Fonction et régulation de la protéine ICAP-1alpha dans la ...

tel-00435843, version 1 - 24 Nov 2009
II.2.2. L’action négative de la CaMKII sur la croissance des adhérences focales à
intégrine β1 β1 β1 requiert la phosphorylation d’ICAP-1α
La mutation phosphomimétique de la thréonine 38 (ICAP-1 T38D ) altère l’étalement cellulaire
dépendant de l’intégrine α5β1, de façon similaire à l’activation constitutive de la CaMKII, et
l’inhibition de la CaMKII ne restaure pas le phénotype (Bouvard and Block 1998).
Inversement, la substitution T38A non phosphorylable stimule fortement l’adhérence
cellulaire comme l’inhibition de la CaMKII. Afin de caractériser plus précisément la
morphologie des sites d’adhérence, un immunomarquage de la vinculine et de l’intégrine β1 a
été effectué dans les cellules exprimant (Icap-1 rescue ) ou non (Icap-1 -/- ) la forme sauvage
d’ICAP-1α ou les mutants ICAP-1 T38A (Icap-1 T38A ) ou ICAP-1 T38D (Icap-1 T38D ) et traitées ou
non au KN-93 sur une courte (2 heures) ou une longue durée (16 heures) (Figure 24). Ces
trois lignées cellulaires ont été générées par infection rétrovirale des cellules Icap-1 -/- .
L’inhibition de la CaMKII dans les cellules Icap-1 rescue étalées sur une courte durée (2 heures)
stimule la croissance des adhérences focales (Figure 24A et B). A l’inverse, les cellules Icap-
1 -/- ne sont pas sensibles au KN-93. Le mutant ICAP-1 T38A est également insensible à
l’inhibition de la CaMKII (Figure 24A et B). Par contre, la mutation phosphomimétique T38D
d’ICAP-1α réduit fortement la taille des adhérences focales à intégrines β1 de façon similaire
à l’activation constitutive de la CaMKII (Figure 24A et B). La phosphorylation d’ICAP-1α
sur la thréonine 38 altère la formation des adhérences focales et l’inhibition de la CaMKII par
le KN-93 ne restaure pas le phénotype sauvage. Le niveau de phosphorylation de la protéine
ICAP-1α et l’activité de la CaMKII n’a pas d’action significative sur la densité des récepteurs
β1 dans les adhérences focales (Figure 24B).
Sur un étalement de longue durée (16 heures), le traitement au KN-93 induit une distribution
centrale des adhérences focales, et mime le phénotype des cellules Icap-1 -/- (Millon-
Fremillon, Bouvard et al. 2008) (Figure 24C). Cette délocalisation des adhérences induite par
le KN-93 n’est pas observée dans les cellules Icap-1 T38A et T38D . L’intégrine β1 constitue une
cible spécifique de la voie CaMKII/ICAP-1α car la distribution des adhérences focales à
intégrines β3 dans les cellules étalées sur vitronectine n’est pas modifiée par l’inhibition de la
CaMKII ou les mutants ICAP-1 T38A et ICAP-1 T38D (Figure 24C). L’ensemble de ces données
suggère que la phosphorylation d’ICAP-1α est requise pour la régulation négative de la taille
et de la distribution des adhérences focales contenant l’intégrine β1 par la CaMKII.
Figure 24 : La phosphorylation d’ICAP-1α est nécessaire à l’action négative de la CaMKII sur l’adhérence
dépendante de l’intégrine β1.
A. Images des ostéoblastes Icap-1 rescue , Icap-1 -/- , Icap-1 T38A et Icap-1 T38D (microscope confocal Zeiss, LSM510).
Les cellules sont traitées ou non au KN-93 (10µM). Après 2 heures d’étalement sur fibronectine (10µg/ml), les
cellules sont fixées et immunomarquées afin de visualiser la vinculine et l’intégrine β1 active (marquée au
9EG7). Echelle : 10µm.
B. Analyse quantitative de la surface des adhérences focales contenant l’intégrine β1 et de l’intensité de
fluorescence de l’intégrine β1 dans les adhérences focales des cellules Icap-1 rescue , Icap-1 -/- , Icap-1 T38A et Icap-
1 T38D traitées ou non au KN-93 (10µM).
C. Images des ostéoblastes Icap-1 rescue , Icap-1 -/- , Icap-1 T38A et Icap-1 T38D traités ou non au KN-93 (10µM)
(microscope apotome Zeiss). Après 16 heures d’étalement sur fibronectine (10µg/ml), les cellules sont fixées et
immunomarquées afin de visualiser la vinculine et l’intégrine β3 ou l’intégrine β1 activée (marquée au 9EG7).
Echelle : 10µm.
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