Nouvelles techniques d'imagerie laser (PDF ... - Mediachimie.org

Nouvellestechniquesd’imagerielaserLes chimistes utilisent depuislongtemps les interactionsavec la lumière pour observeret caractériser les milieuxorganiques ou inorganiques.La présence, dans la matière,de sites optiquement actifs,naturellement émetteurs delumière, est à l’origine desméthodes de microscopieoptique et d’imagerie.Ces méthodes, historiquementantérieures aux méthodes despectroscopies infrarouge ouvisibles-UV (où l’on mesurel’absorption de l’échantillonétudié en fonction de lalongueur d’onde d’un faisceaulumineux incident), connaissentà l’heure actuelle denouveaux développements.On peut attribuer ces progrèsen grande partie à l’avènementdes sources laser et auxphénomènes d’absorption àdeux photons (ADP)(ou phénomènesdits « biphotoniques »),auxquels leurs considérablesintensités lumineuses (milleà cent mille fois supérieures– en énergie instantanée – auxsources classiques) donnentnaissance.L’apparition de ces nouvellesméthodes, les microscopiesbiphotoniques, que leschimistes savent adapter auxsystèmes biologiques moléculaires,et leur perfectionnementconstant, ouvrentde nouvelles voies vers lacompréhension toujours plusfine des phénomènes biologiquesà l’échelle moléculaire,au sein de l’organisme vivant(nos tissus, nos cellules). Cechapitre en donne quelquesexemples.1 Avantagesde la microscopiebiphotonique et commentles optimiserL’excitation biphotonique,dépendant fortement de l’intensitélumineuse, ne seproduit en pratique qu’aupoint où celle-ci est maximum– c’est-à-dire au point focald’un montage d’illumination.La Figure 1 illustre bien cepoint : en éclairement à unphoton à 488 nm de longueurd’onde, l’ensemble du trajetdu faisceau est rendu visibleMireille Blanchard-Desce Nouvelles techniques d’imagerie laser

La chimie et la santémais elle évite égalementl’autofluorescence (fluorescencedes régions voisinesqui interfèrent avec le signalprincipal). En effet, comme lalongueur d’onde incidente nepeut produire que peu d’effetsà un photon, on peut exposerdes tissus biologiques pluslongtemps et sans dommagespour ces derniers, et limiter lebruit de fond dû à la fluorescencenaturelle, pour obtenirainsi des gains de sensibilitéappréciables.142Figure 1Contrastes en excitation monooubiphotonique. Dans le premiercas (A), l’ensemble des moléculessituées sur le parcours optiquesont émettrices de fluorescence.Dans le second cas (B), seulle point focal, où la lumièreexcitatrice est intense, estémetteur. l est la longueur d’ondeincidente du rayon lumineuxgénéré par un laser et focalisédans la cuve par passage à traversl’objectif du microscope (visible àdroite sur l’image).par fluorescence alors qu’enexcitation par deux photons à1 032 nm de longueur d’onde,seul le point focal émet lafluorescence.Cette propriété ouvre à lamicroscopie biphotoniquela possibilité de réaliser desimages en trois dimensions,par un jeu de translation del’objectif qui permet au pointfocal de balayer l’échantillonselon son axe, et de réaliserainsi de véritables « coupesoptiques ». La longueurd’onde excitatrice étant situéedans le rouge ou l’infrarougedu spectre lumineux (entre700 et 1 100 nm), et non dansl’ultra-violet, elle aura unebien meilleure pénétrationdans les tissus vivants etpourra en fournir une imageplus complète.Qualifiée d’imagerie douce,cette microscopie biphotoniquepermet par ailleursd’éviter les photodommages,tels que l’altération de la peauou de l’ADN pouvant survenirlors d’expositions aux UV ;La microscopiebiphotonique est unetechnique d’imageriedouce, qui permetd’obtenir de bonnesqualités d’images decoupes des tissus etcellules vivants, grâce àune bonne pénétrationde la lumière.Une fois les caractéristiquesde cette technique spécifiéesde manière qualitative, sepose le problème de la quantificationdu phénomène d’absorptionsimultanée de deuxphotons. Alors que, dans lecas d’un photon, la réponsede la molécule excitée à unelongueur d’onde donnée estmesurée par le coefficientd’extinction molaire, enabsorption à deux photons(ADP), elle est mesuréepar la section efficace ADPdont l’unité de mesure est leGöppert-Mayer (GM), du nomde la première physicienne àavoir envisagé la possibilité del’absorption à deux photons(Figure 2).Pour faire de l’imagerie parabsorption à deux photons,on a donc besoin de bonnes

sections efficaces d’ADP et debons rendements quantiquesde fluorescence. On introduitalors une grandeur, labrillance à deux photons, quiest le produit des deux grandeursprécédentes. Si cettebrillance est importante dansla plage de longueur d’ondequi nous intéresse, la moléculesera observable par lamicroscopie biphotonique.Dans l’étude des systèmesbiologiques, on cherchera àatteindre de fortes brillancesdans la gamme de longueursd’onde allant de 700 nm à1 100 nm. Pour ce faire, onpourra utiliser des moléculesaux propriétés émettricesefficaces – des chromophoresbiphotoniques – et lesintroduire dans le système àétudier pour en accroître laréponse.1.1. Le rôle du chimiste dansle développement de cesnouvelles techniquesL’utilisation de ces nouvellestechniques optiques requiertainsi au premier chef l’interventionde chimistes, quivont concevoir et réaliser deschromophores appropriés auxdiverses études entreprises.Des expériences montrentque les meilleurs des chromophoresendogènes commela riboflavine 1 ont des sectionsefficaces d’ADP de l’ordre de1 GM. Par conséquent pourque l’ADP ne produise pas dedommages sur le système1. La riboflavine, encore appeléevitamine B2 (apportée par leslaitages, viandes et poissons), estune molécule largement présentedans notre organisme (intestins,cœur, cerveau) où elle jour un rôleimportant.biologique, il faut produire deschromophores synthétiquesantennes, ayant une sectionefficace d’ADP largementsupérieure à celle des tissusbiologiques (et donc des chromophoresendogènes), soitenviron 1 000 GM et au-delà.Cela permet alors une sélectivitéd’excitation importante,les molécules non synthétiquesétant alors non affectéespar l’irradiation. De plus, ceschromophores synthétiquesdoivent être de petite taillepour pouvoir s’insérer dans lemilieu biologique et permettred’en faire l’image.À l’heure actuelle, les fluorophorescommerciaux nerépondent pas à ces objectifset ne permettent pas debénéficier des effets de sélectivitéde l’absorption à deuxphotons. Le chimiste va doncse fixer, pour définir et réaliserles chromophores adaptés, lecahier des charges suivant :– rendement quantique defluorescence élevé ;– section efficace d’ADP trèsélevée dans la gamme 700 à1 100 nm ;– molécule non excitable parun seul photon dans cettemême gamme, car le monophotoniquenécessitant moinsd’énergie l’emporterait sur lebiphotonique.Si ces critères sont bienremplis, on obtient alors :– une image en 3D ;– une sensibilité plus élevée ;– une réduction des photodommagespour le milieuenvironnant.L’ingénierie moléculairepour l’absorption à deuxphotons a mis en évidence lesFigure 2Maria Göppert-Mayer obtint leprix Nobel de physique en 1963.C’est en 1929, au cours de sa thèseen physique, qu’elle démontrathéoriquement l’existence del’absorption à deux photons.Ce phénomène fut mis en évidenceseulement trente ans après,lors de l’apparition des lasers.Nouvelles techniques d’imagerie laser143

La chimie et la santé144Figure 3Chromophores et ingénieriemoléculaire. L’étude optiquemontre l’intérêt de la présenced’un groupe donneur d’éléctrons(D) séparé d’un groupe accepteurd’électrons (A) par un systèmeπ-conjugué, conduisant à descomposés dits « push-pull ». Laprésence de chaînes lipidiques surle motif donneur et d’une charge(positive) sur le motif accepteurpermettent au chromophorede s’insérer dans les zonesmembranaires de la cellule,et favorisent une orientationparticulière au sein de cettemembrane (flèche rouge).Figure 4Images simultanées obtenues parémission de fluorescence à deuxphotons (A) ou par GSH (B, et voirl’encart « La spectroscopie à deuxphotons »). Les chromophoresfluorescents rentrent dansles cellules, mais seuls leschromophores orientés dans lamembrane donnent une image GSH.principales corrélations entrestructure moléculaire et efficacitéen ADP. Ainsi, on saitque pour des molécules detype quadripôles (assemblagesymétrique de deux dipôles),la réponse à deux photonsest élevée, et que la gammede réponse de la moléculesynthétisée peut être ajustéeà la gamme d’intérêt biologique(700 nm à 1 100 nm). Onmontre aussi, autre exemple,l’intérêt des chromophoresdits « push-pull » (Figure 3).L’ingénierie moléculaire anotamment permis d’accéderà des systèmes répondantau cahier des chargesétabli plus haut et présentantdes sections efficacesd’ADP dépassant 5 000 GM àcertaines longueurs d’onde,et supérieure à 1 000 GM surune large plage de la gammespectrale d’intérêt biologique(700 à 1 000 nm). En outre,comme on le souhaite, la fluorescenceest importante àtoutes ces longueurs d’onde.La synthèse de fluorophoresde pointe conçus selon cesprincipes a permis de visualiserles régions membranairesdans les échantillons biologiquescellulaires (Figure 4).1.2. Vers des sondesbiphotoniques ?La microscopie par observationde la lumière émise parfluorescence révèle la répartitiondes molécules émettricesprésentes dans l’échantillonétudié et permet ainsi d’analyserles systèmes hétérogènescomme ceux présentschez le vivant.On peut aussi concevoir desmolécules émettrices dontl’efficacité dépend d’un paramètrephysico-chimique local.La cartographie fera alorsressortir les zones de l’échantillonoù ces paramètres ontles valeurs particulières appeléespar le phénomène utilisé,qu’il s’agisse de fluorescenceou de GSH (Encart « La spectroscopieà deux photons »), etdifférentes dans les deux cas.

LA SPECTROSCOPIE À DEUX PHOTONSLes intensités lumineuses gigantesques (des gigawatts instantanés) que peut atteindre lalumière produite par les lasers, en particulier par ceux qui délivrent la lumière par brèvesimpulsions (de durées inférieures à quelques nanosecondes), permettent d’observer desphénomènes d’absorption à deux photons, inobservables avec les sources lumineusesclassiques.Avec ces dernières, l’interaction de la lumière avec une molécule se fait par transitions monophotoniques: l’énergie d’un photon est transférée du faisceau lumineux incident à la molécule,qui est ainsi portée dans un état excité d’énergie supérieure à son état fondamental par unequantité d’énergie égale à celle d’un photon. C’est ce phénomène de base qui est utilisé parles méthodes traditionnelles de microscopie ou d’imagerie, ainsi que des méthodes d’étudesspectroscopiques. Avec de très grandes intensités lumineuses, le transfert simultané del’énergie de deux photons (biphotonique) du faisceau lumineux à la molécule peut intervenirpar un processus non-linéaire. De même que l’on parle classiquement d’absorption parprocessus monophotonique (qu’on abrège en « absorption ») de la lumière, on peut parconséquent parler d’absorption à deux photons (Figure 5).Nouvelles techniques d’imagerie laserFigure 5Multiphotonique : imagerie combinée. La figure résume les transferts d’énergie qui prennent place dansl’interaction biphotonique. Le faisceau incident (flèches rouges) porte la molécule dans un état électroniqueexcité par transfert de deux photons. Le retour à l’état fondamental se fait par l’un ou l’autre des deuxmécanismes qui donnent chacun naissance à une émission lumineuse caractéristique : la fluorescence (envert) et la « génération de seconde harmonique » (GSH) (en violet).Dans le phénomène de fluorescence, le retour à l’état fondamental après excitation se faitpar émission (en vert sur la figure) d’un photon d’énergie un peu inférieure à celle du photonincident photonique (dans le processus monophotonique) ou de deux photons incidents (enrouge sur la Figure 5) dans le cas de l’absorption biphotonique (FEDP) : c’est le phénomène dela fluorescence. Le décalage entre la longueur d’onde de la lumière émise par fluorescenceet celle, un peu plus courte, de la lumière excitatrice, traduit qu’un très rapide réarrangementdes atomes au sein de la molécule (dénommé « relaxation ») a dissipé une (petite) quantitéd’énergie entre excitation et émission.Le phénomène de génération de seconde harmonique (GSH), bien que produit par la mêmeexcitation de base, est de nature différente. Il a d’abord été découvert dans l’étude optique decristaux d’oxydes métalliques qu’une émission d’un faisceau lumineux de longueur d’ondemoitié (seconde harmonique) de celle du faisceau incident (énergie de photon double) pouvaitprendre place dans une direction bien définie de l’espace, déterminée par les propriétés ducristal. L’étude de ce phénomène, aujourd’hui largement utilisé en optique non-linéaire,a montré que son intensité dépend étroitement à la fois des propriétés d’ensemble de145

La chimie et la santél’arrangement des atomes dans le cristal et des propriétés électriques du milieu. L’applicationde ce phénomène aux systèmes biologiques a représenté une approche hardie, compte tenudes différences intrinsèques entre les milieux, mais qui se révèle très prometteuse. L’ordretrès local des systèmes moléculaires biologiques permet en effet de conserver certaines despropriétés optiques observées dans les cristaux, malgré l’absence d’ordre à longue distance,et une production significative de seconde harmonique. Les informations que l’on tire de sonétude sont alors précisément de caractérisation de cet ordre local ; c’est en particulier le casdans les systèmes membranaires, sans surprise, vu leur organisation spatiale poussée.Les deux phénomènes de fluorescence et de génération de seconde harmoniqueinterviennent simultanément consécutivement à l’excitation lumineuse. Ils correspondentchacun à l’émission de photons de longueurs d’onde différentes (la moitié de la longueurd’onde incidente pour la GSH, déplacée vers les plus grandes longueurs d’onde pourl’émission de fluorescence). Ils peuvent donc être étudiés séparément sans interférence del’un vers l’autre, par l’utilisation de détecteurs sélectifs en longueur d’onde.Figure 6Principe des émissionsconsécutives à l’excitationbiphotonique, la fluorescenceet la seconde harmonique,et un exemple de leur détection.Les chromophores correspondantsjouent alors le rôle desonde pour les valeurs de cesparamètres. On peut donnerles exemples suivants.1.2.1. Les sondesbiphotoniques de pHLes sondes de pH biphotoniquespermettent de connaîtreavec précision la concentrationen protons H + à proximitéde certaines molécules. Leprincipe consiste à utiliser lavariation de la section efficaced’ADP entre le cas oùla molécule est protonée etdéprotonée, et d’en faire latraduction au niveau du pH 2 .1.2.2. Les sondes de potentiel(voltmètres moléculaires)Par ailleurs, la génération deseconde harmonique (GSH), quiest un phénomène simultanéà l’émission de fluorescence(Encart « La spectroscopieà deux photons »), a permisde développer des sondes depotentiel. La GSH consisteen l’arrivée simultanée dedeux photons sur la mêmemolécule qui se « combinent» pour en produire untroisième d’énergie double(et donc de longueur d’ondemoitié). L’absorption à deuxphotons permet de sonder etde localiser le milieu étudiégrâce au phénomène de fluorescence,tandis que la GSHpermet de connaître l’ordrelocal du système. Le mêmechromophore reémet alors1462. Rappelons que le potentielhydrogène est défini par : pH = –log [H + ], [H + ] étant la concentrationen protons.

deux signaux différents, celuide l’émission de fluorescenceet celui de la seconde harmonique,qui donnent des informationscomplémentaires surle système étudié (Figure 6).Cependant une limite importanteexiste pour pouvoirobserver la GSH. En effet, ilest nécessaire de travailleravec des molécules asymétriques,qui de plus s’organisentde manière asymétrique. Pourfaire de l’imagerie combinée,on a besoin de travailler surdes systèmes pour lesquelsles deux phénomènes (ADPet GSH) se produisent demanière importante. Dessystèmes répondant bien àces deux types d’excitationsont les chromophores dits« push-pull » (Figure 3).Sensible à l’ordre local, la GSHest une technique de mesuredes distances inter-membranairesdifficilement accessiblesjusque-là (Figure 7).Par ailleurs, le phénomènede GSH permet égalementde mesurer le potentiel électriqueen tout point d’unemembrane et par conséquentde connaître l’activité électriquecellulaire 3 . Le principerepose sur le fait que l’intensitédu signal de GSH varieavec le potentiel. Le suivi dela variation de cette intensitédans le temps permet alorsde suivre en direct la variationde potentiel en tout point dela membrane puisqu’on a uneimage 3D (Figure 8).3. Rappelons que nos cellulesvivantes sont en activitépermanente, et de nombreux fluxde molécules et d’ions ont lieu depart et d’autre des membranescellulaires, générant une activitéélectrique.Figure 7Modèle de l’arrangementdes chromophores permettantde visualiser les membranesdes cellules vivantes par analysede la GSH. Cela permet de réaliserune imagerie dynamique desprocessus membranaires.Nouvelles techniques d’imagerie laserFigure 8L’intensité du signal de GSH généréau niveau de la membrane demodèles simplifiés de cellulesvarie linéairement avec le potentielélectrique. Les moléculesintroduites dans le milieu et quigénèrent ce signal (telles que cellereprésentée ici) se comportentdonc comme de véritablesvoltmètres membranaires. Cecipermet d’envisager leur utilisationpour le suivi spatio-temporel del’activité électrique de véritablescellules.147

La chimie et la santé148Figure 9L’imagerie biphotonique parobservation de la GSH permet devisualiser des réseaux neuronaux.Un exemple est donné ici avecl’image de neurones de culture(aplysie) marqués avec desmolécules adaptées (« voltmètresmembranaires ») et imagé parGSH. La longueur d’onde employéepour réaliser cette image (940 nm)permet de s’affranchir des effetsde photodommages et de pouvoirvoir « en profondeur » grâce à unemeilleure pénétration dans lestissus. Collaboration D. Dombeck,W.W. Webb (Cornell).Des tests effectués sur desmodèles simplifiés de cellulesmontrent que l’intensité deGSH varie très sensiblementavec le potentiel électrique etceci de manière très rapide(i.e. en temps réel). Ces moléculesconstituent donc devéritables voltmètres moléculairesde nos cellules !Ces propriétés ont été appliquéesau suivi spatio-temporelde l’activité électrique decellules neuronales avec uneexcellente résolution spatiale(inférieure au micromètre)et temporelle (inférieure à lamilliseconde) (Figure 9).2Des nanosondesentièrementorganiques pourde nouvelles percéesen imagerieLes objets nanométriquesles plus populaires à l’heureactuelle notamment pour leurutilisation en imagerie biologiquesont les « quantumsdots » (ou points quantiques).Ces nano-objets, à base desemi-conducteurs, présententl’avantage d’être extrêmementbrillants et robustes. Ils existentde plus dans toute unepalette de tailles et de couleursdifférentes. Ils présententtoutefois l’inconvénient d’incluredans leur structure desmétaux lourds (comme parexemple le cadmium), ce quipose un problème de toxicitéet restreint leur utilisationpour l’imagerie médicale etdans le domaine de la santéhumaine. Cela soulève égalementle problème de leurbiodégradabilité et du risqueécologique associé aux rejetsdans l’environnement.Face à cette problématique, larecherche s’est orientée versl’élaboration de substitutsdes quantums dots à traversla réalisation de nano-objets« mous » (par rapport aucaractère « dur » des nanoparticulesles plus classiques), etconstruits à partir de modulescomplètement organiques.Il s’agissait de concevoir desalternatives à la fois bio- etéco-compatibles aux quantumsdots, et que l’on puisse àterme utiliser pour l’imageriemédicale. Et ceci en arrivant àatteindre le même niveau deperformances techniques (entermes de brillance notamment)que les quantums dots.L’idée pour accéder à de telsobjets a consisté à confiner ausein de nanoparticules organiquesun grand nombre de fluorophores,la cohésion de l’objetsynthétisé étant assurée pardes liaisons chimiques. Pourparvenir à une telle réalisation,il fallait néanmoins surmonter

Nouvelles techniques d’imagerie laserdeux difficultés techniquesimportantes. La première estd’arriver à fixer les chromophoresde manière efficace etcontrôlée sur une plateformede taille nanométrique. Laseconde est de parvenir à ceque le confinement dans lananoparticule ne diminue pasla luminescence des chromophores.Après de nombreux travauxde recherche, ces difficultéstechniques ont enfin pu êtresurmontées grâce à l’utilisationde nouveaux objetschimiques, les dendrimères,molécules globulaires ramifiéesaisément modulables àla masse désirée et auxquelleson peut fixer les chromophoressouhaités (Figures 10et 11).La fluorescence des chromophoresintroduits dansle dendrimère est essentiellementconservée et, autotal, la réponse à l’excitationaugmente de façon linéaireavec le nombre de chromophoresdu dendrimère (doncexponentielle avec leur taille).On peut de cette façon obtenirdes images d’objets difficilesà visualiser avec d’autreschromophores inaccessiblesaux techniques monophotoniques(Figure 12).Figure 10Une voie modulaire vers lesnanodots organiques ? Ledendrimère est une moléculeconstituée par l’assemblage ensymétrie globulaire de fragmentsrayonnants. On peut fixer deschromophores sur les élémentsrayonnants, réalisant ainsi un« nanodot » tout organique.Figure 11Les nanodots : une approchemodulaire. La taille desdendrimères, d’après leurconception même, peut être ajustéeet permet d’obtenir des nanoobjetsluminescents efficaces pourtoute une variété d’applications [1].149

La chimie et la santéFigure 12Image d’un réseau vasculaireobtenu in vivo par l’injection denanodots organiques [2]. Collab.S. Charpak, L. Moreaux (INSERM,Paris Descartes).Figure 13Exemple d’imagerie obtenuein vivo du petit animal parl’utilisation de nanodots organiques.Un autre intérêt majeurdes dendrimères vient ducontrôle de leur dimension: on peut conserver lataille et jouer sur la naturedu fluorophore greffé pourmodifier les propriétés dunano-objet fabriqué, alorsque pour les quantum dots,chaque taille correspondà une propriété (couleur)particulière. Ces importantsprogrès ont permis d’obtenirdes images inédites.On a ainsi pu observer lecerveau d’un rat grâce à l’injectiond’un nanodot émetteurbleu. Un autre exempleest celui de l’injection d’unnanodot émetteur vert ayantpermis la visualisation dusystème vasculaire du têtardde Xenopus (Figure 13) aprèsinjection intracardiaque.Des nanodots hydrosolubles émetteurs verts sont injectés en intracardiaque dans le têtard de Xenopuspermettant ultérieurement la visualisation 3D du système vasculaire musculaire par imagerie multiphotonique.Collab. F. Tiaho, G. Recher (CNRS-Univ. Rennes 1).150

ConclusionCes travaux sur les techniques d’absorption àdeux photons ouvrent de nouvelles perspectives,tant au niveau de l’imagerie biomédicale(diagnostic précoce, assistance à la chirurgieperoperatoire) que de la thérapie, notammentanticancéreuse.Nouvelles techniques d’imagerie laserBibliographie[1] a) Blanchard-Desce (2007),Chem. Commun., 915-917 ; b)Blanchard-Desce (2007), NewJ. Chem., 31 : 1354-1367.[2] Blanchard-Desce (2006),Angew. Chem., Int. Ed., 45 :4645-4648.151

La chimie et la santéCréditsphotographiques– Fig. 12 : Krishna T.R., ParentM., Werts M.H.V., MoreauxL., Gmouh S., Charpak, S.,Caminade A.-M., MajoralJ.-P., Blanchard-Desce M.(2006). Angewandte Chemie.