….28Figure 4 : Chromatogramme récapitulatif montrant l’évolution de l’homogénéitédes différents extraits …………………………...………………………...……29Figure 5 : Détermination de la DL 50 (24 h) par la méthode graphiquede REED et MUENCH (1938)…………………………………………………45Figure 6 : Schéma récapitulatif des différentes étapes de l’étude des effets de l’extraitbrut à différentes concentrations sur la croissance des jeunes plantules….…….49Figure 7 : Croissance des épicotyles de haricot en fonction du trempage……………………50Figure 8 : Croissance des hypocotyles de haricot en fonction du trempage…………………50Figure 9 : Croissance des épicotyles de riz en fonction du trempage………………......……51Figure 10 : Croissance des hypocotyles de riz en fonction du trempage………………….…51Figure 11 : Effets de l’extrait brut à différentes concentrations sur le développementdes épicotyles de haricot…………………………………………………….….52Figure 12 : Effets de l’extrait brut à différentes concentrations sur le développementdes hypocotyles de haricot……………………………………….………….….52Figure 13 : Effets de l’extrait brut à différentes concentrations sur le développementdes épicotyles de riz…………….…………………………………...………….53Figure 14 : Effets de l’extrait brut à différentes concentrations sur le développementdes hypocotyles de riz…………………………….…………………………….53Figure 15 : Effets des différentes substances sur la croissance des bourgeons axillairesdes jeunes plantules de petit pois………………………………...………….….54

Introduction générale 3- Menabea venenata (ASCLEPIADACEE) (PERNET, 1957).La plupart des plantes médicinales ne sont pas toxiques et on peut les prendre avecmoins de risque que n’importe quel médicament de synthèse chimique. Toutefois, chacun saitqu’il y a des plantes vénéneuses (PAMPLONA-ROGER, 1999).A Madagascar, la flore malgache, quoique exceptionnellement riche, n’a fait quel’objet de rares travaux sous différents aspects : alimentaire, médicinal et toxique (PERNET,1957).A titre d’exemple, les amandes de Tangena ont été utilisées pour les maladies de cœurà raison de 0,05 à 0,50 g de produit, ce qui n’est pas toujours sans danger vu la forte toxicitéde celui-ci (PETIT-JEAN, 1993). L’usage inadéquat des plantes médicinales peut produiredes intoxications graves. Inversement, même pour quelques-unes des plantes qualifiéestoxiques, leur utilisation correcte peut guérir de graves maladies, voire sauver des vies. Unemême plante peut tuer ou guérir. « Celui qui ne connaît pas les plantes ne pourra juger aveccertitude de leurs vertus », disait le naturaliste et médecin suédois CARL VON LINNE (1707-1788).Ainsi, pour qu’une plante ait des effets médicaux salutaires, il faut :- que les préparations faites à partir d’elle, fassent l’objet d’un dosage précis,- qu’elle soit bien indiquée contre la maladie dont souffre celui qui la prend. La mêmedose qui est curative pour un individu malade peut avoir des effets toxiques pour un individusain. Les doses doivent être bien calculées pour se maintenir dans la marge thérapeutique trèsétroite de ces plantes, puisque toute dose toxique est juste un peu supérieure à la dosethérapeutique. (PAMPLONA-ROGER, 1999).C’est la raison pour laquelle, le laboratoire de Biochimie fondamentale et appliquée del’Université d’Antananarivo a orienté ses travaux de recherche vers l’étude chimique ettoxicologique des principes actifs de plantes, au sein de son unité de recherche enToxicologie. Plusieurs plantes ont ainsi été étudiées. A titre d’illustration, on peut citer :- des CONNARACEES, Cnestis glabra et Cnestis polyphylla (JEANNODA, 1986) ;- une EUPHORBIACEE, Croton mongue (RALISON, 1987) ;- des FABACEES, Albizia odorata (RAJEMIARIMOELISOA, 2000) et Albiziaarenicola (RANDRIANARIVO, 1996).- une GENTIANACEE, Tachiadenus longiflorus (RAKOTO-RANOROMALALA,1989) ;- une AMARANTHACEE, Henonia scoparia (RAMAHAFALY, 2002) ;

Introduction générale 4- des LAURACEES, Ocotea madagascariensis (RANDRIAMAHAVALISOA,2003) et Ravensara anisata (RAHANTARINORO, 2004) ;- une SAPOTACEE, Mimusops commersii (RAMAMONJISOA-RAKOTOARIVELO, 2004) ;- une OLACACEE, Olax lanceolata (RAHELINIAINAMANDIMBY, 2003).L’étude de la toxicité des plantes médicinales permet de connaître les composés quisont nocifs voire mortels qu’elles contiennent alors qu’elles sont utilisées par la plupart desgens pour soulager des maux.Les études à entreprendre sur les plantes médicinales s’accompagnent de prospectionsd’éventuels principes toxiques et ont pour but :- de vérifier la véracité des dires lors de l’enquête ethnobotanique effectuée surterrain ;- de chercher les éventuels effets secondaires indésirables entraînés parl’administration desdits médicaments ;- de procéder aux tests de toxicité et de chercher s’il existe d’autres propriétéspharmacologiques concernant la plante utilisée et aussi de comprendre l’origine de la toxicitéc’est-à-dire si elle provient de la plus forte concentration des principes actifs ou d’autrescomposés.La famille des RUBIACEES est d’une très grande importance médicinale etcommerciale et est richement représentée à Madagascar. Un très grand nombre d’espècescontiennent des alcaloïdes actifs, des matières tannantes ou colorantes et sont très peutoxiques, à l’instar de Danaïs fragrans Comm. ou Tamboronaombe ou Tamboromantrina. Eneffet, la racine de cette liane est employée en décoction vulnéraire et fébrifuge, tonique etstomachique. L’écorce de la tige est employée contre les infections cutanées. Le principe actifisolé par HECKEL et SCHLAGDENHAUFFER, est un pigment glucosidique, la danaïne(PERNET, MEYER, 1957).Malgré les études déjà effectuées sur les Rubiacées malgaches, beaucoup d’autresespèces restent encore à explorer vu qu’elles constituent un ensemble végétal encore malconnu (ANDRE et coll., 1976).Pour notre part, notre choix s’est fixé sur une Rubiacée malgache : Chassaliabojeriana, connue sous le nom de « maroampototra », pour les raisons suivantes :- Chassalia bojeriana possède des vertus médicinales intéressantes, car elle estutilisée, en décoction, pour traiter des maladies du foie et aussi pour le traitement de la goutte.Elle est aussi utilisée pour apaiser la fatigue.

Introduction générale 5- C’est une plante endémique de Madagascar.- A notre connaissance, Chassalia bojeriana n’a pas encore fait l’objet d’étudechimique ou toxicologique approfondie.- Une toxicité a été mise en évidence dans ses feuilles, lors des études préliminaireseffectuées.Le présent travail a pour but de purifier les principes actifs présents dans les feuilles deChassalia bojeriana et aussi d’étudier les propriétés physico-chimiques des extraits ainsiobtenus.Les travaux comprennent deux grandes parties :- la première ou étude chimique traitera la purification et la caractérisation desprincipes actifs.- la seconde partie ou étude toxicologique sera consacrée aux résultats des teststoxicologiques des principes actifs des extraits de feuilles de Chassalia bojeriana.Il est à noter que les matériels et méthodes sont mentionnés dans chaque partie etqu’une introduction générale précède les deux parties. Enfin, une conclusion générale terminele travail avec les perspectives.

PREMIERE PARTIE :

Etude chimique 61. INTRODUCTIONA notre connaissance, le matériel d’étude Chassalia bojeriana n’a pas encore faitl’objet d’une étude chimique approfondie. La toxicité des feuilles de cette plante a été mise enévidence à l’aide des tests préliminaires sur des souris. Dans cette étude, nous avons alorsessayé :- d’établir un procédé d’extraction du ou des principe(s) toxique(s) présent(s) dans lesfeuilles ;- de mettre au point un protocole de purification permettant d’obtenir un extraitpartiellement purifié ;- d’étudier les propriétés physico-chimiques du ou des principe(s) toxique(s) ;- enfin, de rechercher sa ou leur nature chimique.2.1 MATERIELS2. MATERIELS ETMETHODES2.1.1 LE MATERIEL VEGETAL2.1.1.1 Position systématique :Règne : VEGETALEmbranchement : SPERMAPHYTESClasse : DICOTYLEDONESOrdre : RUBIALESFamille : RUBIACEAESous-famille : RUBIOIDEAETribu : MORINDEAESous-tribu : PSYCHOTRIINAEGenre : ChassaliaEspèce : bojerianaNom vernaculaire : Maroampototra.La plante a été identifiée à l’herbarium du Parc Botanique et Zoologique deTsimbazaza (PBZT), sous la référence en herbier n° Pete LOWRY 4339.

Etude chimique 72.1.1.2 Description botanique2.1.1.2.1 Description du genre ChassaliaLe genre Chassalia appartient à la famille des Rubiacées. Il présente des feuillessimples, entières, opposées ou plus rarement verticillées avec stipules. Les fleurs,hermaphrodites et régulières, sont groupées en inflorescences très variées. Le calice est soudéà l’ovaire avec une corolle épigyne, gamopétale, plus ou moins tubuleuse à lobes tordus,valvaires ou imbriqués. Les étamines sont insérées sur le tube de la corolle, alternipétales, àanthères ouvrant par des fentes longitudinales. Les ovaires sont infères, généralement à deuxloges, à placentation basale, axile ou apicale et sont uniovulés ou pluriovulés à style terminal,généralement grêle. Les fruits sont très variables, drupacés, bacciformes ou capsulaires. Legenre Chassalia présente des ovules dressés à pétales valvaires.2.1.1.2.2 Description de l’espèce Chassalia bojerianaChassalia bojeriana (figure 1, p.8) est un arbuste de 2 à 3 m de hauteur dont lesbranches et les tiges sont glabres. Les stipules interpétiolaires sont partiellement fusionnées àla base, bifides, petites et ovales, pubescentes. Les racines adventives sur les entre-noeudssont absentes. Les feuilles sont opposées, ovales, lancéolées ou elliptiques, à bases obtuses,non décurrentes à face supérieure glabre et face inférieure glabre ou pubescente, clairsemée.Elles sont pétiolées à nervures latérales éminentes, de 6 à 10 paires.

Etude chimique 8Figure 1 : Chassalia bojeriana : Rameaux et fruits.2.1.1.3 Distribution géographique de l’espèce Chassalia bojerianaLa plante a été trouvée dans les forêts humides de la côte est, à Maroantsetra dela région Analanjirofo, sur la péninsule Masoala de la région Sava, à Anjozorobe de la régionAnalamanga et enfin sur le massif d’Andringitra des régions Horombe et Haute Matsiatra.2.1.1.4 Utilisation empirique de la planteLa plante est utilisée en décoction, pour traiter des maladies du foie et aussi pour letraitement de la goutte. Elle est aussi utilisée pour apaiser la fatigue.Environ une poignée de feuilles de cette plante est bouillie dans environ 1 l d’eau.L’ébullition se poursuit jusqu’à réduction du volume initial à sa moitié. La décoction obtenueest prise à raison d’une tasse par jour et peut être conservée pendant environ une semaine.2.1.1.5 Date et lieu de récolteLe matériel végétal a été récolté le 10 Août 2007 dans la forêt d’Antsaralahy duFokontany Antsahabe-Est, dans le district d’Anjozorobe de la région Analamanga.

Etude chimique 92.1.1.6 Préparation et conservation du matériel végétalLes feuilles de Chassalia bojeriana sont séchées pendant quelques semaines puisbroyées au moyen d’un broyeur de marque Blender (Robot Coupe GT 550). La poudre defeuilles est conservée dans des bocaux bien secs.2.1.2 LES PRODUITS CHIMIQUESLa plupart des produits chimiques utilisés dans toutes les expérimentations sont desproduits pour analyse de marque Merck et Prolabo. Le support utilisé pour lachromatographie sur couche mince (CCM) est le gel de silice 60F 254 Merck étalé sur desfeuilles plastiques de dimensions 20 × 20 cm. Le gel, d’épaisseur 0,2 mm contient unindicateur fluorescent.2.2 METHODES2.2.1 METHODES D’EXTRACTION DES PRINCIPES ACTIFS2.2.1.1 Extraction à froidLe matériel végétal sous forme de poudre est mis en suspension dans le solvantd’extraction (eau distillée ou éthanol absolu ou mélange hydroéthanolique 75%), selon lerapport 1/10 (p/v) (1 g de poudre additionné de 10 ml de solvant d’extraction). La suspensionest homogénéisée par agitation magnétique pendant 3 heures à la température ambiante, puislaissée macérer à +4°C pendant une nuit.Le macérat est ensuite agité pendant 30 minutes avant d’être filtré sur quatre épaisseursde gaze pour éliminer le marc. Le filtrat ainsi obtenu est centrifugé à 12000 tours/minutependant 20 minutes à la température ambiante au moyen d’une centrifugeuse de paillasseBremse (modèle T52). Le surnageant est récupéré et concentré par évaporation du solvantd’extraction au moyen d’un évaporateur rotatif (voir méthode de concentration au paragraphe2.2.3, p.15) tandis que le culot est écarté.2.2.1.2 Extraction à chaudLa poudre de feuilles est mélangée au solvant d’extraction (eau distillée ou mélangehydroéthanolique 75%) dans le rapport 1/10 (p/v), c’est-à-dire 1g de poudre pour 10ml desolvant d’extraction. Le mélange obtenu est soumis à un chauffage à reflux à 96°C sousagitation magnétique pendant 3 heures. La suspension obtenue est ensuite laissée macérerpendant une nuit à +4°C.

Etude chimique 10Le macérat est agité pendant 30 minutes et filtré sur quatre épaisseurs de gaze pourécarter le marc. Le filtrat obtenu est centrifugé à 12000 tours /minute pendant 20 minutes, à latempérature ambiante, à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse Bremse (modèle T52). Lesurnageant est concentré par évaporation et le culot est écarté.2.2.2 METHODES DE PURIFICATION2.2.2.1 Précipitation par l’éthanol 50%2.2.2.1.1 PrincipeLa méthode est basée sur la diminution du pouvoir dissolvant de l’eau par ajout d’unsolvant organique miscible mais moins polaire tel que l’éthanol. Ce qui entraîne uneprécipitation de certaines substances initialement solubles en milieu aqueux (MAHUZIER etHAMON, 1986).2.2.2.1.2 Mode opératoireUn volume bien déterminé d’éthanol absolu est ajouté goutte à goutte à l’extrait àtraiter de même volume, sous une agitation magnétique continue. Le mélange est ensuitelaissé macérer à +4°C pendant 15 minutes et le précipité apparu est éliminé par centrifugationà 12000 tours/minute pendant 15 minutes à l’aide d’un centrifugeuse de marque Jouan(modèle TH 12). Après récupération du surnageant, le solvant contenu dans celui-ci estéliminé par évaporation au moyen d’un évaporateur rotatif. La concentration se poursuitjusqu’à obtention du volume initial de l’extrait à traiter.2.2.2.2 Fractionnement par l’acétate d’éthyle2.2.2.2.1 PrincipeC’est une méthode permettant d’extraire une substance en solution aqueuse partransfert de celle-ci dans une phase organique non miscible (MAHUZIER et HAMON, 1986 ;KAMOUN, 1987).2.2.2.2.2 Mode opératoireUn volume d’extrait à traiter et le même volume d’acétate d’éthyle sont introduits dansune ampoule à décanter. Le mélange est agité énergiquement et laissé au repos jusqu’àdécantation totale des deux liquides. Ces derniers forment deux phases bien distinctes : d’unepart, la phase supérieure organique et d’autre part, la phase inférieure aqueuse.

Etude chimique 11Les deux phases sont séparées et l’opération est répétée deux fois en renouvelant àchaque fois le solvant organique.Les trois phases organiques sont rassemblées et débarrassées du solvant puisconcentrées jusqu’au volume initial de l’extrait après addition d’un grand volume d’eau.La phase aqueuse subit une évaporation pour la débarrasser de l’acétate d’éthylerésiduel.2.2.2.3 Fractionnement par le n-butanol2.2.2.3.1 Principe :La méthode est basée sur la distribution d’un soluté entre deux solvants non misciblestels que le n-butanol et l’eau distillée (KAMOUN, 1991 ; MAHUZIER, 1990).2.2.2.3.2 Mode opératoireLa technique est la même qu’avec l’acétate d’éthyle, en remplaçant seulement cedernier par le n-butanol. Ainsi, le mélange volume à volume d’extrait à traiter et de n-butanolest secoué vigoureusement dans une ampoule à décanter, puis laissé au repos jusqu’àdécantation totale, donnant ainsi une phase supérieure butanolique ou phase organique et unephase inférieure aqueuse. La phase organique est recueillie, tandis que la phase aqueuse estencore soumise à deux autres fractionnements successifs.Les phases organiques sont réunies et débarrassées du solvant par évaporation aprèsaddition d’un grand volume d’eau, puis concentrées jusqu’à obtention du volume initial del’extrait.La phase aqueuse est traitée de la même façon que pour le fractionnement par l’acétated’éthyle.2.2.2.4 Précipitation par l’acétate neutre de plomb2.2.2.4.1 PrincipeL’acétate neutre de plomb (ANP) est un sel de métal lourd ayant la capacité deprécipiter sous forme de sels insolubles de nombreux composés tels que les polysaccharides,les protéines, les acides nucléiques et les acides organiques et qui pourraient gêner lapurification.

Etude chimique 122.2.2.4.2 Mode opératoireUn volume déterminé d’une solution aqueuse d’acétate neutre de plomb à 20% (p/v),est ajouté progressivement, sous agitation magnétique, à l’extrait à traiter. Le précipité forméqui donne au mélange un aspect trouble, est éliminé par centrifugation à 12000 tours/minutependant 15 minutes à l’aide d’une centrifugeuse Jouan (TH12). Le surnageant est recueillialors que le culot est éliminé. L’opération est répétée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation deprécipité dans le surnageant.L’excès de plomb dans le surnageant issu du dernier traitement par la solution d’ANPest précipité par addition d’une solution aqueuse de phosphate disodique 10% (p/v). Lemélange est de nouveau centrifugé afin d’écarter le précipité éventuellement formé. Lesurnageant est recueilli et concentré par évaporation, jusqu’au volume initial de l’extrait dedépart.2.2.2.5 Dialyse2.2.2.5.1 PrincipeLa dialyse est une technique permettant la séparation des substances selon leur taille,en utilisant leur capacité respective à franchir les pores calibrés d’une membrane qui joue lerôle de tamis. Pour cela, une membrane à perméabilité sélective appelée boudin à dialyse ousac à dialyse est utilisée (AUDIGIE et coll., 1982 ; MAHUZIER et HAMON, 1986 ;KAMOUN, 1987).2.2.2.5.2 Mode opératoireLe boudin ou sac à dialyse est constitué de cellophane de forme cylindrique (marqueCellu Sep, modèle T 2 ) de 32 mm de largeur à plat. Celle utilisée dans cette étude a un seuil defiltration de 6000 à 8000 Da.Cette membrane permet de séparer les petites molécules des grosses, en induisantdeux phénomènes :• La diffusion ou dialyse, c’est-à-dire que les solutés contenus dans le boudintraversent la membrane en diffusant vers le liquide de contre-dialyse.Plusieurs paramètres peuvent influencer la vitesse de la dialyse. On peut citer :-le diamètre des pores de la membrane,-la température,-le pH,

Etude chimique 13-le temps de contact,-la différence de concentration entre les deux compartiments.• L’osmose, qui est un mouvement d’eau, de la solution la plus diluée (liquide decontre-dialyse) vers la solution la plus concentrée (extrait à dialyser).2.2.2.5.3 Préparation de la membrane de dialyseLa membrane de dialyse est bouillie trois fois dans de l’eau distillée pendant cinqminutes, en renouvelant chaque fois l’eau distillée. Cette opération permet d’éliminer lacouche protectrice du boudin, formée de glycérine, de métaux lourds et de composés sulfurés.La membrane est ensuite conservée à +4°C après refroidissement dans la dernière eaubouillie.Avant chaque utilisation, il est nécessaire de rincer la membrane avec de l’eaudistillée.2.2.2.5.4 Mise en route de la dialyseLe boudin à dialyse est rempli avec l’extrait à traiter au tiers de son volume, demanière à laisser un espace suffisant pour permettre les échanges. Cette précaution est prisepour éviter l’éclatement de la membrane par augmentation de volume de l’extrait au cours dela dialyse.Après élimination des bulles d’air dans le boudin, celui-ci est immergé complètementdans le liquide de contre-dialyse qui est l’eau distillée, de volume égal à environ 100 fois levolume de l’extrait à traiter. Ce liquide de contre-dialyse est soumis à une douce agitationmagnétique pour éviter la formation de gradient de concentration des substances diffusiblesautour du boudin. D’autre part, le liquide de contre-dialyse est renouvelé deux fois en 24heures pour accélérer les échanges. A la fin de ces opérations, les dialysats (liquides àl’extérieur du boudin) et l’adialysat (liquide à l’intérieur du boudin) sont chacun concentrésjusqu’au volume de l’extrait de départ.2.2.2.6 Chromatographie sur résine échangeuse d’ions2.2.2.6.1 PrincipeUne résine échangeuse d’ions est une matrice insoluble, polymère organiquesynthétique, porteur de groupements fonctionnels capables de fixer certaines substances selonleurs charges. Ces substances peuvent êtres échangées.

Etude chimique 14Dans notre étude, une résine échangeuse cationique forte, la résine sulfonique Dowex50W × 8, est utilisée.2.2.2.6.2 Mode opératoire2.2.2.6.2.1 Préparation de la résineLa résine préalablement dégazée est coulée dans une colonne de dimensions choisies.Ensuite, elle est mise sous forme H + par percolation d’acide chlorhydrique (HCl) 1N (troisvolumes de colonne). Pour éliminer l’excès d’ions H + , un lavage à l’eau distillée (troisvolumes de colonne) est effectué.2.2.2.6.2.2 Dépôt de l’échantillonL’échantillon est déposé à la surface d’un disque de papier filtre, posé sur la surfacesupérieure de la résine. Les substances non adsorbées sont lavées à l’eau distillée (troisvolumes de colonne) tandis que les substances retenues sont éluées par une solutiond’ammoniaque (NH 4 OH) 1N (trois volumes de colonne).2.2.2.6.2.3 Régénération de la résineAprès chaque utilisation, la résine est régénérée par des lavages successifs :-au chlorure de sodium 1M ;-à l’eau distillée ;-à la soude 1N jusqu’à égalité du pH de l’éluat et de celui de l’éluant ;-à l’eau distillée jusqu’à un pH voisin de 7,5 ;-à l’acide chlorhydrique 1N jusqu’à égalité du pH de l’éluat et de l’éluant ;-à l’eau distillée jusqu’à obtention d’un pH voisin de 6,5.La résine ainsi régénérée est alors conservée au réfrigérateur dans des flacons teintés.2.2.2.7 Chromatographie d’exclusion sur colonne de Sephadex G 252.2.2.7.1 PrincipeLa perméation de gel utilise les différences de forme et de taille moléculaire. Le gelSephadex utilisé est préparé par réticulation d’un polymère anhydroglucosé : le dextrane. Il seprésente sous forme de grains poreux qui gonflent beaucoup dans l’eau. Chaque type de gelest caractérisé par un domaine de fractionnement, lui-même défini par la taille des pores des

Etude chimique 15grains. Celui du gel Sephadex G 25 utilisé est compris entre 1500 et 5000 (SQUIRE, 1964 ;GIDDINGS, 1966).Les molécules dont la taille est supérieure à la limite d’exclusion, c’est-à-diresupérieure au diamètre des pores, ne peuvent pénétrer dans le gel. Elles migrent dans la phaseaqueuse externe aux grains de gel et quittent les premières le lit de gel. Par contre, lesmolécules de petite taille pénètrent dans le gel et leur migration est ainsi retardée. Lesmolécules quittent ainsi la colonne de Sephadex par ordre de masse moléculaire décroissante.La colonne peut être réutilisée lorsque les molécules de petite taille ont toutes quitté legel.L’utilisation de Sephadex présente les avantages suivants :-il ne présente pas de spécificité ;-outre la séparation chromatographique, il permet de dessaler ou de faire uneapproximation du poids moléculaire ;-il est utilisé en milieu aqueux, ce qui rend la méthode plus rapide et plus économique.2.2.2.7.2 Mode opératoireLe gel est mis à gonfler dans de l’eau distillée à la température ambiante pendant 3heures. Ensuite, il est dégazé sous vide et coulé dans une colonne en plastique de dimensionsvoulues. La surface supérieure du gel est stabilisée par une rondelle de papier filtre. Aprèséquilibrage par passage de trois fois le volume total du gel d’eau distillée, l’étape préparatoireest terminée et l’échantillon est déposé avec précaution à la surface du gel.Les différentes substances sont éluées par lavage à l’eau distillée et par gravité. Lesfractions sont récoltées au moyen d’un collecteur de fractions LKB.Un entretien particulier du Sephadex n’est pas nécessaire après son utilisation. Lacolonne est immédiatement prête pour un autre emploi après lavage avec un grand volumed’eau distillée.2.2.3 METHODE DE CONCENTRATIONToutes les opérations de réduction de volume d’extrait et d’évaporation de solvants’effectuent au moyen d’un évaporateur rotatif Heidolph à 60°C. La pression est réduite àl’aide d’une pompe à vide.

Etude chimique 162.2.4 CALCUL DU RENDEMENTL’extrait obtenu à chaque étape de purification ou d’extraction est évaporé à sec. Lerésidu obtenu est pesé. Le rendement est donné par le pourcentage du poids de ce résidu parrapport à celui du matériel de départ.Poids du résidu d’évaporation à sec (g)Rendement (%) = × 100Poids du matériel végétal de départ (g)2.2.5 METHODES D’ANALYSE2.2.5.1 Chromatographie sur couche mince(RANDERATH, 1962 ; VERNIN, 1970 ; AUDIGIE et coll., 1982 ; MAHUZIER etHAMON, 1986 ; BOREL et RANDOUX, 1987)2.2.5.1.1 PrincipeLa chromatographie sur couche mince (CCM) est une méthode de microanalyseimmédiate basée sur deux mécanismes fondamentaux : l’adsorption et le partage. Elle utiliseun support ou adsorbant qui, d’une part, fixe les molécules à analyser par des liaisons noncovalentes, et d’autre part, retient un premier solvant tel que l’eau, non miscible à un secondsolvant. La séparation des substances est fonction de leur affinité pour l’adsorbant d’une partet de leur solubilité dans les solvants utilisés d’autre part. Les substances à séparer vont alorsse partager entre les deux phases.2.2.5.1.2 Mode opératoire2.2.5.1.2.1 Dépôt des échantillonsLes extraits à analyser sont déposés sur une plaque de silice découpée aux dimensionsvoulues (voir paragraphe 2.1.2, p.9). Ils sont déposés à l’aide d’un capillaire sous forme detirets horizontaux de 7 mm sur une ligne horizontale située à 1,5 cm du bord inférieur. Lesdépôts des différents échantillons sont espacés de 6 mm. Les deux tirets se trouvant aux deuxextrémités de la ligne de dépôt sont placés à 1,3 cm des bords latéraux de la plaque. Chaquedépôt est immédiatement séché à l’aide d’un séchoir à main.2.2.5.1.2.2 Développement du chromatogrammeLa plaque préparée est introduite dans une cuve à chromatographie Desaga au fond delaquelle se trouve le solvant de migration et dont l’atmosphère a été préalablement saturée par

Etude chimique 17les vapeurs du solvant de migration. Il s’agit d’un mélange constitué par 60 parties de n-butanol ; 20 parties d’acide acétique et 20 parties d’eau distillée, en poids : B/A/E (60/20/20)(p/p/p). C’est une chromatographie ascendante qui est arrêtée lorsque le front de solvant setrouve à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque. Celle-ci est alors sortie de la cuve, puis séchéepar évaporation du solvant par un courant d’air chaud, à l’aide d’un séchoir à main.2.2.5.1.2.3 Révélation du chromatogrammeLa révélation permet de mettre les substances incolores en évidence. Deux méthodesde révélation ont été adoptées :2.2.5.1.2.3.1 Examen sous lampe ultraviolette (UV)Certains produits deviennent visibles grâce à l’absorption de la lumière ultraviolette.Ils apparaissent sous forme de bandes ou spots sous rayons ultraviolets à des longueursd’onde caractéristiques : 254 nm et 366 nm.2.2.5.1.2.3.2 Réactions coloréesNombreux sont les composés qui peuvent être révélés au moyen de réactifs trèsgénéraux comme le réactif à la vanilline sulfurique. Le réactif est pulvérisé sur la plaque. Lessubstances apparaissent ainsi sous forme de taches colorées qui peuvent être trèsclaires, d’où la nécessité de chauffer la plaque à 100°C. On obtient alors des taches plusfoncées.La composition de ces réactifs est mentionnée en annexe I2.2.5.2 Criblage phytochimique2.2.5.2.1 Préparation des extraits à testerToutes les réactions de détection ont été effectuées soit directement à partir de lapoudre de feuilles, soit à partir du résidu d’évaporation à sec de l’extrait à analyser. Différentsextraits sont utilisés pour les tests de détection des diverses substances.2.2.5.2.1.1 Extrait aqueux2 g de poudre de feuilles ou de résidu d’évaporation à sec d’extrait à tester sontdélayés dans 40 ml d’eau distillée. Le mélange obtenu est chauffé jusqu’à ébullition puis

Etude chimique 18laissé macérer pendant son refroidissement. Le décocté est filtré et le filtrat ainsi obtenuconstitue l’extrait aqueux.2.2.5.2.1.2 Extrait hydroéthanoliqueLa poudre ou le résidu d’évaporation à sec de l’extrait à tester, pesant 1g, est délayédans 10ml d’éthanol à 75%. Le mélange est laissé macérer pendant une nuit à +4°C, puisfiltré. Le filtrat obtenu correspond à l’extrait hydroéthanolique.2.2.5.2.1.3 Extrait chloroformiqueUn gramme de poudre ou de résidu est mis en suspension dans 10 ml de chloroforme.La suspension est laissée macérer pendant une nuit, puis filtrée après agitation. Le filtratconstitue la solution chloroformique.2.2.5.2.1.4 Extrait acideLa poudre ou le résidu d’évaporation à sec de l’extrait à tester, pesant 1g, est laissémacérer pendant une nuit dans 10 ml de HCl 2N. Le liquide obtenu après filtration du macératest l’extrait acide.2.2.5.2.2 Principes et méthodes2.2.5.2.2.1 Alcaloïdes(DALTON, 1979 ; CORDELL, 1981 ; BRUNETON, 1993).Les alcaloïdes sont des composés azotés faiblement basiques issus principalement desvégétaux. Leurs structures sont relativement simples et ils ont différents effets physiologiquessur l’organisme humain.La méthode de détection des alcaloïdes consiste en leur précipitation par des réactifsd’une assez grande spécificité. Ces réactions sont fondées sur la capacité qu’ont les alcaloïdesà se combiner avec les métaux et les métalloïdes : mercure, tungstène, iode, bismuth…Quatre tubes à essai sont nécessaires pour la manipulation. Ils contiennent chacun 1mld’extrait acide. Les trois premiers sont utilisés respectivement pour les tests de MAYER, deDRAGENDORFF et de WAGNER. Le 4 ème tube sert de témoin.La composition de ces réactifs est donnée en annexe II

Etude chimique 192.2.5.2.2.1.1 Test de MAYERLe premier tube contenant l’extrait acide est additionné de quatre à cinq gouttes deréactif de MAYER.L’existence d’alcaloïdes dans l’extrait est démontrée par l’apparition d’un précipité oud’une floculation après addition du réactif.2.2.5.2.2.1.2 Test de DRAGENDORFFDans le 2 ème tube, quatre à cinq gouttes de réactif de DRAGENDORFF sont ajoutéesdans l’extrait à tester. L’apparition d’une précipitation ou d’une floculation dans l’extraitaprès addition du réactif indique la présence d’alcaloïdes.2.2.5.2.2.1.3 Test de WAGNERLa formation d’un précipité dans le 3 ème tube, après ajout de quatre à cinq gouttes deréactif de WAGNER suggère la présence d’alcaloïdes.Un test de confirmation à l’éthanol 80% est nécessaire pour confirmer la présenced’alcaloïdes dans l’extrait à tester. Ainsi, les réactions de détection des alcaloïdes sont ditespositives, si et seulement si le précipité formé dans chaque tube est soluble dans l’éthanol80% de volume 0,5 ml. L’obtention de réaction positive pour chaque test est la condition sinaqua non pour pouvoir énoncer la présence d’alcaloïdes dans l’extrait testé.2.2.5.2.2.2 Désoxyoses(FONG et coll., 1977).A 0,5 ml d’extrait aqueux sont ajoutés successivement 0,5 ml de chlorure ferrique10% et 0,5 ml d’acide acétique glacial. Après agitation, 0,3 ml d’acide sulfurique (H 2 SO 4 )36,76 N est versé dans le tube à essai le long de la paroi.La formation d’un anneau pourpre à l’interface indique la présence de désoxyosesdans l’extrait testé.2.2.5.2.2.3 Flavonoïdes et leucoanthocyanesLa détection des flavonoïdes et des leucoanthocyanes se fait à partir de l’extraithydroéthanolique.

Etude chimique 202.2.5.2.2.3.1 Flavonoïdes : Test de WILSTATER (test à la cyanidine)(BRUNETON, 1987)La réaction à la cyanidine met en évidence les flavones, les flavonols et lesflavonones, par traitement avec du magnésium chlorhydrique.Deux tests sont effectués sur l’extrait hydroéthanolique. Trois tubes sont nécessaires,dont le premier sert de témoin :- Pour le premier test, 0,5 ml de HCl 12,07N et deux tournures de magnésium sontajoutés dans 3ml d’extrait hydroéthanolique. Après 10 minutes, le changement de colorationest noté. Le virage au rouge révèle la présence de flavones ; au rouge pourpre, celle desflavonols et au rouge violacé, celle des flavonones et des flavonols.- Pour le second test, la même opération est répétée mais le mélange est additionnéde1ml d’eau distillée et de 1ml d’alcool isoamylique. Une coloration rouge à rouge violacé dela phase supérieure indique la présence de flavonoïdes.2.2.5.2.2.3.2 Leucoanthocyanes(BRUNETON, 1993).En milieu acide, la forme cationique des anthocyanes, colorée en rouge est stable.0,5 ml de HCl 12,07N est versé dans 3 ml d’extrait hydroalcoolique. La solutionacidifiée est portée au bain-marie bouillant pendant 30 minutes. Après refroidissement,l’apparition d’une coloration rouge violacée révèle la présence de leucoanthocyanes.2.2.5.2.2.4 Stéroïdes et triterpènes(BRUNETON, 1987).L’extrait chloroformique est utilisé pour les tests de détection des stéroïdes et destriterpènes. Ces composés constituent généralement les génines et les saponosides2.2.5.2.2.4.1 Test de LIEBERMANN-BURCHARD1ml de la solution chloroformique est additionné de trois gouttes de solutiond’anhydride acétique. Après une légère agitation, deux à trois gouttes de H 2 SO 4 36,76 N sontajoutées le long de la paroi du tube incliné contenant le mélange. Après une heure,l’apparition d’un anneau rouge-violet ou rose confirme la présence des triterpènes, alors quele virage au bleu-vert de la phase supérieure (phase aqueuse), traduit la présence de stéroïdesdans l’extrait à tester.

Etude chimique 212.2.5.2.2.4.2 Test de SALKOWSKI1ml de H 2 SO 4 36,76 N est versé le long de la paroi d’un tube incliné contenantl’extrait chloroformique. Si les stérols insaturés sont présents dans le milieu, un anneau rougeou violet apparaît à l’interface du mélange.2.2.5.2.2.5 Saponosides(BALANSARD et BERNARD, 1950 ; BRUNETON, 1987 et 1993).Les saponosides sont des glucosides naturels, dont la solution mousse abondammentlorsqu’on l’agite. Les génines obtenues par hydrolyse des saponines sont soit des triterpènes,soit des stéroïdes. Les saponines ont un goût aigre et aussi un pouvoir hémolytique.La mise en évidence des saponines est faite par deux méthodes : le test de mousse et letest hémolytique. Ce dernier test sera décrit dans la deuxième partie consacrée à l’étudetoxicologique si le test de mousse s’avère positif.Test de mousseUn volume de 1 ml d’extrait aqueux est utilisé. Le tube contenant l’extrait est agitévigoureusement pendant 30 secondes. La formation de mousse alvéolée est observée. Lorsquela mousse atteint une hauteur de 3 cm et persiste pendant au moins 30 minutes, l’extraitcontient des saponines.2.2.5.2.2.6 Tanins et polyphénols(BALANSARD et BERNARD, 1950 ; BRUNETON, 1987 et 1993).Les tanins réagissent avec le chlorure ferrique et sont précipités de leurs solutionsaqueuses par la gélatine.L’extrait aqueux est utilisé pour les trois tests suivants :2.2.5.2.2.6.1 Test à la gélatineL’apparition de précipité dans le tube contenant 0,5 ml d’extrait, après ajout de quatreà cinq gouttes de gélatine aqueuse 1%, traduit la présence de tanins.

Etude chimique 222.2.5.2.2.6.2 Test à la gélatine saléeQuatre à cinq gouttes de gélatine salée (gélatine aqueuse 1% mélangée à une solutionde chlorure de sodium 10%) sont versées dans 0,5 ml d’extrait aqueux. La formation deprécipité indique la présence de tanins condensés de type pyrogallique.2.2.5.2.2.6.3 Test au chlorure ferriqueQuatre à cinq gouttes de chlorure ferrique en solution méthanolique sont additionnéesdans 0,5ml d’extrait à analyser. Les tanins catéchiques sont mis en évidence par la formationd’une coloration bleu-vert ou vert-noir alors qu’une coloration noire bleuâtre indique laprésence de tanins de type pyrogallol.Remarque : Si le test à la gélatine est négatif alors que le test au chlorure ferriquedemeure positif (coloration bleue ou noire), l’extrait contient d’autres composéspolyphénoliques.2.2.5.2.2.7 Anthraquinones (Test de BORNTRÄGER)(BRUNETON, 1987).Le test de BORNTRÄGER met en jeu une réaction colorée permettant de mettre lesquinones en évidence après solubilisation, en milieu alcalin.Un volume de 0,5 ml d’extrait aqueux est mélangé avec 1ml de benzène dans uneampoule à décanter. La phase organique est recueillie dans un tube à essai, après décantation.Cette phase organique est additionnée de cinq gouttes de NH 4 OH 25%. Après une légèreagitation, un virage au rouge de la phase alcaline (phase supérieure) indique la présenced’anthraquinones.2.2.5.2.2.8 IridoïdesLes iridoïdes donnent, en milieu acide, des colorations caractéristiques servant à leuridentification.Un volume de 0,5 ml d’extrait aqueux est ajouté de quelques gouttes de HCl 12,07N.Le mélange est porté au bain-marie bouillant pendant 30 minutes. Le virage de la colorationau bleu traduit la présence d’iridoïdes dans l’extrait à analyser.

Etude chimique 233. RESULTATSDes expérimentations préliminaires ont apporté des informations intéressantes surcertaines caractéristiques des principes toxiques, comme la résistance au chauffage et auxopérations de congélation et de décongélation répétées. Par conséquent, toutes les opérationsd’extraction et de purification sont effectuées à la température ambiante. La conservation desextraits se fait à -20°C.3.1 PREPARATION DES EXTRAITS TOXIQUES3.1.1 EXTRACTIONDans le but d’extraire la quantité maximale de principes toxiques et d’obtenir unextrait brut (EB) facile à manipuler, plusieurs types d’extraction ont été testés à partir de lapoudre de feuilles. La toxicité de chaque extrait est appréciée grâce à des tests sur souris (voirméthode au paragraphe 2.2.1.1.1, p. 36).Différentes méthodes ont été appliquées à cet effet :3.1.1.1 Extraction à froid10g de poudre de feuilles sont mises en suspension dans 100 ml d’eau distillée (c’està-dire,dans un rapport 1/10 : p/v), ou de mélange hydroéthanolique à 75% ou d’éthanolabsolu.La méthode d’extraction est décrite au paragraphe 2.2.1.1, p.9.Après centrifugation, le surnageant est concentré jusqu’à 10 ml (rapport 1/1 : p/v). Ilconstitue l’extrait brut (EB).3.1.1.2 Extraction à chaudL’extraction a été effectuée à partir de 10 g de poudre de feuilles. Ainsi, la poudre estdélayée dans 100 ml d’eau distillée ou de mélange hydroéthanolique 75%. L’opération estréalisée selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.1.2, p.9. Le surnageant, concentré jusqu’à10ml (rapport 1/1 : p/v), constitue l’extrait brut.Les résultats des différentes extractions sont résumés dans le tableau 1 (p.24)

Etude chimique 24Tableau 1 : Caractéristiques des extraits bruts obtenus par les différentesméthodes d’extractionMéthodesd’extractionCaractéristiquesEBaqueuxà froidEBaqueuxà chaudEB hydroéthanolique75 % àfroidEB hydroéthanolique75 % àchaudEBéthanoliquefroidCouleurMarronfoncéMarronclairMarronfoncé un peuverdâtreMarron clairun peuverdâtreMarronfoncéAspect Limpide Limpide Limpide Limpide LimpideConsistance Fluide Fluide Fluide Fluide FluidepH 5,43 5,35 5,22 5,22 5,25Toxicité (temps desurvie)Toxique(45-55min)Toxique(26-29min)Toxique(6 h)Toxique(8 h)Non toxiqueRendement 22,77% 24,10% 12,81% 10,03% 9,24%D’après ce tableau, l’extraction aqueuse à chaud donne le meilleur rendement etpermet d’obtenir l’extrait brut le plus toxique.En outre, l’extraction aqueuse à chaud, en plus de son moindre coût, fournit desprincipes actifs pouvant supporter une température élevée et aussi stériles. C’est pourquoi ellea été retenue pour la suite du travail.3.1.2 PURIFICATIONPlusieurs techniques ont été réalisées dans le but de purifier l’extrait brut obtenuprécédemment. Elles sont surtout basées sur la différence de solubilité, de poids moléculaireou sur l’affinité des principes toxiques pour les adsorbants. Quelques-unes de ces techniquesont été retenues à cause de leur haute performance. D’autres, moins performantes, n’ont pasété retenues mais seront toutefois décrites dans ce paragraphe car elles ont permis d’obtenirdes informations intéressantes sur les propriétés physico-chimiques des principes actifs. 50 gde poudre de feuilles sont utilisés.

Etude chimique 25- La purification est guidée par des tests de toxicité sur souris et des testsd’homogénéité par chromatographie sur couche mince (CCM).- A chaque étape de la purification, la solution contenant le principe toxique estévaporée à sec. Le résidu obtenu est pesé.3.1.2.1 Les méthodes adoptées dans le protocole de purification3.1.2.1.1 DialyseL’extrait brut obtenu à partir de l’extraction aqueuse à chaud, de volume 50 ml, estdialysé contre de l’eau distillée selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.5, p.12.Le volume du liquide de contre-dialyse ou dialysat est réduit jusqu’à 50 ml. Lasolution issue de cette concentration est de couleur marron clair. Elle s’avère toxique pour lessouris. Dorénavant, cet extrait est dénommé E 1 .L’adialysat ou dialysant subit la même opération. La solution obtenue, de couleurmarron, un peu foncé par rapport au dialysat, est non toxique pour les souris.La technique a permis d’éliminer plusieurs contaminants, c’est-à-dire des moléculesdont le poids moléculaire est supérieur au seuil de filtration des pores de la membrane, qui estde 8000 Da.3.1.2.1.2 Fractionnement par le n-butanolL’extrait E 1 issu de la dialyse, de volume 50 ml, est mélangé avec 50 ml de n-butanoldans une ampoule à décanter. L’opération est répétée trois fois selon la méthode décrite auparagraphe 2.2.2.3, p.11.La phase butanolique ou organique, est non toxique pour les souris, tandis que la phaseaqueuse l’est. L’extrait ainsi obtenu après concentration de la phase aqueuse est doncdénommé E 2 .3.1.2.1.3 Chromatographie d’exclusion sur colonne Sephadex G 25L’extrait issu du fractionnement par le n-butanol de volume 1 ml, est déposé sur unecolonne de gel Sephadex G 25 (1,5 x 4,7 cm). Le débit est de 7,5 ml/h/cm 2 . Les fractions, devolume 0,25 ml, sont récoltées dans des tubes à essai numérotés, à l’aide d’un collecteur defractions LKB.Les fractions sont chromatographiées sur couche mince dans le système B/A/E(60/20/20, p/p/p/p) selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.5.1, p.16. Les fractions dont les

Etude chimique 26chromatogrammes sont similaires, sont réunies. Ces fractions sont concentrées jusqu’auvolume de départ de l’extrait déposé. Les fractions collectées à partir du tube numéro 9jusqu’au 29 sont toxiques pour les souris. L’extrait ainsi obtenu constitue l’extrait purifié E 3.3.1.2.2 Les méthodes non adoptées dans le protocole de purification3.1.2.2.1 Précipitation par l’éthanol 50%Le traitement de 2 ml d’extrait brut par l’éthanol, selon la méthode décrite auparagraphe 2.2.2.1, p.10 donne un extrait limpide de couleur marron très clair et de goûtlégèrement aigre. Il n’est pas toxique pour les souris.3.1.2.2.2 Fractionnement par l’acétate d’éthyleLe fractionnement par l’acétate d’éthyle de 2 ml de dialysat a permis d’obtenir deuxextraits, aqueux et organique (voir paragraphe 2.2.2.2, p.10).La phase aqueuse est limpide, de couleur marron tandis que la phase organique estpresque incolore et aussi limpide. Aucun des deux extraits injectés par voie i.p. n’est toxiquepour les souris.3.1.2.2.3 Précipitation par l’acétate neutre de plombAprès traitement de 2 ml d’extrait brut par l’ANP (voir paragraphe 2.2.2.4, p.11),l’extrait est devenu presque incolore mais n’a aucune action sur les souris.3.1.2.2.4 Chromatographie sur résine échangeuse de cations Dowex 50Wx8L’extrait résultant du fractionnement par le n-butanol, est déposé sur une colonne derésine échangeuse de cation sous forme H + (Dowex 50Wx8) (1,5 x 3,4 cm).La colonne est lavée avec trois volumes de colonne d’eau distillée. Ce qui permetd’éluer les substances non retenues sur la colonne. Le pH de la solution est ajusté à 7 paraddition d’une soude (NaOH).Les molécules retenues sont éluées par trois volumes de colonne de NH 4 OH 0,5N(OH - ). Le pH de la solution recueillie est ajusté à 7 par addition d’une solution de HCl.Les deux solutions obtenues sont à la fois dessalées et concentrées. Elles sont toutesnon toxiques pour les souris.Les procédés d’extraction et de purification sont résumés sur la figure 2, p.27.

Etude chimique 27Poudre de feuilles50 gExtraction aqueuse àchaudExtrait brut (EB)12,05 gDialyseAdialysat écartéDialysat (E 1 )5,55 gFractionnement par len-BUTANOLPhase organiqueécartéePhase aqueuse (E 2 )4,30 gChromatographied’exclusion sur gelSephadex G25Fractions non toxiquesécartéesFractions toxiques(E 3 )3,36 gFigure2 : Schéma récapitulatif des procédés d’extraction et de purification desprincipes toxiques de Chassalia bojeriana. Les chiffres représentent les poids desrésidus d’évaporation à sec des extraits.En résumé, un procédé de purification comprenant une dialyse, une étape defractionnement par le n-butanol et une étape de chromatographie d’exclusion sur gel

Etude chimique 28Sephadex G 25, a été adopté afin de purifier l’extrait brut aqueux à chaud. Ce protocole apermis d’obtenir l’extrait purifié E 3.3.2 ANALYSE DES EXTRAITS PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCEL’homogénéité des différents extraits a été déterminée par chromatographie surcouche mince selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.5.1, p.16, utilisant le système desolvants B/A/E (60/20/20) (p/p/p).Après migration, plusieurs bandes apparaissent sous la lumière ultraviolette delongueur d’onde λ = 254 nm (voir figure 3).EB E 1 E 2 E 3Figure3 : Chromatogramme récapitulatif montrant l’évolution de l’homogénéité desdifférents extraits obtenus lors de l’extraction et la purificationSolvant de chromatographie : système B/A/E (60/20/20) (p/p/p)Révélation sous lumière ultraviolette (λ = 254 nm)EB: extrait brutE 1 : extrait obtenu après la dialyse (dialysat)E 2 : extrait obtenu par fractionnement par le n-butanol (phase aqueuse)E 3 : extrait obtenu après chromatographie d’exclusion sur gel Sephadex G 25.

Etude chimique 29Ainsi, l’extrait brut (EB) présente 10 bandes majeures révélables sous UV à 254 nm.La dialyse a permis d’éliminer 4 bandes majeures.Après fractionnement par le n-butanol, il ne reste plus que 4 bandes majeures. Lachromatographie d’exclusion sur gel Sephadex G 25 montre trois bandes. La purification adonc permis d’éliminer 7 bandes contaminantes.Ensuite, la plaque subit une révélation par pulvérisation par le réactif à la vanillinesulfurique. Le chromatogramme est montré sur la figure 4.EB E 1 E 2 E 3Figure 4 : Chromatogramme récapitulatif montrant l’évolution de l’homogénéité desdifférents extraits obtenus lors de l’extraction et la purificationSolvant de chromatographie : système B/A/E (60/20/20) (p/p/p)Révélation à la vanilline sulfuriqueEB: extrait brutE 1 : extrait obtenu après la dialyse (dialysat)E 2 : extrait obtenu par fractionnement par le n-butanol (phase aqueuse)E 3 : extrait obtenu après chromatographie d’exclusion sur gel Sephadex G 25.

Etude chimique 303.3 RENDEMENT DE PURIFICATIONAprès extraction et à chaque étape de la purification, les extraits obtenus sont évaporésà sec et le résidu obtenu est pesé. A partir de 50 g de poudre de feuilles, le résidud’évaporation à sec de l’extrait brut pèse 12,05 g et celui de l’extrait purifié E 3 est de 3,36 g.Selon la formule donnée au paragraphe 2.2.4, p.16, le rendement en principes toxiques,calculé par rapport au matériel de départ (50 g de poudre de feuilles) est évalué à 6,72%environ. Le rendement par rapport à l’extrait brut est de 27,88%.3.5 CARACTERISATION CHIMIQUE3.5.1 PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUESToutes les techniques, qu’elles aient été adoptées ou non dans le protocole depurification, ont apporté des informations intéressantes sur les propriétés physico-chimiquesdes principes toxiques des feuilles de Chassalia bojeriana .Ainsi,-le résidu d’évaporation à sec de l’extrait purifié E 3 est de couleur marron, plus oumoins clair et présentant un aspect sirupeux ;-les principes toxiques sont solubles dans l’eau et insolubles dans les solvantsorganiques peu polaires tels que le n-butanol et l’acétate d’éthyle ;-ils sont précipitables par l’acétate neutre de plomb (ANP) ;-ils sont thermostables car ils résistent à des températures élevées et à des variations dela température (opérations de congélation et de décongélation répétées) ;-ils traversent la membrane de dialyse de seuil 8000 Da ;-ils ne sont pas exclus par la colonne de gel Sephadex G25 dont le domaine defractionnement est compris entre 1500 et 5000 Da ;-ils ont un goût amer.3.5.2 NATURE CHIMIQUEUn criblage phytochimique a été réalisé sur la poudre, l’extrait brut (EB) et l’extraitpurifié E 3, dont les résultats sont résumés dans le tableau 2, p.31, afin de déterminer la naturechimique des principes toxiques.

Etude chimique 31Tableau 2 : Résultats du criblage phytochimique de l’extrait brut (EB) et de l’extraitpurifié (E 3 )Extrait utilisé Famille chimique Test ObservationExtrait acideAlcaloïdesExtraithydroéthanolique FlavonoïdesMAYERWAGNERDRAGENDORFFWILSTATER-Pas deprécipité-Pas deprécipité-Pas deprécipitéVirage de lacoloration aurouge pourpreRésultatsPoudre EB E 3- - -- - -- - -+ + -Extraithydroéthanolique LeucoanthocyanesBATE-SMITHColorationrouge sang+ + -Extrait aqueuxTanins etpolyphénolsFeCl 3GélatineGélatine saléeExtrait aqueux Saponines Indice de mousseExtrait aqueuxExtraitchloroformiqueExtraitchloroformiqueExtrait aqueux(décocté)+ : test positif- : test négatifDésoxyosesStéroïdes ettriterpènesStérolsinsaturésIridoïdesKELLER-KILLIANILIEBERMANN-BURCHARDSALKOWSKIAcidechlorhydrique àchaud-Virage au vertnoir-Floculationblanche-Précipité blancPas deformation demousseFormationd’anneaupourpre àl’interface-Formationd’anneau rougeviolacé- Colorationvert foncéColorationrouge de laphasesupérieurePas decolorationrouge++++++---- - -+ + ++ + ++ + +- - -

Etude chimique 32D’après ces résultats, l’extrait brut et la poudre contiennent des flavonoïdes, desleucoanthocyanes, des tanins et polyphénols, des désoxyoses, des stéroïdes et triterpènes etdes stérols insaturés, tandis que l’extrait purifié E 3 ne contient que des désoxyoses, desstéroïdes et triterpènes et des stérols insaturés.4 DISCUSSION ET CONCLUSIONUne activité toxique a été constatée dans les feuilles de Chassalia bojeriana. Aprèsavoir testé différentes méthodes d’extraction des principes toxiques à partir de la poudre defeuilles séchées, la méthode d’extraction aqueuse à chaud a été retenue pour la suite dutravail, du fait que l’extrait brut issu de cette méthode présente le meilleur rendement avec untemps de survie très court pour les souris testées par voie intrapéritonéale.Partant de l’extrait brut aqueux à chaud, un procédé de purification, comportant unedialyse, suivie d’un fractionnement par le n-butanol et d’une chromatographie d’exclusion surgel Sephadex G 25, a permis d’obtenir un extrait suffisamment purifié, avec un rendement entoxines de l’ordre de 6,72 g.Quant aux principes actifs, ils sont solubles dans les solvants polaires tels que l’eau etinsolubles dans les solvants apolaires comme le n-butanol. Ils sont thermostables et résistent àdes variations de température suite aux opérations de congélation et de décongélationrépétées. Ces principes actifs traversent les pores de la membrane de dialyse. Ce qui suggèrequ’ils ont un poids moléculaire inférieur à 8000 Da. Mais comme ils sont précipitables parl’acétate neutre de plomb, ils pourraient avoir un caractère acide. Ils ont goût un amer.Le criblage phytochimique révèle la présence de flavonoïdes, de leucoanthocyanes, detanins et polyphénols, de désoxyoses, de stéroïdes et triterpènes et des stérols insaturés dansl’extrait brut, tandis que seuls des désoxyoses, des stéroïdes et triterpènes et des stérolsinsaturés ont été détectés. Les autres composés trouvés dans l’extrait brut et qui ne sont pasdétectés dans l’extrait purifié E 3 , ont donc été éliminés au cours des étapes de la purification.En conclusion, les feuilles de Chassalia bojeriana contiennent des principes toxiquesqui pourraient être des composés contenant des désoxyoses, des stéroïdes et triterpènes ou desstérols insaturés.

DEUXIEME PARTIE :

Etude toxicologique 331 INTRODUCTIONLes extraits obtenus au cours de l’étude chimique réalisée sur les feuilles de Chassaliabojeriana, ont été utilisés pour l’exploration des propriétés toxicologiques des principes actifssur des organismes animaux, végétaux et microbiens.Ainsi, nous avons étudié :• la toxicité et les symptômes engendrés par l’administration des extraits chez lasouris ;• les effets sur les alevins de « baraoa », les têtards de grenouille et les larves demoustique ;• chez les végétaux, les effets sur la germination des graines de différentes espècesde Monocotylédones et Dicotylédones, la croissance des jeunes plantules et ledéveloppement des bourgeons axillaires ;• enfin, les effets sur la croissance de microorganismes.Désormais, l’extrait brut et l’extrait purifié utilisés dans les tests toxicologiques serontappelés respectivement EB et E 3 pour des raisons de commodité. L’EB sera utilisé pour lesexpériences nécessitant une quantité importante d’extrait toxique, E 3 n’étant pas disponible engrande quantité.2 MATERIELS ET METHODES2.1 MATERIELS2.1.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION2.1.1.1 Les animaux à sang chaud : les sourisLes souris utilisées (Mus musculus) provenant de l’élevage du laboratoire deBiochimie fondamentale et appliquée de l’Université d’Antananarivo, sont de race TANA-SWISS, stabilisée à l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM) depuis plusieurs années.2.1.1.2 Les animaux à sang froid2.1.1.2.1 Les têtards de grenouilleLes têtards sans patte de grenouille (Ptychadena mascareniensis) ont été capturés laveille du jour du test, dans les rizières situées aux alentours du campus universitaire

Etude toxicologique 34d’Ankatso. Ils sont laissés séjourner dans l’eau de la rizière où ils ont été capturés pour mieuxles adapter aux conditions du laboratoire pendant les 24 h précédant le test.2.1.1.2.2 Les poissonsLes alevins de « baraoa » (Oreochromis niloticus) ont été fournis par la Maison dupetit élevage (MPE) à Nanisana, Antananarivo. Ils sont laissés séjourner dans un aquariumaéré pendant quelques jours avant le test.2.1.1.3 Les larves de moustiqueLes larves de moustique Culex quinquefasciatus ont été capturées dans les eaux desrizières situées aux alentours du campus de l’université d’Antananarivo, la veille du test.2.1.2 LES PLANTES D’EXPERIMENTATIONLes graines ou semences utilisées pour les études des effets sur la germination, lacroissance des jeunes plantules et la croissance des bourgeons axillaires ont été achetéesauprès de fournisseurs de semences à Analakely, Antananarivo. Elles sont figurées dans letableau 3, p.35.2.1.3 LES GERMES UTILISES ET LES MILIEUX DE CULTURE2.1.3.1 Les germes utilisésLes germes disponibles au Laboratoire de Microbiologie appliquée (LMA) duDépartement de Biochimie fondamentale et appliquée, que nous avons utilisés sont :• des bactéries à Gram positif ;• des bactéries à Gram négatif.Ces microorganismes sont tous des souches pures. Ils sont présentés dans le tableau 4,p.35.

Etude toxicologique 35Tableau 3 : Les graines utilisées dans les tests sur les végétauxFAMILLE NOM USUEL NOM SCIENTIFIQUEDICOTYLEDONESAPIACEAEBRASSICACEAECUCURBITACEAEFABACEAECarottePersilAnantsongaChou de ChineTissam whiteConcombreCourgetteHaricot rougePetit poisDaucus carottaPetroselium crispumBrassica oleraceaBrassica chinensisBrassica sp.Cucumis sp.Cucurbita pepoPhaseolus vulgarisPisum sativumSOLANACEAE Tomate Lycopersicum esculentumMaïs Zea maysMONOCO-TYLEDONES POACEAE RizOryza sativaTableau 4 : Liste des germes utilisésNOM DES GERMES FORME TYPEEscherichia coli bacille Gram -Salmonella typhi bacille Gram -Staphylococcus aureus coque Gram +Vibrio fischeri vibrion Gram -Vibrio harveyi vibrion Gram -

Etude toxicologique 362.1.3.2 Les milieux de cultureLes milieux utilisés sont de qualité pour analyse. Ce sont :• le milieu MUELLER-HINTON de marque Liofilchem : un milieu solide électif,employé pour l’étude de la sensibilité des microorganismes ;• le milieu MARINE AGAR (gélose marine) de marque Difco : un milieu solide utilisécomme base servant à l’isolement, la culture et la numération des bactéries marineshétérotrophes.Les germes sont ensemencés selon la technique d’inondation dans des boites de Pétricontenant le milieu de culture (voir méthode dans le paragraphe 2.2.3.1.2, p.42)La composition de ces milieux est donnée en annexe III2.1.4 LES DISQUES POUR LES TESTS D’ANTIBIOGRAMMELes tests d’antibiogramme utilisent des disques stériles de 6 mm de diamètre, produitspar Biomérieux.2.1.5 STERILISATIONLes milieux de culture, les cônes des micropipettes et les disques pour les extraits sontstérilisés à l’autoclave à 121°C sous une pression de 2 bars pendant 40 minutes. La verrerie etles pinces sont stérilisées à l’étuve à 120°C pendant 30 minutes.Quant aux extraits, ils sont stérilisés par filtration sur filtre Millipore (filtre à seringuestérile de 25 mm de diamètre), de marque Poly labo, dont la dimension des pores est de 0,22µm.2.2 METHODES2.2.1 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX2.2.1.1 Chez la souris2.2.1.1.1 Estimation de la toxicitéLa toxicité est évaluée par injection de l’extrait à tester par voie intrapéritonéale (i.p.),à raison de 0,3 ml par 25 g de poids. Deux lots de trois souris de 26 g ± 2 g chacun sontnécessaires pour le test. Un autre lot de trois souris ayant le même poids sert de témoin. Lessouris de ce dernier lot reçoivent chacune 0,3 ml d’eau physiologique.

Etude toxicologique 372.2.1.1.2 Détermination de la DL 50 (24 h)L’estimation de la dose létale 50% (DL 50 ) ou la dose entraînant la mort de 50% desanimaux testés pendant 24 h, est établie selon la méthode de REED et MUENCH (1938).Selon cette méthode, la DL 50 (24 h) peut être déterminée de deux manières :- La première utilise la formule suivante :0,5 − Nlog DL50= log B + log RM − NOù : B = dose immédiatement inférieure à la DL 50M = mortalité provoquée par la dose immédiatement supérieure à la DL 50N = mortalité provoquée par la dose BR = raison de la progression géométrique- La deuxième utilise la méthode graphique par laquelle la valeur de la DL 50 (24 h) estdéterminée à partir de l’intersection de la courbe des totaux cumulatifs des survivantset de la courbe des totaux cumulatifs des morts en fonction des doses injectées.Sept doses en progression géométrique d’extraits toxiques sont nécessaires pourl’évaluation de la DL 50 (24 h). Pour cela, sept lots homogènes de cinq souris de 26 ± 2 g,laissées à jeun 24 h avant l’injection, sont utilisés.2.2.1.2 Test sur les animaux à sang froid2.2.1.2.1 PrincipeCette technique consiste à tester la résistance d’animaux aquatiques vis-à-vis del’intoxication de leur milieu par l’extrait à étudier.2.2.1.2.2 Mode opératoireDes lots d’animaux (alevins, têtards et larves de moustique) sont sélectionnés et placésdans des cristallisoirs contenant l’extrait à tester à différentes concentrations. L’expériencedure 24 h.

Etude toxicologique 38Détermination de la concentration létale 50% (CL 50 24 h)(BOYD, 1966)La CL 50 (24 h) ou la concentration qui tue 50% des animaux testés pendant 24 h, estdéterminée par la méthode de régression linéaire de la relation :% de mortalité = f (log C)Où C = concentration en mg/mlL’équation de la droite de régression linéaire est de la forme : Y = A + BX.Où Y = le pourcentage de mortalitéA = une constanteB = le coefficient de régressionX = le logarithme décimal de la concentration (log C).2.2.1.2.2.1 Test sur les alevins de « baraoa »Cinq lots de cinq alevins d’Oreochromis niloticus ayant à peu près la même taille, sonttestés avec cinq concentrations différentes d’extrait. Ces concentrations sont en progressiongéométrique de raison déterminée.2.2.1.2.2.2 Test sur les têtardsSept concentrations en progression géométrique d’extrait à étudier sont testées sur septlots de cinq têtards sans patte de Ptychadena mascareniensis de même âge (une à deuxsemaines).2.2.1.3 Expérience sur les larves de moustique(OMS, 1970)Les larves utilisées dans ce test sont celles de Culex quinquefasciatus. Pour cela, cinqlots de cinq larves au stade trois avancé de développement sont utilisés. Ces larves sontréparties dans des cristallisoirs contenant différentes concentrations d’extrait à tester.Le dénombrement des larves mortes est fait après 24 h. le pourcentage de mortalité àchaque concentration est calculé en additionnant le nombre de larves moribondes et de larvesmortes.

Etude toxicologique 39Les larves sont qualifiées de :• mortes, quand elles ne bougent plus quand on les touche avec une aiguille dans larégion cervicale ou dans le siphon ;• moribondes, quand elles sont incapables de remonter en surface ou de plongerquand on agite le milieu.2.2.2 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUXLes graines utilisées dans tous les tests sont désinfectées à l’eau de javel 10% (v/v)pendant 5 minutes puis rincées à l’eau avant toute utilisation.2.2.2.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des grainesDes graines de différentes espèces végétales sont utilisées dans cette étude. Celles-cisont figurées dans le tableau 3 du paragraphe 2.1.2, p.34. Pour chaque espèce étudiée, deuxlots de 10 graines sont trempés en parallèle dans de l’eau de robinet pendant 48 h àl’obscurité. Le premier lot est mis à germer sur du coton imbibé d’eau, alors que le deuxièmeest mis à germer sur du coton imprégné de l’extrait à tester, de concentration déterminée.Les résultats sont observés 72 h après l’incubation. Les graines qui ont germé sontcomptées.2.2.2.2 Etude des effets sur la croissance des jeunes plantulesUne espèce représentant les Monocotylédones et une autre les Dicotylédones, serventde matériels d’étude.2.2.2.2.1 PrincipeC’est une méthode basée sur l’observation des effets de l’extrait à tester à différentesconcentrations, sur le développement des hypocotyles et des épicotyles, en comparant entreelles les graines mises à germer en présence de l’extrait à étudier et celles servant de témoins,c’est-à-dire qui ne sont pas traitées.2.2.2.2.2 Mode opératoiregermination.L’expérience se déroule en deux étapes : la première est le trempage et la deuxième la

Etude toxicologique 402.2.2.2.2.1 TrempageHuit lots de dix graines sont utilisés pour chaque espèce. Deux des huit lots sonttrempés dans l’extrait à tester à une concentration déterminée. Les six autres lots sont trempésdans de l’eau de robinet. Le trempage se fait à l’obscurité pendant 48 h.2.2.2.2.2.2 GerminationAprès le trempage,• l’un des deux lots trempés dans l’extrait à étudier est mis à germer sur du cotonimbibé du même extrait, tandis que l’autre lot est placé sur du coton imprégnéd’eau de robinet après avoir été lavé. 72 h après le transfert, le premier lot estarrosé régulièrement avec le même extrait tout au long de l’expérience, alors quel’autre lot est arrosé avec de l’eau de robinet.• cinq parmi les six lots trempés dans l’eau de robinet sont mis à germer sur ducoton imbibé d’extrait à tester à différentes concentrations. Le 6 ème lot servant detémoin est toujours mis à germer sur du coton imbibé d’eau. Ils sontrespectivement arrosés avec de l’extrait à tester à différentes concentrations et del’eau de robinet pendant toute l’expérience, après la germination.L’estimation des effets sur la germination est effectuée 72 h après le transfert, parmesure de la longueur des hypocotyles et des épicotyles, tous les deux jours pendant deuxsemaines.2.2.2.3 Effets sur la levée de la dominance apicale(HELLER et coll., 1995).Le matériel végétal utilisé dans cette expérience est constitué de jeunes plantules depetit pois (Pisum sativum), âgées de 10 jours.Le but de cette expérience est de comparer les effets des extraits à tester avec ceux dedeux hormones végétales, l’auxine, une hormone capable d’inhiber la croissance desbourgeons axillaires, et la gibbérelline, une hormone stimulant cette croissance.Les jeunes plantules sont obtenues après trempage dans l’eau de robinet des graines depetit pois. Elles sont ensuite transférées dans des boites de Pétri contenant du coton imbibéd’eau de robinet, à raison de cinq graines par boite, pour leur germination, selon lesconditions décrites dans le paragraphe 2.2.2.2.2, p.39.

Etude toxicologique 41Ensuite, les graines sont laissées se développer à la lumière et sont arrosées de tempsen temps avec de l’eau de robinet. L’expérience est effectuée sur des plantules sélectionnéesau 9 ème jour et présentant au moins deux bourgeons axillaires. Celles-ci sont décapitées auniveau de la tige, juste au-dessus du premier bourgeon.La substance à analyser est mélangée avec de la lanoline. Le mélange est appliqué surla partie sectionnée des plantules, à raison de 1 µl par application.Un lot de cinq jeunes plantules est utilisé. L’une d’elles, recevant de la lanolinemélangée avec de l’eau distillée sert de témoin. Une autre, servant de témoin négatif reçoit 50µg d’auxine et une autre, utilisée comme témoin positif, reçoit 50 µg de gibbérelline. Lesdernières reçoivent 50 µg d’extrait à tester. L’expérience est réalisée en double.L’expérience consiste à mesurer la longueur des bourgeons axillaires des jeunesplantules, tous les deux jours pendant deux semaines.2.2.3 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LA CROISSANCE DESMICROORGANISMESL’étude des effets sur les microorganismes est entreprise selon la méthode de diffusionen milieu solide ou méthode des disques, communément appelée test d’antibiogramme.2.2.3.1 Spectre d’activité antimicrobienne des extraitsLes milieux utilisés sont le milieu MUELLER-HINTON pour Escherichia coli,Staphylococcus aureus et Salmonella typhi et le milieu MARINE AGAR pour Vibrio fischeriet Vibrio harveyi (voir paragraphe 2.1.3.2, p.36).2.2.3.1.1 PrincipeA partir d’un point de la surface de la gélose préalablement ensemencée avec unebactérie, un antibiotique déposé diffuse au sein de la gélose en créant une zone circulaired’inhibition de la croissance du germe, zone appelée halo d’inhibition ou auréole d’inhibition.Les concentrations d’antibiotique dans cette zone, diminuent du centre vers la périphérie. Lediamètre du halo d’inhibition varie selon le degré de sensibilité de la bactérie vis-à-vis del’antibiotique (DUVAL et SOUSSY, 1991).

Etude toxicologique 422.2.3.1.2 Mode opératoireLa souche pure à étudier est repiquée sur de la gélose dans une boite de Pétri etincubée (à 37°C pour Escherichia coli, Salmonella typhi et Staphylococcus aureus et à latempérature ambiante pour Vibrio fischeri et Vibrio harveyi) pendant 24 h. C’est lerelancement de la culture.Une ansée de colonie est prélevée et mise en suspension dans du bouillon nutritif. Lasuspension bactérienne obtenue est diluée de manière à avoir environ 10 6 germes par ml. Cetinoculum est ensemencé dans des boites de Pétri contenant le milieu de culture selon latechnique d’inondation. L’excès d’inoculum est éliminé par simple aspiration avec une pipettestérile.Les disques d’antibiogramme stériles (6 mm de diamètre) sont déposés à la surface dumilieu, à l’aide d’une pince fine stérile. Les extraits à tester, préalablement stérilisés parfiltration sur filtre Millipore, sont ensuite chargés sur les disques à raison de 10 µl par disque.Les boites sont incubées à 37°C pendant 24 h pour Escherichia coli, Salmonella typhi etStaphilococcus aureus et à la température ambiante pendant 72 h pour Vibrio harveyi etVibrio fischeri.La substance antibactérienne a une activité sur le germe quand un halo d’inhibitionapparaît autour du disque après incubation. Les diamètres des halos d’inhibition sont mesurés.Les résultats sont exprimés dans le tableau 5 selon les normes de l’IPM.Tableau 5 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthodedes disquesDiamètre du halo d’inhibition (x)Degré de sensibilité desgermesRésultatx < 7 mm Insensible -7mm < x < 8 mm Assez sensible +8 mm < x < 9 mm Sensible ++x > 9 mm Très sensible +++

Etude toxicologique 432.2.3.2 Détermination de la CMILa CMI ou la concentration minimale inhibitrice est la concentration minimaled’antibiotique pour laquelle on a une inhibition de la croissance bactérienne visible après untemps d’incubation de 24 h. Elle peut être déterminée par la méthode des disques en milieusolide dont la technique est la même que celle du spectre d’activité décrite dans le paragraphe2.2.3.1, p.41.3 RESULTATS3.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX3.1.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD3.1.1.1 Etude des effets sur les souris3.1.1.1.1 Description des symptômes d’intoxicationL’administration par voie i.p. de l’extrait brut à la dose létale de 2,56 g/kg (environ 67mg pour une souris de 20 g), entraîne l’apparition des symptômes suivants :- immédiatement après l’injection, les souris sont agitées ;- après 5 minutes, elles présentent des contorsions abdominales ;- au bout de 10 minutes, leurs yeux ne clignent plus et la fréquence respiratoire devienttrès élevée ;- 20 minutes après l’injection, une hyperhémie des oreilles qui sont tirées versl’arrière, est observée ;- les souris n’effectuent que de rares déplacements, en traînant leurs pattespostérieures, après 30 minutes. Elles se groupent dans un coin de la cuvette. Unepiloéréction est notée ;- 40 minutes après, les souris restent immobiles et une diminution importante de lafréquence respiratoire est observée ;- une exophtalmie, de la diarrhée, une polyurie et une cyanose de la queue (apparencebleue) sont remarquées, 1 h après l’injection ;- 1 h 30 minutes après l’injection, des convulsions cloniques commencent àapparaître ;

Etude toxicologique 44l’animal.- au bout de 2 h, les convulsions deviennent très intenses, entraînant la mort deLes mêmes symptômes sont observés après injection de l’extrait brut (EB) à la dosesub-létale de 1,44 g/kg, chez la souris, à l’exception de l’exophtalmie et des convulsions. Unerémission progressive est observée au-delà de la 12 ème heure et les souris reprennent uneapparence normale après 24 h.3.1.1.1.2 Détermination de la DL 50 (24 h)La détermination de la DL 50 (24 h) est faite selon la méthode de REED et MUENCH(1938) (voir paragraphe 2.2.1.1.2, p.37). Ainsi, sept doses en progression géométrique deraison 1,1 sont préparées. La première dose est la dose la plus forte dose donnant 0% de décès(1,44 g/kg) et la dernière dose est la dose la plus faible provoquant la mort des souris à 100%(2,56 g/kg).Les résultats expérimentaux sont résumés dans le tableau 6, ci-dessous.Tableau 6 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL 50 (24 h) chez lasourisDose en g/kgNombre de décès après Nombre de souris % de2h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h mortes survivantesmortalité1,44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0%1,59 0 0 0 0 0 0 1 0 1 4 20%1,74 0 1 0 0 1 1 0 0 3 2 40%1,92 0 1 1 0 1 0 0 0 3 2 40%2,11 0 2 1 0 1 0 0 0 4 1 80%2,32 1 2 0 1 0 0 0 0 4 1 80%2,56 2 2 0 1 0 0 0 0 5 0 100%D’après la formule de REED et MUENCH donnée dans le paragraphe 2.2.1.1.2, p,B = 1,92 g/kg ; N = 40 % soit 0,40 ; M = 80% soit 0,80 ; R = 1,1.La valeur de la DL 50 (24 h) est ainsi estimée à 1,96 g/kg. Celle déterminée par laméthode graphique des mêmes auteurs, est de l’ordre de 1,82 g/kg de souris (voir tableau 7 etfigure 5, p.45).

Etude toxicologique 45Tableau 7 : Valeurs utilisées pour l’estimation de la DL 50 (24 h) de l’extrait sur sourispar la méthode graphique des totaux cumulatifsDose eng/kg desourisNombre desouriséprouvéesNombres desourismortesNombre desourissurvivantesTotauxcumulatifsdessurvivantesTotauxcumulatifsdes mortes1,44 5 0 5 15 01,59 5 1 4 10 11,74 5 3 2 6 41,92 5 3 2 4 72,11 5 4 1 2 112,32 5 4 1 1 152,56 5 5 0 0 2025Nombre de souris2015105totaux cumulatifsdes mortestotaux cumulatifsdes survivantes01,44 1,59 1,74 1,92 2,11 2,32 2,56DL 50Dose en mg/kgFigure 5 : Détermination de la DL 50 (24 h) par la méthode graphique de REED etMUENCH (1938)3.1.2 EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROIDL’extrait brut est testé sur les animaux à sang froid suivant la méthode décrite auparagraphe 2.2.1.2, p.37.3.1.2.1 Effets de l’extrait brut sur les têtardsDifférentes concentrations de l’EB, allant de 156 µg/ml à 205 µg/ml, en progressiongéométrique de raison 1,05 ont été testées sur sept lots de cinq têtards. D’après les résultatsinscrits dans le tableau 8, l’EB est toxique pour les têtards aux concentrations utilisées.

Etude toxicologique 46Tableau 8 : Effets des différentes concentrations de l’EB sur les têtardsConcentration(C) Nombre Nombre des têtardsLot n°log C% de mortalitéde EB (µg/ml)têtardsmorts survivants1 156,00 2,19 5 5 0 100%2 163,80 2,21 5 5 0 100%3 171,99 2,23 5 5 0 100%4 180,58 2,25 5 5 0 100%5 189,60 2,27 5 5 0 100%6 199,08 2,29 5 5 0 100%7 209,03 2,32 5 5 0 100%On n’a pu obtenir aucune valeur intermédiaire entre 0 % et 100 % de mortalité carl’intervalle séparant la concentration maximale tolérée et la concentration létale est très étroit,ce qui rend impossible la détermination de la CL 50 . La toxicité de l’EB sur les têtards obéitdonc à la loi du « tout ou rien ».3.1.2.2 Effets de l’extrait brut sur les alevins de « baraoa »Cinq lots de cinq alevins sont testés avec différentes concentrations de l’EB, enprogression géométrique de raison 1,05. Le premier terme est de 126 µg/ml. Le tableau 9affiche les résultats obtenus.Tableau 9 : Effets des différentes concentrations de l’extrait brut sur les alevinsLot n° Concentration(C)de EB (µg/ml)log CNombred’alevinsNombre des alevinsmorts survivants% de mortalité1 126,00 2,100 5 5 0 100%2 132,30 2,121 5 5 0 100%3 138,91 2,142 5 5 0 100%4 145,86 2,163 5 5 0 100%5 153,15 2,185 5 5 0 100%D’après les résultats obtenus, l’EB est toxique pour les alevins. Mais la concentrationmaximale tolérée et la concentration sûrement mortelle sont très rapprochées, alors, la CL 50n’a pu être déterminée. Donc la toxicité de l’EB sur les alevins obéit aussi à la loi du « tout ourien ».

Etude toxicologique 473.1.2.3 Effets de l’extrait brut sur les larves de moustiqueLe test a été effectué suivant la méthode décrite au paragraphe 2.2.1.2.3, p.38. Lesconcentrations limites de l’EB n’ont pas pu être déterminées parce qu’à des concentrationslargement supérieures à 2 mg/ml, aucune mortalité ni morbidité n’est observée après 24 h. Onpeut donc dire que les larves de moustique résistent à une concentration d’extrait brutdépassant largement 2 mg/ml.3.2 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX3.2.1 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LA GERMINATION DESGRAINESL’expérience a pour but la détermination des effets de l’EB sur le pouvoir germinatifdes diverses graines. Elle est réalisée selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.1, p.39.Plusieurs graines de différentes espèces ont été testées avec l’EB. Elles sont d’abordtrempées dans l’eau, puis mises à germer dans l’extrait brut à une concentration de 1 mg/ml.Le tableau 10, p.48 montre la sensibilité des graines à l’égard de l’EB à l mg/ml. Cettesensibilité est très variable selon les plantes. Ainsi, sur les 12 espèces de graines testées, 6(persil, tissam white, anantsonga, chou de Chine, riz et maïs) sont insensibles et germent à untaux de 100%. Pour les autres graines, une inhibition de la germination à des taux allant de10% (pour le petit pois) à 50% (pour le haricot rouge et la tomate) est observée.

Etude toxicologique 48Tableau 10 : Effets de l’extrait brut à 1 mg/ml sur la germination de diverses grainesFAMILLENOMUSUELNOMSCIENTIFIQUETaux degerminationTauxd’inhibitionAPIACEAEBRASSICACEAECUCURBITACEAEFABACEAESOLANACEAEPOACEAECarotte Daucus carotta 80% 20%Persil Petroselinum crispum 100% 0%Anantsonga Brassica oleracea 100% 0%Chou deChineBrassica chinensis 100% 0%Tissam white Brassica sp. 100% 0%Concombre Cucumis sp. 10% 90%Courgette Cucurbita pepo 80% 20%Haricot rouge Phaseolus vulgaris 50% 50%Petit pois Pisum sativum 90% 10%TomateLycopersicumesculentum50% 50%Maïs Zea mays 100% 0%Riz Oryza sativa 100% 0%3.2.2 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LA CROISSANCE DES JEUNESPLANTULESUn représentant des Monocotylédones (le riz) et un représentant des Dicotylédones (leharicot) ont été utilisés pour l’évaluation des effets de l’extrait brut sur la croissance desjeunes plantules. Ces deux espèces se sont montrées respectivement insensibles et peusensible à l’EB à 1 mg/ml. Le but de l’expérience est alors de vérifier si l’absence ou le peud’effet de l’EB à cette concentration n’est pas due à une question de dose. L’expérience estréalisée selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.2, p.39.Pour ce faire, 8 lots de 10 graines sont utilisés pour chacune des deux espèces (riz etharicot). Deux lots sont trempés dans l’extrait brut à 14,40 mg/ml et 5 parmi les lots restantssont trempés dans l’eau. Ces derniers sont mis à germer en présence de différentesconcentrations allant de 0,90 mg/ml à 14,40 mg/ml (figure 6, p.49). Le dernier lot, trempédans l’eau et arrosé avec de l’eau de robinet, sert de témoin.

Etude toxicologique 498 lots de 10 graines de haricotou8 lots de 10 graines de riz2 lots trempés dans l’EB à14,40 mg/ml pendant 24 h àl’obscurité6 lots trempés dans l’eau de robinetpendant 24 h à l’obscurité1 lot arroséavec l’EB à14,40 mg/ml1 lot arroséavec de l’eaude robinet1 lot arrosé avecde l’eau de robinet(témoin)5 lots arrosés avecl’EB à différentesconcentrations1 lot arroséavec l’EBà 0,90mg/ml1 lot arroséavec l’EBà 1,80mg/ml1 lot arroséavec l’EBà 3,60mg/ml1 lot arroséavec l’EBà 7,20mg/ml1 lot arroséavec l’EBà 14,40mg/mlFigure 6 : Schéma récapitulatif des différentes étapes de l’étude sur les effets de l’EBà différentes concentrations sur la croissance des jeunes plantulesPour le haricot, les graines du lot trempé dans l’EB à 14,40 mg/ml et mis à germer enprésence de ce même extrait, la longueur des épicotyles est pratiquement nulle (figure 7) etcelle des hypocotyles est largement inférieure à celle du témoin (figure 8). Un très importantretard dans la croissance est noté. Il y a ainsi une inhibition de la croissance des plantules.Pour le lot trempé dans l’EB à 14,40 mg/ml et mis à germer dans l’eau, après lavage,l’inhibition est moins marquée par rapport à celle du lot arrosé avec l’EB, mais elle est encoreremarquable comparée à la croissance du témoin. En effet, la longueur des épicotyles et celledes hypocotyles sont inférieures à celle du témoin mais elles sont plus grandes que celles dulot trempé dans l’EB et arrosé avec le même extrait (figure 7 et 8, p.50)Pour le lot trempé dans l’eau et mis à germer dans l’EB à 14,40 mg/ml, le mêmecomportement que celui trempé dans l’EB et arrosé avec de l’eau est remarqué (figure 7 et 8).Chez le riz, il y a une inhibition de la croissance plus poussée pour le lot trempé dansl’extrait brut à 14,40 mg/ml et arrosé avec le même extrait. L’épicotyle est plus affecté quel’hypocotyle (figure 9 et 10). Par contre, pour le lot trempé dans l’extrait brut à 14,40 mg/ml

Etude toxicologique 50et mis à germer dans l’eau, aucune différence notable n’est observée par rapport au témoin, ence qui concerne l’hypocotyle. Par contre, la croissance de l’épicotyle est inhibée.Toujours chez le riz, les lots trempés dans l’eau et arrosés avec l’EB à 14,40 mg/mlmontrent une nette inhibition de la croissance des épicotyles et des hypocotyles maisl’inhibition est moins marquée que pour les lots trempés dans l’EB à 14,40 mg/ml et arrosésavec le même extrait.EPICOTYLE DE HARICOT120Longueur (mm)1008060402002 4 6 8 10 12 14Nombre de joursE/EEB/EBEB/EE/EBFigure 7 : Croissance des épicotyles de haricot en fonction du trempageHYPOCOTYLE DE HARICOT200Longueur (mm)15010050E/EEB/EBEB/EE/EB02 4 6 8 10 12 14Nombre de joursFigure 8 : Croissance des hypocotyles de haricot en fonction du trempageE/E : lot trempé dans l’eau puis arrosé avec de l’eau (témoin)EB/EB : lot trempé dans l’EB à 14,40 mg/ml puis arrosé avec ce même extraitEB/E : lot trempé dans l’EB à 14,40 mg/ml mais arrosé avec de l’eauE/EB : lot trempé dans l’eau puis arrosé avec l’EB à 14,40 mg/ml

Etude toxicologique 51EPICOTYLE DE RIZLongueur (mm)7060504030201002 4 6 8 10 12 14Nombre de joursE/EEB/EBEB/EE/EBFigure 9: Croissance des épicotyles de riz en fonction du trempageHYPOCOTYLE DE RIZ20Longueur (mm)15105E/EEB/EBEB/EE/EB02 4 6 8 10 12 14Nombre de joursFigure 10 : Croissance des hypocotyles de riz en fonction du trempageE/E : lot trempé dans l’eau puis arrosé avec de l’eau (témoin)EB/EB : lot trempé dans EB à 14,40 mg/ml puis arrosé avec ce même extraitEB/E : lot trempé dans EB à 14,40 mg/ml mais arrosé avec de l’eauE/EB : lot trempé dans l’eau puis arrosé avec EB à 14,40 mg/mlQuant aux lots trempés dans l’eau, puis arrosés avec différentes concentrationsd’extrait brut, une inhibition proportionnelle à la dose est notée. En effet, à l’exception deslots arrosés avec l’EB à 0,90 mg/ml et 1,80 mg/ml où on note une légère action stimulatriceau niveau de l’hypocotyle du haricot (figure 12), l’inhibition de la croissance des épicotyles et

Etude toxicologique 52des hypocotyles est d’autant plus poussée pour les deux espèces que les concentrations del’EB sont élevées.L’évolution de la longueur des épicotyles et des hypocotyles est montrée sur lesfigures 11 à 14, p.52 à 53.EPICOTYLE DE HARICOTLongueur (mm)1201008060402002 4 6 8 10 12 14Nombre de jourstémoin (eau)0,90 mg/ml1,80 mg/ml3,60 mg/ml7,20 mg/ml14,40 mg/mlFigure 11 : Effets de l’EB à différentes concentrations sur le développement desépicotyles de haricotHYPOCOTYLE DE HARICOTLongueur (mm)2001501005002 4 6 8 10 12 14Nombre de jourstémoin (eau)0,90 mg/ml1,80 mg/ml3,60 mg/ml7,20 mg/ml14,40 mg/mlFigure 12 : Effets de l’EB à différentes concentrations sur le développement deshypocotyles de haricot

Etude toxicologique 53EPICOTYLE DE RIZ70Longueur (mm)60504030201002 4 6 8 10 12 14témoin (eau)0,90 mg/ml1,80 mg/ml3,60 mg/ml7,20 mg/ml14,40 mg/mlNombre de joursFigure 13 : Effets de l’EB à différentes concentrations sur le développement desépicotyles de rizHYPOCOTYLE DE RIZLongueur (mm)201510502 4 6 8 10 12 14témoin (eau)0,90 mg/ml1,80 mg/ml3,60 mg/ml7,20 mg/ml14,40 mg/mlNombre de joursFigure 14 : Effets de l’EB à différentes concentrations sur le développement deshypocotyles de riz3.2.3 EFFETS DES EXTRAITS SUR LA LEVEE DE LA DOMINANCEAPICALELes effets de l’EB et de l’extrait purifié (E 3 ) sur la croissance des bourgeons axillairesont été étudiés par comparaison avec ceux des hormones végétales : la gibbérelline etl’auxine, selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.3, p.40. Ainsi, sur les cinq plantules dumême lot, l’une a reçu 50 µg d’EB ; une autre 50 µg d’extrait purifié E 3 . Les deux dernièresplantules ont reçu respectivement 50 µg de gibérelline et 50 µg d’auxine.

Etude toxicologique 54Les résultats de ces expériences sont récapitulés sur la figure 16.CROISSANCE DES BOURGEONS AXILLAIRES250Longueur (mm)20015010050GibbérellineAuxineEBE3Témoin (eau)02 4 6 8 10 12 14Nombre de joursFigure 15 : Effets des différentes substances sur la croissance des bourgeonsaxillaires des jeunes plantules de petit poisD’après ces résultats, l’EB et l’extrait purifié (E 3 ) exercent à partir du septième jour uneffet légèrement stimulateur sur la croissance des bourgeons axillaires. Mais cette stimulationest encore inférieure à celle de la gibbérelline. Les deux extraits ont à peu près les mêmeseffets sur la croissance des bourgeons axillaires.3.3 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMESSpectre d’activité antimicrobienne des extraitsLa sensibilité des microorganismes à l’EB à et l’extrait purifié E 3 de concentrationsrespectives 213,47 mg/ml et 67,30 mg/ml (concentrations initiales), a été évaluée sur 5germes-tests qui sont des souches pures (voir paragraphe 2.1.3.1, p.34). Les résultats sontrésumés dans le tableau 11, p.55.

71papel. No capítulo III há as normas referentes ao processo eletrônico, sendo que em seu artigo11, especificamente, trata-se dos documentos eletrônicos juntados ao processo 51 .A lei em comento estabelece várias premissas importantes acerca das relações entre odocumento físico e, obviamente, o eletrônico, e também entre as noções existentes de originale cópia. Destarte, os documentos que são produzidos eletronicamente são consideradosoriginais para quaisquer efeitos legais, desde que juntados aos autos digitais com a devidagarantia de origem e também de autoria. O documento original, portanto, é aquele que foiprimeiro produzido, independentemente da forma, seja física ou eletrônica. Já a reproduçãoem qualquer outro formato ou meio a partir do documento original é considerada uma cópia.Os extratos digitais e os documentos digitalizados quando juntados aos autos pelasautoridades que estão relacionadas na lei e por advogados públicos e privados têm a mesmaforça probante dos originais, ou seja, a dos documentos físicos, ressalvados os casos no quaishaja alegação devidamente motivada de adulteração. Ademais, os documentos físicosoriginais devem ser preservados pelo seu detentor até o trânsito em julgado da sentença ou,nos casos apropriados, até o final do prazo para interposição de ação rescisória.3.7 Ata notarialUm grande problema ao ter alguma informação veiculada em páginas na Internet ésaber como guardar essa informação ou extraí-la de modo que possa ser utilizada dentro de51 Art. 11. Os documentos produzidos eletronicamente e juntados aos processos eletrônicos com garantia daorigem e de seu signatário, na forma estabelecida nesta Lei, serão considerados originais para todos os efeitoslegais.§ 1º Os extratos digitais e os documentos digitalizados e juntados aos autos pelos órgãos da Justiça e seusauxiliares, pelo Ministério Público e seus auxiliares, pelas procuradorias, pelas autoridades policiais, pelasrepartições públicas em geral e por advogados públicos e privados têm a mesma força probante dos originais,ressalvada a alegação motivada e fundamentada de adulteração antes ou durante o processo de digitalização.§ 2º A argüição de falsidade do documento original será processada eletronicamente na forma da lei processualem vigor.§ 3º Os originais dos documentos digitalizados, mencionados no § 2o deste artigo, deverão ser preservados peloseu detentor até o trânsito em julgado da sentença ou, quando admitida, até o final do prazo para interposição deação rescisória.§ 4º (VETADO)§ 5º Os documentos cuja digitalização seja tecnicamente inviável devido ao grande volume ou por motivo deilegibilidade deverão ser apresentados ao cartório ou secretaria no prazo de 10 (dez) dias contados do envio depetição eletrônica comunicando o fato, os quais serão devolvidos à parte após o trânsito em julgado.§ 6º Os documentos digitalizados juntados em processo eletrônico somente estarão disponíveis para acesso pormeio da rede externa para suas respectivas partes processuais e para o Ministério Público, respeitado o dispostoem lei para as situações de sigilo e de segredo de justiça.

Etude toxicologique 56(RANDRIAMAMONJY, 2005) et celui de Phyllarthron madagascarense dont la DL 50 estcomprise entre 2,52 g/kg et 2,6 g/kg (IBRAHIM, 2003).Bien qu’on ne puisse pas toujours extrapoler sur l’homme les résultats obtenus sursouris, les fortes concentrations et la voie d’administration utilisées rassurent sur l’innocuitédu décocté de feuilles de Chassalia bojeriana utilisé à des fins thérapeutiques.L’EB est également toxique sur les animaux à sang froid tels que les alevins de« baraoa » et les têtards de grenouille. Il est toxique à 100% à une concentration égale à 156µg/ml pour les têtards et 126 µg/ml pour les alevins de « baraoa ». La valeur de la CL 50 n’a puêtre déterminée pour les deux animaux car la toxicité de l’extrait obéit à la loi du « tout ourien ». Par ailleurs, les résultats montrent que les alevins sont plus sensibles que les têtards.Cette sensibilité des alevins pourrait être due au contact direct de leurs bronchies richementirriguées avec les principes actifs présents dans le milieu.L’EB n’a aucun effet sur les larves de moustique. En effet, les larves de Culexquinquefasciatus montrent une forte résistance à l’EB jusqu’à une concentration à 2 mg/ml.Ceci permet de déduire qu’une éventuelle utilisation de l’extrait de feuilles de Chassaliabojeriana en tant que larvicide n’est pas possible car cela exige une forte concentration. Or,cela pourrait avoir des effets néfastes envers d’autres organismes vivant dans l’écosystème.Chez les végétaux, la plupart des graines testées sont insensibles à l’extrait de feuillesde Chassalia bojeriana à 1 mg/ml et germent normalement. Mais l’extrait exerce un effetinhibiteur sur la germination de certaines espèces à des taux variables : la graine deconcombre s’avère être la plus sensible des graines testées car l’inhibition est de 90% à laconcentration utilisée. La différence d’inhibition pourrait être due à une différencephysiologique au niveau des plantes testées et l’inhibition pourrait provenir de la destructionde l’embryon ou de l’inactivation par l’extrait des enzymes nécessaires à la germination.A partir d’une concentration de 0,90 mg/ml pour le riz et 1,80 mg/ml pour le haricot,l’extrait exerce une action inhibitrice sur la croissance des jeunes plantules. Cette inhibitionest proportionnelle à la concentration utilisée pour les graines trempées dans l’eau et arroséesavec de l’extrait à différentes concentrations. Elle pourrait être due aux effets de cet extrait surle phénomène d’enracinement ou à un blocage de l’absorption et de l’utilisation desnutriments contenus dans le milieu. Les graines de haricot sont beaucoup plus sensibles quecelles du riz. L’épicotyle est plus affecté que l’hypocotyle.Il faut noter que d’une manière générale, une inhibition est observée quelles que soientles conditions de trempage.

Etude toxicologique 57Les extraits brut et purifié exercent une action stimulatrice sur le développement desbourgeons axillaires mais la stimulation est inférieure à celle de la gibbérelline.L’EB et l’extrait purifié, de concentrations respectives 213,47 mg/ml et 67,30 mg/ml,n’ont aucune activité toxique chez les microorganismes testés.

Etude toxicologique 58CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVESLes résultats des travaux réalisés dans le cadre de ce mémoire, bien qu’ils soientpréliminaires, nous ont permis :• de mettre en évidence l’activité toxique des feuilles de Chassalia bojeriana surdifférentes espèces animales ;• de mettre au point une technique d’extraction et de purification des principesactifs présents dans les feuilles de la plante, en vue d’en déduire leur naturechimique, leurs propriétés physico-chimiques et toxicologiques ;• d’améliorer les connaissances sur Chassalia bojeriana, connaissances quipourront être utilisées pour orienter des recherches antérieures sur la plante.Dans l’avenir, nous envisageons :• d’apporter des améliorations sur le procédés d’extraction et de purification afind’obtenir les principes actifs des feuilles à l’état pur ;• de caractériser les principes actifs pour mieux connaître leurs propriétésphysico-chimiques, leurs structures et leur nature chimique ;• de pousser encore davantage l’étude de leurs propriétés toxicologiques surd’autres animaux, végétaux et microbes ;• d’étudier le mécanisme d’action des principes actifs ;• d’étudier l’action des extraits sur d’autres germes ;• de prospecter d’autres propriétés biologiques des extraits de feuilles de laplante.• d’étudier les utilisations thérapeutiques par rapport aux effets toxiques.

Références bibliographiques 59REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES-ANDRE R., DELAVEAU P., JACQUEMIN H. Recherches phytochimiques sur quelquesRubiacées malgaches. Plantes médicinales et phytothérapie, 1976 ; 10 : 233-242.-AUDIGIE C., DUPONT G., ZOSZAIN F. Principes et méthodes d’analyse biochimique.Paris : Doins Editeurs, 1982 ; 1 : 190p.-BALANSARD J., BERNARD P. Notes pratiques de chimie végétale. Méd. Trop., n°6 Nov-Déc 1950 : 10-38.-BOITEAU P., ALLORGE-BOITEAU L. Plantes médicinales de Madagascar. Paris : ACCTet édition Karthala, 1993 ; 135p.-BOITEAU P. Précis de matières médicales malgaches. Antananarivo : Librairie deMadagascar, 1979 ; 97p.-BOREL J., RANDOUX A. Méthodes chromatographiques.In : KAMOUN P. Appareils et méthodes en biochimie, 3 ème Ed. Paris : Médecine sciencesFLAMMARION, 1987 : 129-192.-BOST R. Pharmacopée malgache. Inst. Sci. Madagascar. Paris : Lahure, 1961 ; 10 ; 159-234.-BRUNETON J. Eléments de phytochimie et de pharmacognosie. Paris : Tech & DocLavoisier, 1987 : 585p.-BRUNETON J. Pharmacognosie : phytochimie, plantes médicinales, 2 ème Ed. Paris : Tech &Doc Lavoisier, 1993 : 915p.-DEBRAY M., JACQUEMIN H., RAZAFINDRAMBAO R. Contribution à l’inventaire desplantes médicinales de Madagascar. Paris : ORSTOM, 1971 : 150p.-DUVAL J., SOUSSY C. J. Antibiothérapie, 4 ème Ed. Paris : Masson, 1990 : 37-38.-FONG H. H. J., TIN W. A. M., FARNSWORTH N. R. Phytochemical screening. Chicago:Review University of Illinois, 1977 : 73-126.

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AnnexesANNEXE IComposition du réactif à la vanilline sulfuriqueVanillineAcide sulfurique (H 2 SO 4 )0,5 g100 mlANNEXE IIComposition des réactifs généraux pour les alcaloïdesRéactif de MAYERChlorure de mercureIodure de potassiumEau distillée1,36 g5 gqsp 100 mlRéactif de WAGNERIodure de potassiumIodeEau distillée2 g1,27 gqsp 100 mlRéactif de DRAGENDORFFIl s’agit d’un mélange (v/v) de deux solutions, A et B.Solution A :Nitrate de bismuthAcide tartrique concentréEau distillée1,7 g20 gqsp 100 mlSolution B :Iodure de potassiumEau distillée10 gqsp 40 mlLe mélange est ensuite additionné de 10 g d’acide tartrique et son volume est ramené à100 ml par de l’eau distillée.

AnnexesANNEXE IIIA- Composition des différents milieux de culture• Milieu de MUELLER-HINTONFormule-type (g/l)Extrait de viande 2,0Peptone trypsique de caséine 17,5Amidon 1,5Agar 15,0pH 7,3 ± 0,1 à 25°C• Milieu MARINE-AGARFormule approximative par litrePeptone5,0 gExtrait de levure1,0 gCitrate de fer0,1 gChlorure de sodium19,45 gChlorure de magnésium8,8 gSulfate disodique3,24 gChlorure de calcium1,80 gChlorure de potassium0,55 gBicarbonate de sodium0,16 gBromure de potassium0,08 gGélose15,0 gChlorure de strontium34,0 mgAcide borique22,0 mgSilicate de sodium4,0 mgFluorure de sodium2,4 mgNitrate d’ammonium1,6 mgPhosphate disodique8,0 mgAjoutée et/ou complémentée en fonction des critères de performance imposés.pH final 7,6 ± 0,2.

AnnexesB- Préparation à partir des milieux déshydratés• Préparation du milieu MUELLER-HINTON (agar)-Dissoudre 36 g de milieu déshydraté dans de l’eau distillée en agitant continuellementpuis ajuster à 1 litre.-Chauffer le milieu jusqu’à dissolution totale sur une plaque chauffante toujours enremuant avec un agitateur magnétique.-Répartir en tube de façon à obtenir un volume de 15 ml environ par tube aprèsstérilisation.-Autoclaver à 121°C à 2 bars pendant 15 minutes.• Préparation du milieu MARINE-AGAR-Mettre 55,1 g de poudre en suspension dans 1 litre d’eau purifiée.-Bien mélanger.-Chauffer sous agitation magnétique continue et laisser bouillir pendant une minute demanière à dissoudre parfaitement la poudre.-Autoclaver à 121°C pendant 15 minutes.

SummaryName : RANDRIAMAMPIANINAFirst name : Lovarinstoa JudicaëlTitle : ETUDES CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DES EXTRAITS DE FEUILLESD’UNE PLANTE MEDICINALE MALGACHE Chassalia bojeriana(RUBIACEES)SUMMARYThe active principles of Chassalia bojeriana leaves, an endemic Rubiaceae fromMadagascar, show a low toxicity on mice. The plant is traditionally used for gout and liverdisease treatment, and as a tonic in particular.The crude extract was purified by a procedure including dialysis, n-butanolfractionation by and a Sephadex G 25 gel filtration, allowing to obtain a partially purified E 3extract.The yield in toxins is about 6.72 %.The bitter active principles are heat resistant, water soluble and insoluble in butanoland ethyl acetate. They have a molecular weight below 8000 Da.The phytochemical screening of the purified extract E 3 revealed the presence ofdesoxyoses, triterpenes, steroids and unsaturated sterols.Tested in vivo on mice, the crude extract causes mortality only at a high dosage. TheLD 50 is included between 1.82 g/kg and 1.96 g/kg by i.p. route.On frogs’ tadpoles and fishes, the toxicity of the crude extract follows the law of “allor nothing”. The same extract was not toxic on mosquito larvae even at 2 mg/ml.The crude extract inhibits seed germination of some plant species and the growth ofseedlings of rice and beans. Crude and purified extracts inhibit the development of axillariesbuds of sweet peas as well.No toxic activity of the crude and purified extracts was recorded for strains of testedmicroorganisms.KEYWORDS :Chassalia bojeriana, Rubiaceae, therapeutic virtue, LD 50 , toxic activity, toxin.Adviron : Professeur JEANNODA VictorDocteur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle A.D.

RésuméNom : RANDRIAMAMPIANINAPrénoms : Lovarintsoa JudicaëlTitre du mémoire : ETUDES CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DES EXTRAITS DEFEUILLES D’UNE PLANTE MEDICINALE MALGACHEChassalia bojeriana (RUBIACEES)RESUMELes principes actifs d’extraits de feuilles de Chassalia bojeriana, une Rubiacéeendémique de Madagascar, montrent une faible toxicité sur souris. La plante est utilisée enthérapeutique traditionnelle malgache, notamment dans le traitement de la goutte, desmaladies du foie et comme fortifiant.L’extrait brut (EB) aqueux à chaud a subi une purification comportant une dialysesuivie d’un fractionnement par le n-butanol et d’une chromatographie d’exclusion sur gelSephadex G 25, permettant d’obtenir un extrait E 3, partiellement purifié. Le rendement entoxines est de l’ordre de 6,72%.Les principes actifs, ayant un goût amer, sont thermostables, solubles dans l’eau etinsolubles dans le butanol et l’acétate d’éthyle. Ils ont un poids moléculaire inférieur à 8000Da.Le criblage phytochimique de l’extrait purifié E 3 a révélé la présence de désoxyoses,de triterpènes, de stéroïdes et de stérols insaturés.Testé in vivo sur des souris, l’extrait brut (EB) ne provoque une mortalité qu’à partird’une dose élevée. La DL 50 est comprise entre 1,82 g/kg et 1,96 g/kg par voie i.p.Chez les têtards de grenouille et les alevins, la toxicité de l’EB obéit à la loi du « toutou rien ». Ce même extrait n’a aucune activité toxique sur les larves de moustique du moinsjusqu’à 2 mg/ml.Chez les végétaux, une activité inhibitrice de l’EB sur la germination de quelquesgraines et sur la croissance des jeunes plantules de riz et de haricot, a été constatée. L’EB etl’E 3 exercent une activité inhibitrice sur le développement des bourgeons axillaires.Aucune activité toxique de l’EB et de l’E 3 n’a été observée vis-à-vis des souches demicroorganismes testées.MOTS-CLESChassalia bojeriana, Rubiacée, vertu thérapeutique, DL 50 , CL 50 , activité toxique, toxine.Encadreurs : Professeur JEANNODA VictorDocteur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle A.D.