Fonction et régulation de la protéine ICAP-1alpha dans la ...

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tel-00435843, version 1 - 24 Nov 2009 Figure 23 : La régulation négative des adhérences à intégrines β1 par la CaMKII est dépendante d’ICAP-1α. A. Images des ostéoblastes sauvages (Icap +/+ ), Icap-1 -/- et Icap-1 rescue (microscope confocal Zeiss, LSM510). Les cellules sont traitées ou non au KN-93 (10µM) ou expriment le mutant constitutivement actif CaMKII T286D (dans le cas des cellules Icap-1 +/+ et Icap-1 -/- ). Après 2 heures d’étalement sur fibronectine (10µg/ml), les cellules sont fixées et immunomarquées afin de visualiser la vinculine et l’intégrine β1 active (marquée au 9EG7). Les cellules exprimant le mutant CaMKII T286D sont révélées par immunomarquage de la CaMKIIα. Echelle : 10µm. B-C. Analyse de la morphométrie des adhérences focales contenant l’intégrine β1 (B) ou β3 (C) des cellules Icap-1 +/+ , Icap-1 -/- et Icap-1 rescue traitées ou non au KN-93 (10µM) ou exprimant le mutant CaMKII T286D : Surface moyenne des adhérences focales contenant l’intégrine β1 ou β3 et intensité moyenne de fluorescence par pixel de l’intégrine β1 ou β3 dans les adhérences focales. D. Images des ostéoblastes sauvages (Icap +/+ ), Icap-1 -/- et Icap-1 rescue traités ou non au KN-93 (10µM) (microscope apotome Zeiss). Après 16 heures d’étalement sur fibronectine (10µg/ml), les cellules sont fixées et immunomarquées afin de visualiser la vinculine et l’intégrine β3 ou l’intégrine β1 active (marquée au 9EG7). Echelle : 10µm. Résultats | 93

tel-00435843, version 1 - 24 Nov 2009 II.2.2. L’action négative de la CaMKII sur la croissance des adhérences focales à intégrine β1 β1 β1 requiert la phosphorylation d’ICAP-1α La mutation phosphomimétique de la thréonine 38 (ICAP-1 T38D ) altère l’étalement cellulaire dépendant de l’intégrine α5β1, de façon similaire à l’activation constitutive de la CaMKII, et l’inhibition de la CaMKII ne restaure pas le phénotype (Bouvard and Block 1998). Inversement, la substitution T38A non phosphorylable stimule fortement l’adhérence cellulaire comme l’inhibition de la CaMKII. Afin de caractériser plus précisément la morphologie des sites d’adhérence, un immunomarquage de la vinculine et de l’intégrine β1 a été effectué dans les cellules exprimant (Icap-1 rescue ) ou non (Icap-1 -/- ) la forme sauvage d’ICAP-1α ou les mutants ICAP-1 T38A (Icap-1 T38A ) ou ICAP-1 T38D (Icap-1 T38D ) et traitées ou non au KN-93 sur une courte (2 heures) ou une longue durée (16 heures) (Figure 24). Ces trois lignées cellulaires ont été générées par infection rétrovirale des cellules Icap-1 -/- . L’inhibition de la CaMKII dans les cellules Icap-1 rescue étalées sur une courte durée (2 heures) stimule la croissance des adhérences focales (Figure 24A et B). A l’inverse, les cellules Icap- 1 -/- ne sont pas sensibles au KN-93. Le mutant ICAP-1 T38A est également insensible à l’inhibition de la CaMKII (Figure 24A et B). Par contre, la mutation phosphomimétique T38D d’ICAP-1α réduit fortement la taille des adhérences focales à intégrines β1 de façon similaire à l’activation constitutive de la CaMKII (Figure 24A et B). La phosphorylation d’ICAP-1α sur la thréonine 38 altère la formation des adhérences focales et l’inhibition de la CaMKII par le KN-93 ne restaure pas le phénotype sauvage. Le niveau de phosphorylation de la protéine ICAP-1α et l’activité de la CaMKII n’a pas d’action significative sur la densité des récepteurs β1 dans les adhérences focales (Figure 24B). Sur un étalement de longue durée (16 heures), le traitement au KN-93 induit une distribution centrale des adhérences focales, et mime le phénotype des cellules Icap-1 -/- (Millon- Fremillon, Bouvard et al. 2008) (Figure 24C). Cette délocalisation des adhérences induite par le KN-93 n’est pas observée dans les cellules Icap-1 T38A et T38D . L’intégrine β1 constitue une cible spécifique de la voie CaMKII/ICAP-1α car la distribution des adhérences focales à intégrines β3 dans les cellules étalées sur vitronectine n’est pas modifiée par l’inhibition de la CaMKII ou les mutants ICAP-1 T38A et ICAP-1 T38D (Figure 24C). L’ensemble de ces données suggère que la phosphorylation d’ICAP-1α est requise pour la régulation négative de la taille et de la distribution des adhérences focales contenant l’intégrine β1 par la CaMKII. Figure 24 : La phosphorylation d’ICAP-1α est nécessaire à l’action négative de la CaMKII sur l’adhérence dépendante de l’intégrine β1. A. Images des ostéoblastes Icap-1 rescue , Icap-1 -/- , Icap-1 T38A et Icap-1 T38D (microscope confocal Zeiss, LSM510). Les cellules sont traitées ou non au KN-93 (10µM). Après 2 heures d’étalement sur fibronectine (10µg/ml), les cellules sont fixées et immunomarquées afin de visualiser la vinculine et l’intégrine β1 active (marquée au 9EG7). Echelle : 10µm. B. Analyse quantitative de la surface des adhérences focales contenant l’intégrine β1 et de l’intensité de fluorescence de l’intégrine β1 dans les adhérences focales des cellules Icap-1 rescue , Icap-1 -/- , Icap-1 T38A et Icap- 1 T38D traitées ou non au KN-93 (10µM). C. Images des ostéoblastes Icap-1 rescue , Icap-1 -/- , Icap-1 T38A et Icap-1 T38D traités ou non au KN-93 (10µM) (microscope apotome Zeiss). Après 16 heures d’étalement sur fibronectine (10µg/ml), les cellules sont fixées et immunomarquées afin de visualiser la vinculine et l’intégrine β3 ou l’intégrine β1 activée (marquée au 9EG7). Echelle : 10µm. Résultats | 94

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