Fonction et régulation de la protéine ICAP-1alpha dans la ...

tel-00435843, version 1 - 24 Nov 2009
II.2. Résultats
II.2.1. La CaMKII régule négativement les adhérences focales à intégrine β1 β1 β1 selon une
voie dépendante de la protéine ICAP-1α
L’effet négatif de la CaMKII sur l’adhérence cellulaire implique ICAP-1α (Bouvard and
Block 1998). Afin de caractériser l’effet conjoint de la CaMKII et d’ICAP-1α plus
précisément au niveau des structures d’adhérence, un inhibiteur pharmacologique de la
CaMKII, le KN-93 a été utilisé sur des ostéoblastes sauvages (Icap-1 +/+ ), déficients en ICAP-
1α (Icap-1 -/ ) - ou réexprimant la protéine ICAP-1α (Icap-1 rescue ). Ces cellules traitées ou non
au KN-93 sont étalées sur une matrice de fibronectine pendant 2 heures ou 16 heures . La
vinculine et les intégrines à chaîne β1 ou β3 sont alors immunomarquées afin de visualiser les
adhérences focales.
Sur une courte durée d’étalement (2 heures), l’inhibition de la CaMKII par le KN-93
augmente la taille des adhérences focales des ostéoblastes de type sauvage (Icap-1 +/+ ) (Figure
23A). Au contraire, la perte d’ICAP-1α rend les cellules insensibles au KN-93. La
restauration de l’expression d’ICAP-1α dans les cellules Icap-1 -/- reproduit l’effet du KN-93
dans les cellules sauvages confirmant que ce phénotype est bien dépendant d’ICAP-1α.
L’expression d’un mutant constitutivement actif de l’isoforme α de la CaMKII, le mutant
CaMKII T286D dans les cellules sauvages réduit sensiblement la surface des adhérences focales
(Figure 23A). Ce mutant présente une substitution phosphomimétique de la thréonine 286
dont la phosphorylation active l’enzyme. L’isoforme α de la CaMKII étant exprimée de façon
très modérée dans les ostéoblastes (Yuan, Chung et al. 2007), l’effet du mutant sur
l’adhérence cellulaire est dominant. Dans les cellules Icap-1 -/- , ce mutant CaMKII T286D
n’induit aucune réduction de la taille des adhérences focales suggérant que ICAP-1α est
impliquée dans la régulation négative des adhérences focales par la CaMKII. La
quantification de la surface moyenne des adhérences focales contenant l’intégrine β1 des
cellules traitées au KN-93 ou exprimant le mutant CaMK T286D confirme ces observations
(Figure 23B). Les phénotypes induits par l’inhibition ou l’activation de la CaMKII ne
s’accompagnent pas d’une modification de l’avidité des intégrines. En effet, l’estimation de la
densité en récepteurs dans les adhérences focales par la mesure de l’intensité moyenne de
fluorescence par unité de surface de l’intégrine β1 dans les adhérences focales ne montre
aucune variation de la quantité de cette intégrine lorsque la CaMKII est inhibée ou activée
(Figures 23B). Les phénotypes imposés par l’inhibition ou l’activation de la CaMKII sont
spécifiques des adhérences contenant l’intégrine β1 car aucune modification de la taille des
adhérences focales contenant l’intégrine β3 ni de la densité en récepteurs β3 n’est observée
dans les cellules sauvages, Icap-1 rescue et Icap-1 -/- étalées sur une matrice de vitronectine
(Figure 23C).
Avec un étalement de plus longue durée (16 heures), l’inhibition de la CaMKII n’augmente
pas la taille des adhérences focales dans les cellules sauvages et Icap-1 rescue , au contraire le
traitement au KN-93 induit l’apparition d’adhérences focales en région centrale de la cellule
(Figure 23D). Ce phénotype induit par le KN-93 est similaire à celui des cellules Icap-1 -/- non
traitées (Millon-Fremillon, Bouvard et al. 2008) (Figure 23D). Les cellules Icap-1 -/- ne
réagissent également pas au KN-93. Ainsi, l’inhibition de la CaMKII dans les cellules
sauvages et Icap-1 rescue mime la perte d’ICAP-1. Ces adhérences centrales sont composées
d’intégrines β1 et de vinculine et ne contiennent pas d’intégrine β3 (Figure 23D).
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