Fonction et régulation de la protéine ICAP-1alpha dans la ...

tel-00435843, version 1 - 24 Nov 2009
II. L’action négative de la protéine ICAP-1α sur la fonction adhésive de l’intégrine β1
implique une voie de signalisation dépendante de la kinase CaMKII 86
II.1. Introduction 86
II.1.1. Régulation de l’adhérence cellulaire par le calcium 86
II.1.2. La CaMKII : structure et activation 87
II.1.3. La CaMKII dans l’adhérence des cellules dépendante des intégrines 89
II.1.4. L’activité régulatrice de la CaMKII sur l’adhérence cellulaire requiert ICAP-1α 91
II.2. Résultats 92
II.2.1. La CaMKII régule négativement Les adhérences focales à intégrine β1 selon
une voie dépendante de la protéine ICAP-1α 92
II.2.2. L’action négative de la CaMKII sur la croissance des adhérences focales à
intégrine β1 requiert la phosphorylation d’ICAP-1α 94
II.2.3. L’interaction d’ICAP-1α sur β1 requiert sa phosphorylation sur la thréonine 38
et est requise pour l’action négative de la CaMKII sur les adhérences focales 96
II.2.4. La CaMKII régule négativement l’état d’affinité de l’intégrine β1 de façon
similaire à ICAP-1α 98
II.2.5. La CaMKII régule négativement la dynamique des adhérences focales selon une
voie dépendante de la phosphorylation d’ICAP-1α et de l’interaction d’ICAP-1α avec
l’intégrine β1 100
II.3. Discussion 102
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES 105
I. Discussion générale 106
II. Perspectives 108
MATERIEL ET METHODES 111
I. Matériels 112
I.1. Protéines, réactifs et anticorps 112
I.1.1. Protéines 112
I.1.2. Réactifs et anticorps 112
I.2. Bactéries 113
I.3. Lignées cellulaires 113
I.4. ADN plasmidiques 114
II. Méthodes 114
II.1. Technique de biologie moléculaire 114
II.1.1. Mutagénèse dirigée par PCR
II.2. Génération de cultures primaires de fibroblastes embryonnaires murins Icap-1
114
-/- et
Icap-1 +/+
II.2.1. Isolements des cultures primaires 115
II.2.2. Génotypage 115
II.2.2.1. Extraction de l’ADN génomique à partir des sacs vitellins 115
II.2.2.2. PCR génomique 115
II.3. Techniques de biologie cellulaire 115
II.3.1. Tranfection et infection rétrovirale 115
II.3.2. Immunofluorescence 116
115