Fonction et régulation de la protéine ICAP-1alpha dans la ...

tel-00435843, version 1 - 24 Nov 2009
II.2.5. La CaMKII régule négativement la dynamique des adhérences focales selon une
voie dépendante de la phosphorylation de la protéine ICAP-1α et de l’interaction
d’ICAP-1α avec l’intégrine β1
Les modifications de la morphologie et de la distribution des adhérences focales induites par
l’inhibition de la CaMKII suggèrent son implication dans la régulation de la dynamique des
adhérences focales. Afin de caractériser l’effet de la CaMKII sur cette dynamique, les cellules
sauvages (Icap-1 +/+ et β1 WT ) et les cellules Icap-1 rescue , Icap-1 T38A , Icap-1 T38D , β1 V787T et
β1 D759A exprimant la protéine VASP-EGFP ou –mRFP (monomeric Red Fluorescent Protein)
ont été traitées ou non au KN-93 puis observées par vidéomicroscopie (Figure 27). Comme la
réexpression d’ICAP-1α sauvage ou mutant T38A ou T38D dans les cellules Icap-1 -/s’accompagne
de l’expression de la protéine EGFP (système pCLMFG-ICAP-1α-IRES-
EGFP), la protéine VASP-mRFP a été utilisée comme marqueur des adhérences dans ces
cellules.
Contrairement aux cellules contrôles où chacune des adhérences focales s’assemble au front
de migration et se désassemble de façon isolée (Figure 27A), le traitement au KN-93 favorise
leur fusion en larges adhérences à l’avant des cellules qui présentent une dynamique ralentie
avec un temps de vie moyen d’environ 120 minutes. Ces adhérences pourraient correspondre
à celles observées à 2 heures d’étalement dans les cellules Icap-1 +/+ , Icap-1 rescue et β1 sauvage
traitées au KN-93.
Afin d’identifier l’étape du cycle de vie des adhérences focales contrôlée par la CaMKII, des
adhérences focales isolées ne fusionnant pas entre elles sont sélectionnées pour ne pas biaiser
les mesures de dynamique. Trois paramètres sont mesurés : les vitesses initiales d’assemblage
et de désassemblage et la durée de vie des adhérences focales (Figure 27B et C).
Dans les conditions contrôles, par rapport aux cellules sauvages (Icap-1 +/+ et Icap-1 rescue ), la
perte d’ICAP-1α accélère la phase d’assemblage, réduit le temps de vie mais ne modifie pas
la vitesse de désassemblage des adhérences (Figure 27B). Ces résultats sont en accord avec
ceux obtenus avec les MEFs (partie I) (Millon-Fremillon, Bouvard et al. 2008). Le mutant non
phosphorylable ICAP-1 T38A produit un effet similaire à la perte d’ICAP-1α. A l’inverse, la
mutation phosphomimétique T38D réduit de manière significative la dynamique des
adhérences focales avec une baisse des vitesse d’assemblage et de désassemblage et une
augmentation du temps de vie des adhérences par rapport aux cellules Icap-1 T38A . L’inhibition
de la CaMKII par le KN-93 dans les cellules sauvages (Icap-1 +/+ et Icap-1 rescue ) stimule le
cycle dynamique des adhérences focales et mime la perte d’ICAP-1α et la mutation non
phosphorylable T38A. Le traitement au KN-93 ne produit aucun changement significatif de la
dynamique des adhérences focales des cellules Icap-1 -/- et Icap-1 T38A et Icap-1 T38D .
La dynamique des adhérences focales dans les ostéoblastes exprimant la forme sauvage de
l’intégrine β1 a également été comparée à celle des cellules exprimant les mutants β1 V787T et
β1 D759A (Figure 27C). Comme montrée en partie I, la pré-activation de l’intégrine β1 induite
par la mutation D759A accélère l’assemblage, réduit le temps de vie des adhérences focales
mais ne change pas leur vitesse de désassemblage. Le mutant β1 V787T qui n’interagit pas avec
ICAP-1 induit un phénotype similaire au mutant β1 D759A . Dans les cellules sauvages β1 WT ,
l’inhibition de la CaMKII par le KN-93 reproduit ces deux phénotypes β1 V787T et β1 D759A .
L’inhibition de la CaMKII, la perte de l’interaction ICAP-1α/β1 ou la pré-activation de
l’intégrine β1 accélèrent la dynamique des adhérences focales et produisent un effet opposé à
la phosphorylation d’ICAP-1. Ces données suggèrent que la CaMKII ralentit l’assemblage des
adhérences focales en régulant négativement l’activation de l’intégrine β1 de façon similaire à
ICAP-1α. La CaMKII permet la phosphorylation d’ICAP-1α sur la thréonine 38 et favorise
son interaction directe sur l’intégrine β1.
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