etude des proprietes physico-chimiques de la lactoferrine et de son ...

GUILLAUME BRISSONETUDE DES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUESDE LA LACTOFERRINE ET DE SONFRACTIONNEMENT PAR PROCÉDÉSMEMBRANAIRESThèse présentéeà la Faculté des études supérieures de l'Université Lavaldans le cadre du programme de doctorat en Sciences et technologie des alimentspour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)SCIENCES DES ALIMENTS ET NUTRITIONFACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATIONUNIVERSITÉ LAVALQUÉBECSEPTEMBRE 2006© Guillaume Brisson, 2006

RésuméLa lactoferrine (LF) est une protéine mineure du lait qui fixe le fer. En raison de sesnombreuses activités biologiques, l'utilisation de la LF comme ingrédient nutraceutique esten forte croissance. La LF est isolée à partir du lait écrémé ou du lactosérum parchromatographie d'échange ionique. Par contre, les faibles débits et les coûts élevés de ceprocédé maintiennent l'intérêt pour le développement de nouvelles approches deséparation. Le but de cette recherche était de démontrer le potentiel de la filtration assistéepar un champ électrique pour le fractionnement de la LF en présence de protéines dulactosérum. La stabilité thermique de la LF et l'impact de celle-ci sur sa récupération dansle lactosérum ont également été étudiés.Les résultats démontrent qu'à température inférieure à 80°C, la fixation du fer par la LFaugmente sa stabilité en contribuant au maintien de l'intégrité de ses ponts disulfures. Lepourcentage de récupération de la LF dans le lactosérum diminue rapidement entre 60°C(88%) et 75°C (0%). Toutefois, la saturation en fer de la LF permet d'améliorer sarécupération dans le lactosérum. L'association de la LF dans le lait en cours de chauffages'effectue via des liens non-covalents et des réactions d'échange thiol/disulfureintermoléculaires avec d'autres protéines possédant des résidus cystéines. Ces interactionsentraînent une diminution de la récupération de la LF dans le lactosérum. Par ailleurs, desdifférences de mobilité électrophorétique entre la LF et les principales protéines dulactosérum à pH neutre permettent d'accroître la sélectivité d'un procédé de microfiltrationen appliquant un champ électrique. Avec la cathode du côté rétentat, des facteurs deséparation de 3,0 et 9,1 ont été obtenus entre respectivement la LF et la P-lactoglobuline etentre la LF et l'a-lactalbumine. Ces facteurs de séparation augmentent pour la LF saturéeen fer à 6,7 avec la p-lactoglobuline et à 62,4 avec l'a-lactalbumine. L'application d'unchamp électrique permet aussi d'augmenter le flux de perméation d'un facteur 3 par rapportà la filtration sans champ électrique.

11La filtration assistée par un champ électrique offre un potentiel intéressant pour lefractionnement de la LF à partir du lactosérum.

111AbstractLactoferrin (LF) is an iron-binding protein found in the minor protein fraction of bovinemilk that shows multiple physiological properties. The strong interest created for its use asa nutraceutical ingrédient has triggered the development of suitable techniques for itsséparation. LF is currently extracted from skim milk or cheese whey by ion-exchangechromatography. This process has some limitations such as its high cost and relatively lowthroughputs. The goal of this work was to study the ability of an electrically-enhancedmembrane filtration process to increase the selectivity of membrane fractionation of LF inthe présence of whey proteins. The thermal aggregation of LF and its impact on the proteinrecovery in whey were also investigated.At température lower than 80°C, the binding of iron by LF contributes to increase itsthermal stability toward aggregation by helping to maintain the integrity of its disulfidebonds. Moreover, the LF recovery in whey from thermally-treated milk decreased markedlyfrom 60°C (88%) to 75°C (0%). However, the binding of iron by LF increased its recoveryin whey. The thermal association of LF in milk occurs notably through non-covalent andcovalent intermolecular interactions. LF underwent intermolecular thiol/disulfide exchangereactions with other cysteine containing milk proteins. Thèse interactions impaired itsrecovery in whey. The effect of the applied electric field on the séparation of LF from themajor whey proteins was also investigated. Différences in electrophoretic mobility betweenLF and the main whey proteins were exploited to improve their séparation under theelectric field. Important selectivity enhancements were observed, particularly with thecathode on the retentate side. For that configuration, the séparation factors observedbetween LF and both P-lactoglobulin and a-lactalbumin were respectively 3.0 and 9.1.Also, thèse séparation factors for the fully iron saturated LF increased to 6.7 for p%lactoglobulin and 62.4 for a-lactalbumin. The permeation flux also increased by a 3-foldfactor compared without an electrical field. This study shows the potential of electrically-

IVenhanced membrane filtration for the fractionation of LF from more complex fluids such ascheese whey.

Avant-ProposCette thèse a été réalisée dans le cadre d'un projet financé par une action concertée duFonds québécois de la recherche sur la nature et les technologies (FQRNT), de NovalaitInc. et du Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation du Québec(MAPAQ). Ce projet portait sur l'utilisation d'un champ électrique dans les procédés deséparation par membranes pour le fractionnement de composés laitiers. Le but de laprésente thèse était d'étudier le potentiel de séparation de la microfiltration assistée par unchamp électrique pour le fractionnement de la LF en présence de protéines du lactosérum.Le manuscrit de cette thèse est présenté en 7 chapitres. Le chapitre d'introduction présentela problématique générale de la thèse. Au chapitre 2, une revue de littérature résumed'abord les connaissances actuelles sur la LF, sa stabilité à la chaleur et les procédésdéveloppés pour son fractionnement. Par la suite, les principaux avancements dans ledomaine des procédés par membranes pour la séparation des protéines du lactosérum et ledéveloppement de la filtration assistée par un champ électrique sont abordés. L'hypothèse,le but et les principaux objectifs de cette thèse sont ensuite exposés au chapitre 3. Puis, lesprincipaux résultats de cette thèse sont présentés sous la forme d'articles scientifiques, aunombre de trois, qui sont rédigés en anglais.Le premier volet abordé dans cette thèse, présenté au chapitre 4, porte sur la stabilitéthermique de la lactoferrine. Il consiste en une étude sur l'effet du niveau de saturation enfer de la LF sur le mécanisme d'agrégation thermique de la protéine à pH neutre et estintitulé : Heat-induced aggregation of lactoferrin at neutral pH, effect of iron saturation.Cet article a été soumis et accepté pour publication dans la revue International DairyJournal. L'auteur de cette thèse a effectué l'ensemble des expérimentations, l'interprétationdes résultats et la rédaction de cet article dont il est le premier auteur. Le Dr. Michel Brittenet le Dr. Yves Pouliot sont co-auteurs et ils ont supervisé ce travail de recherche.

VIDans le chapitre 5, il est question de l'impact des traitements thermiques du lait sur larécupération de la LF dans le lactosérum issu de la coagulation présure en fonction de sonniveau de saturation en fer. L'article relatif à cette question s'intitule : Effect of ironsaturation on lactoferrin recovery in rennet whey from heat treated skim milk. Cette étudesera soumise pour publication dans la revue scientifique Journal ofDairy Science. L'auteurde cette thèse a aussi effectué l'ensemble des expérimentations, l'interprétation des résultatset la rédaction de cet article dont il est le premier auteur. Le Dr. Michel Britten et le Dr.Yves Pouliot sont co-auteurs et ils ont supervisé ce travail de recherche.Le second volet de cette thèse porte sur l'effet de l'application de champs électriques sur laséparation par membranes de la LF en présence de protéines du lactosérum. Les résultatssont présentés au chapitre 6. Ce chapitre traite de l'influence des paramètres du champélectrique sur la sélectivité du fractionnement de la LF en présence de protéines dulactosérum et de l'impact du niveau de saturation en fer de la LF sur la sélectivité deséparation (Electrically-enhanced crossflow microflltration for the séparation of lactoferrinfrom whey protein mixtures). Cet article sera soumis pour publication dans la revuescientifique Journal of Membrane Science. Dans le cadre de stages, Jean-François Poulin etJulie Paquin ont participé aux expérimentations, en collaboration avec l'auteur de cettethèse. Ce dernier a procédé à l'interprétation des résultats et la rédaction de cet article dontil est le premier auteur. Le Dr. Michel Britten et le Dr. Yves Pouliot sont co-auteurs et ilsont supervisé ce travail de recherche.Enfin les conclusions générales de cette thèse sont présentées au chapitre 7. Ce dernierchapitre vise à mettre en relief les principaux résultats obtenus et leur contribution àl'avancement des connaissances. L'impact de ces résultats est discuté et des perspectivessont suggérées pour des travaux à venir.

VIIRemerciementsLa réalisation de cette thèse de doctorat n'aurait pu être possible sans l'appui et lacontribution de personnes qui auront marqué de manière inestimable cette belle épopée.Je tiens d'emblée à exprimer ma reconnaissance à mon directeur de thèse, le Dr. YvesPouliot, pour m'avoir accordé toute sa confiance dans la réalisation de cette recherche.J'aurai, au cours de ces années, été guidé par la qualité de ses conseils scientifiques, sonsoutien continu et sa motivation. J'aimerais également témoigner toute ma gratitude enversmon co-directeur, le Dr. Michel Britten, pour son implication, sa grande disponibilité et sesconseils scientifiques qui auront permis d'enrichir mon travail à tous les niveaux.J'aimerais remercier le Dr. Sylvie Turgeon, professeure au département ALN, pour avoir eul'extrême gentillesse d'effectuer la prélecture de cette thèse et pour les judicieuxcommentaires qu'elle m'a apportés. Je remercie également le Dr. Laurent Bazinet,professeur au département ALN et le Dr. Michel Pouliot, directeur Recherche etDéveloppement chez Agropur, pour avoir accepté d'évaluer cette thèse.Je souhaiterais également remercier Jean-François Poulin et Julie-Paquin pour l'aide qu'ilsm'ont apportée au laboratoire dans le cadre de stages. Leur enthousiasme et leurs effortsont été grandement appréciés. De même, j'aimerais souligner la contribution et les précieuxconseils des professionnels de recherche Anne-François Alain, Lynda Labarre et AlainGaudreau, de la dynamique équipe du Laboratoire de Transformation Alimentaire, MélanieMartineau, Jocelyne Giasson, Bernard Béliveau, Pascal Cliché et Gaétan Desnoyers, dupersonnel administratif, Louise Tremblay et Hélène Bissonnette et d'estimés collègues,Jean-François Lapointe et Frédéric Destaillats. Je désire également remercier Louis-Philippe Desmarchais pour son aide lors de mon stage au CRDA. J'ai également côtoyé, au

VlllCentre STELA, des gens formidables, trop nombreux pour être nommés, mais avec qui j'aipartagé des moments incroyables et que je tiens à remercier chaleureusement pour leuramitié.J'aimerais remercier tout particulièrement les membres de ma famille pour leur soutienindéfectible et leurs encouragements de tout moment. Marc et Louiselle, merci d'avoirtoujours été présents. Mélanie et Martin, vous avez toujours été de bon conseil. Merciégalement à ma belle-famille pour son appui et sa gentillesse. Enfin, si on dit que l'amourpeut déplacer des montagnes, alors je n'aurai jamais de barrières. Merci Marie-Pierre pourm'avoir ainsi accompagné tout au long de cette ascension.La réalisation de ce projet n'aurait pu être possible sans la contribution financière du Voletréseau FQRNT-Novalait-MAPAQ. J'aimerais également souligner la contribution duFQRNT au financement de cette recherche via l'octroi de bourses à titre personnel.

à mes parent, pour leur soutieninconditionnelIX

Table des matièresRésuméiAbstractiiiAvant-ProposvRemerciementsviiTable des matièresxListes des équationsxiiiListe des tableauxxivListe des figuresxvListe des abréviationsxviiChapitre 1 Introduction 1Chapitre 2 Revue de littérature 32.1 Les protéines du lait 32.1.1 Les caséines 32.1.2 Les protéines du lactosérum 42.2 La lactoferrine 62.2.1 Origine 62.2.2 Structure 72.2.3 Fixation du fer 102.2.4 Caractéristiques physico-chimiques 162.2.5 Propriétés de la lactoferrine 192.2.5.1 Propriétés nutritionnelles 192.2.5.2 Propriétés fonctionnelles 202.2.5.3 Propriétés antimicrobiennes 212.2.5.4 Activités biologiques 242.3 Stabilité thermique des protéines sériques dans le lait 262.4 Stabilité thermique de la lactoferrine 272.5 Fractionnement de la lactoferrine 312.6 Fractionnement par procédés membranaires 332.6.1 Les séparations par membranes 352.6.1.1 Principes généraux 352.6.1.2 Concentration de polarisation et colmatage 362.6.1.3 Évaluation de la sélectivité des séparations par membranes 382.6.2 Fractionnement des protéines du lactosérum par procédés par membranes .392.7 Électrofiltration 402.7.1 Principes de l'électrofiltration 412.7.2 Séparation des protéines par électrofiltration 45Chapitre 3 But, hypothèses et objectifs 47Chapitre 4 Agrégation thermique de la lactoferrine bovine à pH neutre : effet du niveaude saturation en fer 504.1 Résumé 514.2 Abstract 524.3 Introduction 534.4 Materials and methods 55

XI4.4.1 Isolation ofLF 554.4.2 Modification of LF iron saturation 554.4.3 Sample préparation and heat treatments 564.4.4 HPSEC analysis 574.4.5 SDS-PAGE analysis 574.5 Results 584.5.1 Changes in the LF molecular weight profiles 584.5.2 Changes in the SDS-PAGE profiles 634.6 Discussion 664.7 Conclusion 694.8 Aknowledgements 70Chapitre 5 Effet du niveau de saturation en fer sur la récupération de la lactoferrinedans le lactosérum issu de la coagulation présure de lait écrémé chauffé 715.1 Résumé 725.2 Abstract 735.3 Introduction 745.4 Materials and methods 765.4.1 Purification of lactoferrin 765.4.2 Modification of lactoferrin iron status 765.4.3 Milksupply 775.4.4 Sample préparation and heat treatments 775.4.5 Rennet coagulation ofmilk 785.4.6 Reverse-phase high-performance liquid chromatography 795.4.7 One and two dimensionnal polyacrylamide gel electrophoresis 795.5 Results and discussion 805.5.1 Changes in protein recovery in whey 805.5.2 Changes in protein association in rennet curds 855.6 Conclusion 925.7 Aknowledgements 92Chapitre 6 Séparation de la lactoferrine d'un mélange de protéines de lactosérum parmicrofiltration tangentielle assistée par un champ électrique 936.1 Résumé 946.2 Abstract 956.3 Introduction 966.4 Materials and methods 976.4.1 Materials 976.4.2 Préparation of iron saturated lactoferrin 986.4.3 Electrophoretic mobility measurements 986.4.4 Membrane and module set-up 996.4.5 EMF experiments 996.4.6 Analytical methods 1016.4.7 Statistical analysis 1026.5 Results and discussion 1026.5.1 Electrophoretic mobility measurements 1026.5.2 EMF of single protein solution 1046.5.2.1 EMF of the WPI solution 1046.5.2.2 EMF of lactoferrin solution 108

6.5.3 EMFofmixedprotein solution 1106.5.3.1 EMF of lactoferrin in the présence of whey proteins 1106.5.3.2 EMF of holo-lactoferrin in the présence of whey 1146.5.4 Effect of EMF on membrane selectivity 1176.6 Conclusion 1196.7 Aknowledgements 119Chapitre 7 Conclusion 1207.1 Principaux résultats et contributions à l'avancement des connaissances 1217.2 Importance des résultats 1247.3 Perspectives 125Bibliographie 127XII

Liste des équationsxmEquation 2.1 : Flux de perméation (J P ) 36Equation 2.2 : Coefficient de rejet d'un soluté (a) 38Equation 2.3 : Transmission d'un soluté (Tr) 38Équation 2.4 : Facteur de séparation (S) 39Equation 2.5 : Équation d'Henry 42Équation 2.6 : Mobilité électrophorétique(|a e ) 43Equation 2.7 : Réactions électrolytiques à la cathode 44Équation 2.8 : Réactions électrolytiques à l'anode 44Équation 6.1 : Calculation of the individual transmission of proteins (Tr) 101Équation 6.2 : Séparation factor (S) between proteins 102

XIVListe des tableauxTableau 2.1 Caractéristiques physico-chimiques des protéines du lactosérum 5Tableau 2.2 Spectre antimicrobien de la lactoferrine et de la lactoferricine bovine 23Tableau 2.3 Quelques activités biologiques de la lactoferrine et de la lactoferricine B etles mécanismes d'action proposés 25Tableau 2.4 Principales caractéristiques des membranes utilisées dans l'industrie laitère.34Tableau 4.1 Some physico-chemical properties of the LF iron préparations 56Tableau 5.1 Physico-chemical characteristics of the différent LF iron préparations usedin the study 77Tableau 6.1 Effect of the electric field parameters on the conductivity and pH of the feed,the retentate, and permeate solutions obtained during the EMF of singleprotein solutions 107Tableau 6.2 Effect of the electric field parameters on the conductivity and pH of the feed,the retentate, and permeate solutions obtained during the EMF of mixedprotein solutions containing LF or holo-LF with a WPI 113Tableau 6.3 Effect of the electric field parameters and the iron-saturation of LF on theséparation factor obtained between the différent proteins species during theEMF of solutions containing LF or holo-LF mixed with a WPI 118

XVListe des figuresFigure 2.1 Structure de lamicelle de caséine et d'une sous-micelle 4Figure 2.2 Séquence primaire de la lactoferrine bovine 8Figure 2.3 Structure tridimensionnelle de la lactoferrine bovine 9Figure 2.4 Schéma du site de fixation du fer localisé dans la cavité du lobe N-terminalde laLF bovine 12Figure 2.5 Schéma du site de fixation de l'anion bicarbonate de la lactoferrine humainesur le domaine 2 du lobe N 13Figure 2.6 Représentation schématique du changement de conformation induit par lafixation de l'ion Fe 3+ au niveau du lobe de l'extrémité N-terminale de laLFhumaine 14Figure 2.7 Schéma représentant les différentes conformations que peut adopter chaquelobe (N et C) de l'apo-LF en solution en absence de fer 15Figure 2.8 (A) Représentation de la distribution de la charge de surface sur lalactoferrine humaine saturée en fer. (B) Représentation tridimensionnelle dela lactoferrine identifiant en bleu les structures de la protéine quicorrespondent aux zones de charge positive 17Figure 2.9 Thermogrammes de la lactoferrine (A) apo, (B) native et (C) holo dans l'eauàpH7,2 28Figure 2.10 Mode d'alimentation en UF et MF : (A) frontal et (B) tangentiel 35Figure 2.11 Schéma illustrant le phénomène de concentration de polarisation 37Figure 2.12 Différentes géométries d'un module d'électrofiltration : (A) module plan et(B) module tubulaire 41Figure 4.1 Effect of iron saturation on the percent of residual monomeric lactoferrin(LF), in the holo-LF, native LF and apo-LF solutions heated at différenttempératures and analysed by high performance size-exclusionchromatography 59Figure 4.2 Typical high performance size-exclusion chromatography profiles ofunheated and heated samples of native-LF (A) and holo-LF (B) 61Figure 4.3 Typical high performance size-exclusion chromatography profiles ofunheated and heated samples of native lactoferrin (LF) (A) and holo-LF (B).63Figure 4.4 Typical non-reducing and reducing SDS-PAGE patterns of samples of apolactoferrin(apo-LF) (A), native LF (B) and holo-LF (C) solutions unheatedand heated at 60°C, 70°C and 80°C for 5 min 65Figure 4.5 General mechanism proposed for the thermal aggregation of apo-lactoferrin(apo-LF) (A) and holo-LF (B) 69Figure 5.1 Effect of thermal treatments on the percent of LF recovered in the rennetwhey of skim milk heated at différent températures and analysed by RP-HPLC 81Figure 5.2 Effect of iron saturation on the percent of LF recovered in the rennet wheyfraction from thermally treated skim milk enriched with holo-LF, LF andapo-LF, and analysed by RP-HPLC 82

XVIFigure 5.3Figure 5.4Figure 5.5Figure 5.6Figure 6.1Figure 6.2Figure 6.3Figure 6.4Figure 6.5Effect of LF iron saturation on the percent of P-LG (A) and a-LA (B)recovered in the rennet whey fraction from thermally treated skim milk andmilk spiked with holo-LF, LF and apo-LF, and analysed by RP-HPLC 84Non-reduced and reduced SDS-PAGE of rennet curd from (A) skim milkand (B) milk spiked with LF unheated and heated at 60°C, 70°C and 80°C862D-SDS-PAGE patterns : non-reduced SDS-PAGE in the first dimension:and reduced SDS-PAGE in the second dimension of rennet curd obtainedfrom (A) non-heated, (B) heated skim milk 902D-SDS-PAGE patterns : non-reduced SDS-PAGE in the first dimension:and reduced SDS-PAGE in the second dimension of rennet curd obtainedfrom heated skim milk spiked with LF 91Electrophoretic mobility of the différent protein dispersions as a function ofpH determined by Zetasizer apparatus 103Evolution of the transmission of p-LG and a-LA and the permeation fluxduring the EMF of a WPI solution at pH 7.0 105Evolution of the transmission and the permeation flux of LF (A) and holo-LF (B) during the EMF of LF solutions at pH 7.0 109Effect of the électrode configuration (A) anode on the retentate side and (B)cathode on the retentate side on the transmission of LF and the WPI speciesp-LG and a-LA and the permeation flux during the EMF of LF and WPImixed solution 112Effect of the électrode configuration (A) anode on the retentate side and (B)cathode on the retentate side on the transmission of holo-LF and the WPIspecies p-LG and a-LA and the permeation flux during the EMF of holo-LFand WPI mixed solution 116

XV11Liste des abréviationsot-LA :Apo-LF :alpha-lactalbuminelactoferrine désaturée en ferP-LG : beta-lactoglobulineBSA : bovine sérum albumin, sérum albumine bovineCOOH : groupement carboxyleCO3 2 " : anion bicarbonateCPL : concentré de protéines du lactosérumC-t : extrémité C-terminale de la protéineDF : diafiltrationDSC : differential scanning calorimetry; calorimétrie différentielle à balayageEMF : electrically-enhanced membrane fïltration; filtration par membrane assistée parun champ électriqueFe 2+Fe 3+Holo-LF :HPLC :HPSEC :HTST :IgG :IPL :JP :LF :LFcinB :LP :MF :MW :MWCO :ion ferreuxion ferriqueLF saturée en ferhigh-performance liquid chromatography; chromatographie liquide hauteperformancehigh-performance size-exclusion chromatography; chromatographied'exclusion moléculaire haute-performancehigh température short time pasteurization; pasteurisation hauteimmnunoglobulineisolât de protéines du lactosérumpermeation flux ; flux de perméationlactoferrinelactoferricine bovinelactoperoxydasemicrofiltrationmolecular weight; poids moléculairemolecular weight cut-off; seuil de coupure

XV111NEM : N-éthylmaléimideNH : groupement aminéN-t : extrémité N-terminale de la protéineOH : groupement hydroxylePEG : polyéthylène glycolpi : point isoélectriquePP : protéoses peptonesPT : transmembrane pressure; pression transmembranaireRP-HPLC : reverse-phase-HPLC; HPLC en phase inverseS : séparation factor; facteur de séparationSDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; électrophorèsesur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate1D-SDS-PAGE : one dimensionnal SDS-PAGE; SDS-PAGE en une dimension2D-SDS-PAGE : two dimensionnal SDS-PAGE; SDS-PAGE en deux dimensionsSH : free thiol; thiol libreSH/S-S : thiol disulfide exchange; échange thiol/disulfureS-S : disulfide bridge; pont disulfureTQ : température de dénaturationTr : transmissionUF : ultrafiltrationUHT : ultra-high température; ultra-haute températurev : feedflow velocity; vitesse de recirculation tangentielleWPI : whey protein isolateAbréviations des acides aminésAcide aspartiqueAcide glutamiqueAlanineArginineAsparagineCystéineGlutamineGlycine1)HARNCQGAspGluAlaArgAsnCysGinGly

XIXHistidineIsoleucineLeucineLysineMéthioninePhénylalanineProlineSerineThréonineTryptophaneTyrosineValineII1LKMF1'STWYVHisIleLeuLysMetPheProSerThrTrpTyrVal

Chapitre 1 IntroductionDivers procédés ont été développés pour concentrer les protéines du lactosérum, et ce, afind'exploiter leurs propriétés nutritionnelles, fonctionnelles et biologiques (Britten et al.,2002; Kinsella & Whitehead, 1989; Marshall & Harper, 1988; Morr & Ha, 1993). Parmices techniques, les procédés de séparation par membranes, telle l'ultrafiltration (UF),permettent de produire des concentrés de protéines de lactosérum (CPL) contenant de 35%à 80% de protéines (Britten et al., 2002; Morr & Ha, 1993). Des isolats de protéines delactosérum (IPL) renfermant plus de 90% de protéines peuvent être obtenus à partir delactosérum délipidé soit par UF combinée à une étape de diafiltration (DF) ou encore parchromatographie par échange ionique (Britten et al., 2002). Les CPL et les IPL sontlargement utilisés comme ingrédients dans diverses formulations alimentaires (Kinsella &Whitehead, 1989; Marshall & Harper, 1988). Par contre, les propriétés individuelles desdiverses protéines du lactosérum ne présentent pas leur plein potentiel dans les CPL et lesIPL (Zydney, 1998). Le fractionnement des protéines du lactosérum est donc indiqué pourla fabrication d'ingrédients protéiques possédant des propriétés plus spécifiques etuniformes permettant des utilisations mieux ciblées.Parmi les protéines du lactosérum, la lactoferrine (LF) suscite un intérêt grandissant pourses nombreuses propriétés fonctionnelles et ses activités biologiques telles que ses capacitésantimicrobiennes, antioxydantes, anti-inflammatoires, antitumorales, immunorégulatrices etstimulatrices de la croissance des tissus osseux (Brock, 2002; Steijns & van Hooijdonk,2000; Ward et al., 2005). Cette protéine est isolée à partir du lait écrémé ou du lactosérum.Or, l'état de la LF dans le lait et le lactosérum (saturation en fer, interactions avec les autresconstituants, agrégation) est mal connu. Bien que plusieurs études aient démontré l'effetstabilisant de la fixation du fer par la LF sur sa susceptibilité à la dénaturation thermique(Kussendrager, 1994; Paulson et al., 1993; Sanchez et al., 1992), les diverses interactionsimpliquées lors de son agrégation à la chaleur demeurent méconnues et peuvent avoir unimpact négatif sur sa récupération dans le lactosérum.

En raison du caractère cationique distinct de la LF, la séparation de cette protéine s'effectuepar chromatographie d'échange cationique. À l'échelle industrielle, cette technologieprésente toutefois certains désavantages, à savoir son coût élevé et ses débits d'opérationrelativement faibles (Pearce, 1992). Ceci maintient l'intérêt pour le développement denouveaux procédés de séparation mieux adaptés à l'industrie laitière. Divers procédés ontété développés pour fractionner les protéines du lactosérum. Parmi ces procédés, lestechniques de séparation par membranes occupent une place importante dans les opérationsde transformation du lait et du lactosérum (Brans et al., 2004). Entre autres, l'UF et lamicrofiltration (MF) offrent un potentiel intéressant pour le fractionnement de la LF à partirdu lactosérum (Mehra & Donnelly, 1993; Timmer & van der Horst, 1997; Zydney, 1998).Cependant, le manque de sélectivité des membranes et leur propension au colmatagenécessitent le développement de nouvelles approches pour améliorer le fractionnement desprotéines du lactosérum. Le but de cette thèse était de démontrer le potentiel de séparationde la filtration par membranes assistée d'un champ électrique afin d'augmenter laséparation de la LF à partir d'un mélange de protéines du lactosérum, ceci en mettant àprofit des différences de charge et de taille entre les protéines.

Chapitre 2 Revue de littérature2.1 Les protéines du laitLe lait est une suspension colloïdale qui contient en moyenne 3,2% de protéines. Lesprotéines du lait se divisent en deux fractions que l'on peut séparer en fonction de leursolubilité. On identifie les caséines comme les protéines du lait qui précipitent lors d'uneacidification à pH 4,6 à une température de 20°C (Jenness et al., 1956). Elles formentenviron 80% des protéines totales du lait. La seconde fraction est composée des protéinessolubles à pH 4,6, que l'on nomme les protéines sériques ou du lactosérum.2.1.1 Les caséinesII existe différents types de caséines, soit les caséines a s i, a S 2, (3, et K. Les caséines sont desphosphoprotéines possédant une structure en pelote statistique. Elles sont caractérisées parune distribution non uniforme de leurs charges sur leur chaîne peptidique. Alors que lescaséines a s et p sont riches en résidus phosphorylés et sont sensibles à la précipitation aucalcium, la caséine K (un seul résidu phosphorylé) a tendance à protéger les autres caséinescontre l'insolubilisation par le calcium (de Kruif & Holt, 2003). La caséine K contientégalement un résidu glucidique dans sa séquence, lui conférant un caractère polaire qui joueun rôle important dans la structure quaternaire qu'adoptent les caséines. Dans le lait, lescaséines se regroupent sous la forme de micelles. La micelle de caséines est un complexesphérique d'environ 200 nm dont l'organisation n'est toutefois pas totalement élucidée. Lemodèle proposé par Schmidt (1980) est celui auquel on réfère le plus souvent pour décrirela structure micellaire. Ce dernier décrit la structure micellaire comme étant formée desous-unités micellaires, que l'on nomme sous-micelles. Elles sont reliées entre elles par des

ponts phosphocalciques. Les sous-micelles riches en caséines K se situeraient à la surfacede la micelle alors que le cœur de celle-ci serait plutôt composé des sous-micelleshydrophobes, c'est-à-dire pauvres en caséines K. (Figure 2.1).MicelleSous-micelleCaséines KChaîne glucidiquePhosphateCaséineshydrophobesFigure 2.1(1995)Structure de la micelle de caséine et d'une sous-micelle. Adapté de Bylund2.1.2 Les protéines du lactosérumLe lactosérum est un sous-produit de l'industrie fromagère ou de la production de caséines.Il est obtenu par la coagulation du lait, soit par acidification ou par l'action de la présure.Le lactosérum contient un peu moins de 1% de protéines (Morr & Ha, 1993). Les quatreprotéines majeures du lactosérum sont la p-lactoglobuline ((3-LG), l'a-lactalbumine (a-LA), la sérum albumine bovine (BSA) et les immunoglobulines (IgG). Ce sont toutes desprotéines globulaires. La fraction mineure des protéines du lactosérum comprend, pour sa

part, les protéose-peptones (PP) qui sont issues de l'hydrolyse de la caséine-(3 par laplasmine, une enzyme endogène du lait, la LF et la lactoperoxydase (LP) (Tableau 2.1).Tableau 2.1 Caractéristiques physico-chimiques des protéines du lactosérum. Donnéestirées de Cals et al. (1991); Cayot et Lorient (1998); Kinsella and Whitehead (1989);Kussendrager (1994); Marshall et Harper (1988); Morr et Ha (1993); Ruegg et al. (1977).Protéines(3-LGa-LAIgGBSAPPLFLPConcentration(g-L 1 )2-40,6-1,70,3-0,60,3-0,40,3-0,80,10,01-0,03Poids mol.(g.mol 1 )18 40014 200160 00066 0004000-40 00080 00078 000Pi5,34,2-4,55,5-6,84,7-4,95,1-5,68,4-9,09,5Nombre deS-S (SH)5 (1 SH)43217(1 SH)0176 (3 SH)T D(°C)72,865,272,962,2ND65 et 90NDpl= point isoélectrique; S-S= pont disulfure; SH= thiol libre; T D = Température de dénaturation; ND= Nondéterminé.Les protéines du lactosérum possèdent d'excellentes propriétés nutritionnelles etfonctionnelles (Kinsella & Whitehead, 1989; Marshall & Harper, 1988). Pour cette raison,différents procédés ont été développés pour les concentrer. Les procédés par membranesd'UF permettent de produire des CPL contenant de 35% jusqu'à 80% de protéineslorsqu'on y ajoute une étape de DF (Britten et al., 2002; Morr & Ha, 1993). Appliqué àpartir de lactosérum délipidé, ce procédé d'UF/DF permet d'obtenir des IPL contenant plusde 90% de protéines. Les IPL sont également obtenus par chromatographie par échangeionique (Britten et al., 2002). Les CPL et les IPL sont utilisés comme ingrédients pourdiverses applications alimentaires. Toutefois, en raison de leurs propriétés distinctives, lesprotéines individuelles du lactosérum ne sont pas utilisées de façon optimale dans cesproduits. Le raffinement des techniques d'extraction permet maintenant d'obtenir desfractions purifiées, notamment pour des protéines mineures qui possèdent des activitésbiologiques intéressantes, comme la LF.

2.2 La lactoferrine2.2.1 OrigineLa LF est sécrétée notamment par la glande mammaire d'une variété de mammifères. Laconcentration dans le lait varie selon l'espèce. Par exemple, le lait humain contient uneconcentration élevée en LF (1 à 2 mg mL" 1 ) (Hennart et al., 1991; Nagasawa et al., 1974)par rapport au lait bovin (0,02 et 0,3 mg mL" 1 ) (Farr et al., 2002; Law & Reiter, 1977;Sanchez et al., 1988). La concentration en LF dans le lait bovin varie également au cours ducycle de lactation. Elle est initialement élevée dans le colostrum (0,8-5 mg mL" 1 ) (Pakkanen& Aalto, 1997; Sanchez et al., 1988), puis elle diminue dans le lait mature (0,02 et 0,3 mgmL" 1 ). Après la cessation de la lactation, la concentration en LF augmente dans lessécrétions sèches de la glande mammaire en involution et peut atteindre des valeurs entre25 à 35 mg mL" 1 (Welty et al., 1976). D'autres facteurs peuvent influencer la concentrationen LF dans le lait bovin tels que le génotype de l'animal, son âge, sa diète, un compte élevéen cellules somatiques dans le lait, une inflammation de la glande mammaire et lafréquence de la collecte (Chen & Mao, 2004; Farr et al., 2002; Hagiwara et al., 2003;Turner et al., 2003). Par ailleurs, la LF est aussi présente dans la majorité des sécrétionscorporelles des glandes exocrines telles que la salive, les larmes, les liquides séminaux ainsique les mucosités (Masson et al., 1966). La LF se retrouve également dans les granulessecondaires des neutrophiles (Masson et al., 1969).La LF est considérée comme un membre de la famille des transferrines, qui inclutégalement les transferrines sériques et les ovotransferrines (conalbumine). Les transferrinessont des protéines qui présentent de nombreuses homologies structurales. Ce sont desglycoprotéines formées d'une seule chaîne polypeptidique comprenant de 670 à 690 résidusd'acides aminés et dont le poids moléculaire est d'environ 80 000 Da. La séquencepeptidique de la LF des différents mammifères présente environ 60% d'homologie avec

celles des transferrines sériques, alors que l'homologie de séquence entre la LF dedifférentes espèces est de l'ordre de 65% à près de 100% (Baker, 1994; Baker & Baker,2004). Les protéines de la famille des transferrines ont une structure formée de deux lobesreliés par une courte chaîne peptidique. Pour la LF, cette chaîne peptidique se caractérisepar un enroulement en hélice-a, alors que celle des transferrines présente une structuredésordonnée, riche en résidus prolines (Bailey et al, 1988; Kurokawa et al., 1995). Lagrande homologie de structure au sein de la famille des transferrines leur confère égalementdes propriétés physico-chimiques communes, dont la principale est la capacité à former uncomplexe non-hémique avec le fer.2.2.2 StructureLa LF bovine est une protéine globulaire dont la structure primaire est constituée d'uneseule chaîne polypeptidique de 689 résidus d'acides aminés, incluant 17 ponts disulfures(S-S) intramoléculaires, mais aucun groupement cystéine (Cys) libre (Pierce et al., 1991).Selon sa séquence peptidique (Figure 2.2) et en tenant compte des S-S, le poids moléculairethéorique de la LF serait de 76 110 Da (Farrell et al., 2004).L'analyse cristallographique de la LF par spectroscopie par diffraction des rayons X apermis de déterminer les structures secondaires et la structure tertiaire de la protéine(Moore et al., 1997). Les structures secondaires de la LF comprennent approximativement41% d'hélices a et 24% de feuillets p\ La conformation de la LF comprend deux lobes, leslobes N (résidus 1-333) et C (résidus 345-689), qui correspondent respectivement auxextrémités N-terminale (N-t) et C-terminale (C-t) de la protéine. Les deux lobes de laprotéine sont connectés par une courte hélice a (résidus 334 à 344) (Moore et al., 1997).

'APRKNVRWCTISQPEWFKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAFALECIRAIAEKKADAVTLDGGMVFEAGRDPYKLRPVAAEIYGTKESPQTHYYAVAVVKKGSNFQLDQLQGRKSCHTGLGRSAGWIIPMGILRPYLSWTESLEPLQGAVAKFFSASCVPCIDRQAYPNLCQLCKGEGENQCACSSREPYFGYSGAFKCLQDGAGDVAFVKETTVFENLPEKADRDQYELLCLNNSRAPVDAFKECHLAQVPSHAVVARSVDGKEDLIWKLLSKAQEKFGKNKSRSFQLFGSPPGQRDLLFKDSALGFLRIPSKVDSALYLGSRYLTTLKNLRETAEEVKARYTRVVWCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADALNLDGGYIYTAGKCGLVPVLAENRKSSKHSSLDCVLRPTEGYLAVAVVKKANEGLTWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRLCALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGESTADWAKNLNREDFRLLCLDGTRKPVTEAQSCHLAVAPNHAVVSRSDRAAHVKQVLLHQQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYVTAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR 689Figure 2.2 Séquence primaire de la lactoferrine bovine. Les ponts disulfures sontformés entre les groupements cystéines (C) suivants : C9-C45, C19-C36, Cns-Ciçg, C157-C173,Ci60-Ci83, C170-C181, C231-C245, C348-C38O, C358-C371, C405-C684, C425-C647» C457-C532, C48I-C 675 , C491-C505, C502-C515, C 573 -C 5 87, C 6 25-C 6 3o. Tiré de Protein Data Bank (PDB) à partir dufichier 1BLF (http://www.rcsb.ora/pdb/).Chaque lobe est composé de deux a/p domaines ou sous-lobes, qui sont désignés NI(résidus 1-90 et 251-233) et N2 (résidus 91-250) pour le lobe de l'extrémité N-t, puis Cl(résidus 345-431 et 593-676) et C2 (résidus 432-592) pour le lobe de l'extrémité C-t. Lesdeux domaines de chaque lobe forment une cavité profonde, la cavité interdomaine, danslaquelle peut se fixer un ion ferrique [Fe 3+ ou Fe (III)] (Moore et al., 1997) (Figure 2.3)

NIN2C2LobeNLobeCFigure 2.3 Structure tridimensionnelle de la lactoferrine bovine (en présence d'ionsFe + ). Adapté de Vogel et al. (2002). NI et N2 : domaines du lobe de l'extrémité Nterminale (N-t); Cl et C2 : domaines du lobe de l'extrémité C terminale (C-t). Les deux ions,3+Fe sont représentés par les deux sphères.Les deux lobes de la LF ont une conformation similaire et possèdent environ 40%d'homologie au niveau de leur séquence primaire (Baker & Baker, 2005; Baker et al.,2002). Des interactions non-covalentes de type hydrophobe entre les deux lobes de laprotéine modifieraient leur orientation réciproque. Ces interactions seraient dues à laprésence d'acides aminés hydrophobes situés à la surface de la région inter-lobale de laprotéine. Ces interactions imposeraient une rotation de 11,3° dans l'orientation entre lesdeux lobes de la LF (Moore et al., 1997).La LF possède également cinq sites possibles de glycosylation. Les chaînes glucidiquessont liées à des groupements asparagine (Asn) spécifiques de la protéine, localisés auxpositions Asn233, Asri28i, Asn368, Asn476 et Asn545, par un lien N-acétylglucosamine (Pierceet al., 1991). Seulement quatre de ces sites sont toujours glycosylés soit Asn233, Asn368,Asri476 et Asn545 (Spik et al., 1994), tandis que le cinquième site de liaison, Asn2gi, situé surle lobe N-t, est seulement glycosylé à 30% dans le colostrum et à 15% dans le lait mature

10(Wei et al., 2000; Yoshida et al., 2000). Les deux glycovariants de la LF sont désignés parles lettres A et B. Le glycovariant A se distingue du glycovariant B par la présence de lachaîne glucidique supplémentaire en position Asn28i (Yoshida et al., 2000). La variation dunombre de chaînes glucidiques liées à la LF modifie également son poids moléculaire quiest d'environ 84 000 Da pour la LF-A et 80 000 Da pour la LF-B (Yoshida et al., 2000). Deplus, le type de chaîne glucidique liée à la LF varie en fonction de la période de lactation.En début de lactation, les chaînes glucidiques sont principalement de typeoligomannosodique, c'est-à-dire qu'elles sont riches en résidus mannoses, alors que dans lelait mature, on retrouve des chaînes glucidiques de type N-acétyllactosamique dontl'extrémité se termine par un sucre aminé, le N-acétyllactosamine. La composition deschaînes glucidiques est donc très hétérogène et comprend divers sucres, principalement lemannose, mais aussi le galactose, le fucose et des sucres aminés tels que le N-acétyllactosamine, le N-acétylglucosamine et l'acide neuraminique (Coddeville et al.,1992). La glycosylation de la LF jouerait un rôle dans la stabilisation de la protéine,notamment au niveau de sa susceptibilité à la protéolyse (van Veen et al., 2004) et à ladénaturation thermique (Rossi et al., 2002). De plus, la chaîne glucidique en Asn 5 4 5 ,localisée entre les deux domaines du lobe C, serait impliquée dans les processus de fixationet de libération du fer (Baker et al., 1998; Moore et al., 1997). Une autre chaîne glucidiqueancrée sur le domaine N2, en position Asn233, stabiliserait pour sa part la fixation du ferdans le lobe N de la protéine (Legrand et al., 1990).2.2.3 Fixation du ferLa LF a la capacité de lier deux ions Fe 3+ de façon réversible avec un anion bicarbonate(CO3 2 ") synergique. La fixation du fer par la LF lui confère une couleur rosé saumon ensolution. L'intensité de la coloration augmente avec le niveau de saturation en fer de laprotéine. L'absorbance du complexe LF/Fe 3+ , qui est maximale dans la région du spectrevisible à environ 465 nm, permet de déterminer le niveau de saturation en fer de la protéine(Groves, 1960). La nomenclature apo-LF et holo-LF est utilisée pour désignerrespectivement les lactoferrines non saturée et saturée en fer. L'affinité de la LF pour le ferest très grande. Sa constante d'affinité (Ko) avec le fer sous forme Fe 3+ est d'environ 10 20

Il(Baker, 1994), alors qu'elle est nettement inférieure pour le fer ferreux (Fe 2+ ), avec une Kode 10 3 (Harris, 1986). La LF fixe donc le fer de façon préférentielle sous la forme ferrique,mais peut également lier d'autres métaux in vitro. Des complexes stables ont été observésavec les ions Al 3+ , Cr 3+ , VO 2+ , Mn 3+ , Co 3+ , Cu 2+ et Zn 2+ (Baker, 1994). Considérant lefaible pourcentage de saturation en fer de la LF dans le lait, elle jouerait un rôle dans lafixation d'autres éléments traces présents dans le lait. Par exemple, la majorité dumanganèse (Mn 3+ ) serait liée à la LF dans le lait (Lonnerdal et al., 1985). La LF formeraitégalement des complexes avec les ions vanadyles (VO 2+ ) (Sabbioni & Rade, 1980) ainsique le zinc (Zn 2+ ) dans le lait (Blakeborough et al., 1983; Zhang & Allen, 1995). Lafixation du fer par la LF nécessite la présence préalable d'un anion CO3 2 ". Par contre, la LFpeut lier in vitro d'autres anions qui sont pour la plupart des ions carboxylates tels quel'oxalate, le malonate, le glycolate, le glycinate et le nitriloacétate (Baker, 1994).La configuration du site de liaison du fer situé dans la cavité interdomaine est identiquepour chaque lobe de la protéine. Chaque atome de Fe 3+ est lié au groupement hydroxyl(OH) de deux résidus Tyr, au groupement carboxyle (COOH) d'un résidu Asp et à ungroupement imidazole d'un résidu His en coordination avec un anion CO3 2 ". De façon plusspécifique, les acides aminés participant à la fixation du fer sont Asp6o, Tyrç2, TyrYi92 etHis253 pour le lobe N et Asp 395 , Tyr433, Tyr 52 6 et His 5 9 5 pour le lobe C (Moore et al., 1997).En présence d'un anion CO3 2 ", ces différents ligands forment une enveloppe decoordination autour de l'ion Fe 3+ , enveloppe qui permet la fixation réversible de ce dernier(Figure 2.4).

12Figure 2.4 Schéma du site de fixation du fer localisé dans la cavité du lobe N-terminalde la LF bovine. L'ion métallique Fe 3+ (sphère) est lié aux chaînes latérales des acidesaminés Asp6o, Tyrç2, Tyri92 et His253 et à un ion bicarbonate CO3 2 ". Tiré de Baker et Baker(2004).Au niveau de la stœchiométrie de la liaison du fer, les trois charges négatives desgroupements nucléophiles des chaînes latérales des acides aminés neutralisent les troischarges positives de l'ion métallique Fe 3+ , tandis que l'anion CO3 " peut former deuxliaisons avec ce dernier.L'anion CO3 2 " occupe une pochette anionique localisée sur la surface intérieure du domaine2. Cette pochette est formée de l'aminé (NH) terminale des résidus Alan3 et Glym pour lelobe N et Trp467 et Asp 4 68 pour le lobe C d'une hélice-a (hélice 5). Elle est aussi formée dela chaîne latérale d'un résidu arginine (Argi2i pour le lobe N et Arg463 pour le lobe C) et dugroupement OH d'un résidu thréonine (Thrin pour le lobe N et Tbi^g pour le lobe C)(Moore et al., 1997). Ces groupements forment des ponts hydrogène avec les atomesd'oxygène de l'anion CO3 2 " qui permettent de fixer l'anion CO3 2 ' sur la surface intérieuredu domaine 2 de chaque lobe de la protéine (Figure 2.5).

13Figure 2.5 Schéma du site de fixation de l'anion bicarbonate (CO3 2 ") de la lactoferrinehumaine sur le domaine 2 du lobe N. Les traits pointillés correspondent aux liaisonshydrogènes avec les atomes d'oxygène de l'anion CO3 2 " (Oj, O 2 et O 3 ) et les traits pleinsaux liaisons avec l'ion métallique Fe 3+ . Les nombres indiquent la position des chaîneslatérales des acides aminés et les groupements NH terminaux de l'hélice a5 (cylindre)participant à la fixation du CO3 2 " sur le lobe N. Les nombres entre parenthèses indiquentleur position respective sur le lobe C. Tiré de Shongwe et al. (1992).De plus, la participation de l'anion CO3 2 " dans la sphère de coordination de l'ion Fe 3+ esttrès importante puisqu'elle permet de contrôler la libération du fer en fonction du pH.Ainsi, la protonation du CO3 2 ", serait la première étape dans la libération du fer de la cavitéinterdomaine de chaque lobe de la protéine (Abdallah & El Hage Chahine, 2000;MacGillivray et al., 1998). La LF commence à libérer quasi simultanément ses deux ionsFe 3+ à partir d'environ pH 4,0 et sa désaturation est complète à pH 2,5 (Baker et al., 1998;Baker & Baker, 2004). La rétention du fer en fonction du pH est plus faible pour lestransferrines sériques qui relâchent leurs ions Fe 3+ à partir de pH 6,0 (Baker et al., 1998).De plus, la libération des deux ions Fe 3+ par les transferrines sériques ne s'effectue pas defaçon simultanée comme pour la LF. Le lobe N relâche ses ions Fe 3+ à partir de pH 6,0comparativement au lobe C qui les relâche alors que le pH se situe entre 5,0 et 4,0 (Baker et

14al,, 2002). Cette différence de rétention du fer entre la LF et les transferrines sériques seraitattribuable à une paire de résidus Lys, situés de part et d'autre de la cavité interdomaine dulobe N (Figure 2.4). Ces deux résidus Lys sont reliés entre eux par un pont hydrogène.Lorsque le pH diminue, les deux Lys se protonnent et se répuisent. Cette répulsion conduità l'ouverture de la cavité interdomaine et à la libération du fer. Les deux résidus Lys dulobe N de la LF (Lys2io et Lys3oi) sont, pour leur part, stabilisés par la formation d'un pontionique (trait pointillé sur la Figure 2.5) entre Lys3oi et la chaîne latérale d'un résidu Glu(Baker et al., 2002).La libération de l'ion Fe 3+ entraîne donc l'ouverture de la cavité interdomaine de chaquelobe de la protéine. L'ouverture et la fermeture de la cavité interdomaine dans le lobe Nnécessitent un changement de conformation important qui entraîne une rotation rigide de54° d'un domaine par rapport à l'autre. Deux feuillets-P situés derrière le site de fixation dufer et qui connectent les deux domaines entre eux forment une charnière qui permet lemouvement de rotation (Figure 2.6) (Anderson et al., 1990; Gerstein et al., 1993).Figure 2.6 Représentation schématique du changement de conformation induit par lafixation de l'ion Fe 3+ au niveau du lobe de l'extrémité N-terminale de la LF humaine. La«charnière» au niveau de laquelle la fermeture des deux domaines s'effectue est identifiéepar une flèche derrière le site de fixation du fer. Adapté de Anderson et al. (1990).Anderson et al. (1990) ont par contre constaté que le lobe C de l'apo-LF humaine avait uneconformation fermée en absence de fer. Baker et al. (2002) ont par la suite observé que les

15deux domaines du lobe C de l'apo-LF humaine pouvaient adopter une conformationouverte. Toutefois, le lobe C est plus compact et son ouverture varie entre 18° et 27°. Sousla forme apo, les domaines de chaque lobe de la LF sont très flexibles et il y a très peu dedifférences du point de vue thermodynamique entre les formes ouverte et fermée. Ainsi,bien que la conformation de l'apo-LF avec les deux lobes ouverts soit la conformationprobablement prédominante en absence de fer, d'autres formes peuvent être observées ensolution (Figure 2.7).Figure 2.7 Schéma représentant les différentes conformations que peut adopter chaquelobe (N et C) de l'apo-LF en solution en absence de fer. Tiré de Baker & Baker (2004)Le même changement de conformation avec la rotation rigide des deux domaines de chaquelobe s'applique lorsque la LF fixe ses deux ions Fe 3+ . Avec la fermeture de la cavité de sesdeux lobes en présence de fer, la protéine adopte une structure plus compacte. Il existeraitégalement un mécanisme coopératif lors de la liaison du fer entre les lobes C et N de laprotéine. La liaison du fer dans la cavité interdomaine du lobe C serait préalablementrequise pour la liaison d'un second ion Fe 3+ par le lobe N (Pakdaman et al., 1998; Ward etal., 1996). Ce mécanisme coopératif de liaison du fer serait relié à la proximité de l'héliceade l'extrémité C-t de la protéine avec le lobe N (Figure 2.3). Un contact s'effectuerait àl'interface des deux lobes en un point se situant tout près de la charnière du lobe N., ce qui

16stabiliserait la liaison du fer dans la cavité interdomaine de ce dernier (Jameson et al.,1998).À son état natif dans le lait, la LF est seulement partiellement saturée en fer, soit de 15 à20% (Steijns & van Hooijdonk, 2000). La concentration moyenne en fer dans le lait entierest d'environ 0,2 mg/kg (IDF, 1992). Près de 14% de ce fer serait lié à la membrane duglobule de gras de la matière grasse, 24% aux caséines, 29% aux protéines solubles et 32%à des composés de faibles poids moléculaires et ayant la capacité de chélater des métauxcomme le citrate et le phosphate inorganique (Fransson & Lonnerdal, 1983). Puisque laconcentration en LF dans le lait est faible, seulement de 0,2 à 4,4% du fer contenu dans lelait serait lié à cette protéine. D'autre part, les travaux de Makey et Seal (1976) ontdémontré que la transferrine sérique humaine peut exister dans son milieu physiologiquesous quatre formes ferriques, soit les formes apo, monoferrique, c'est-à-dire saturéeuniquement au lobe C ou bien au lobe N, et la forme holo. Tel qu'observé pour leslactoferinnes humaine (Makino & Nishimura, 1992) et de buffle (Kumar & Bhatia, 1988),la LF bovine partiellement saturée en fer existerait probablement également sous diversesformes ferriques. Étant donné que son niveau de saturation en fer dans le lait est plutôtfaible, la LF se retrouve vraisemblablement majoritairement sous la forme apo et, à unmoindre degré, sous les deux formes monoferriques et la forme holo.2.2.4 Caractéristiques physico-chimiquesEn plus de sa capacité à lier le fer, la LF se distingue des autres protéines du lactosérum parson caractère fortement cationique. Tel que déterminé à partir de sa séquence peptidique, lepi théorique de la LF est très élevé, soit de 9,4 (Steijns & van Hooijdonk, 2000). Par contre,les valeurs expérimentales de pi varient entre 8,0 et 9,0 selon la méthode de déterminationutilisée (Groves, 1960; Shimazaki et al, 1993). De plus, sa charge n'est pas distribuée defaçon uniforme. Il existe trois régions principales où la charge positive de la protéine sedistingue : son extrémité N-t (les résidus 1 à 7), la première hélice-a de l'extrémité N-t

17(résidus 17 à 31) et la région inter-lobale qui comprend l'hélice-a du peptide connectant lesdeux lobes de la protéine (Figure 2.8).ABFigure 2.8 (A) Représentation de la distribution de la charge de surface sur lalactoferrine humaine saturée en fer : les zones en rouge représentent les régions négatives,les zones en blanc les régions neutres et les zones en bleu les régions positives. (B)Représentation tridimensionnelle de la lactoferrine identifiant en bleu les structures de laprotéine qui correspondent aux zones de charge positive. Tiré de Baker & Baker (2005).Présentant une forte charge positive, ces régions de la LF peuvent interagir fortement avecdes macromolécules anioniques pour former des complexes stables. L'extrémité N-t de laprotéine consiste en une séquence peptidique très cationique, formée par une série degroupements basiques (Arg3, Lys4 et Arg7). Cette séquence peptidique serait très flexible etorientée vers l'extérieur de la surface de la protéine, ce qui augmenterait sa capacité àformer des liens électrostatiques avec des molécules de charge opposée. Pour sa part, lapremière hélice-a de l'extrémité N-t de la protéine comprend la majeure partie de la

18séquence d'un peptide antimicrobien identifié par Bellamy et al. (1992b), la lactoferricinebovine (LFcinB; résidus 17 à 41). Ce peptide est issu de l'hydrolyse de la LF par la pepsineet possède plusieurs résidus basiques dans sa séquence, dont cinq résidus Arg et troisrésidus Lys. Cette séquence serait impliquée dans des interactions de type électrostatiqueavec de nombreuses molécules anioniques telles que les lipopolysaccharides (LPS) à lasurface de la membrane de bactéries Gram' (Yamauchi et al., 1993), certainsglycosaminoglycannes (GAG) comme l'héparine et le chondroïtine sulfate (Shimazaki etal., 1998; Shimazaki et al, 2000) et l'ADN (Britigan et al., 2001; Wakabayashi et al.,2003). De plus, les études par cristallographie aux rayons X de la structure de la LF ontdémontré que la fixation du fer ne modifie pas l'orientation relative de cette séquencepeptidique. Le changement de conformation de la protéine induit par la fixation du feraurait donc peu d'influence sur la capacité de cette hélice-oc à interagir avec des moléculesanioniques en solution (Baker & Baker, 2005). La charge positive nette de la LF (pi >8,0)dans le lait contraste avec la charge majoritairement négative des autres protéines dans cesconditions. En raison de leurs charges opposées, des interactions électrostatiques peuvents'établir entre la LF et certaines protéines du lait comme les caséines (Nuyens & Van Veen,1999; Oram & Reiter, 1968), la BSA (Lampreave et al., 1990; Roux-deBalmann et al.,1998) et la |3-LG (Lampreave et al., 1990).D'autre part, la force ionique influence l'état d'association de la LF en solution. Parexemple, à pH neutre en présence de NaCl pour des concentrations variant de 200 à 1000mM, les monomères de la LF polymérisent pour former des tétramères (environ 320 000Da) (Chaufer et al., 2000; Rabiller-Baudry et al., 2001). La formation de tétramères ensolution a également été observée en présence de plus faibles concentrations d'un sel avecun cation divalent (CaCh 20 mM) pour la LF humaine à pH neutre (Bennett et al., 1981),suggérant ainsi une influence de la valence de l'ion sur la susceptibilité de la LF à lapolymérisation.La mobilité électrophorétique de la LF a aussi été étudiée dans divers environnementsphysico-chimiques et varie selon le pH, la force ionique et la composition ionique (Chaufer& Rabiller-Baudry, 2001; Chaufer et al., 2000; Rabiller-Baudry & Chaufer, 2001). En

19présence de NaCl à pH neutre, la LF possède une mobilité électrophorétique positive etcette dernière diminue lorsque la force ionique augmente (1-500 mM). Par contre, à pHneutre et en présence de sels de phosphate de potassium (KH2PO4), la mobilitéélectrophorétique de la LF est négative et demeure relativement constante,indépendamment de la force ionique (5-250 mM). Ce phénomène d'inversion de chargeserait causé par un effet d'écrantage dû à l'adsorption spécifique de contre-ions (les anionsphosphates) à la surface de la molécule (Rabiller-Baudry & Chaufer, 2001).2.2.5 Propriétés de la lactoferrineEn raison de sa structure particulière, de sa surface basique et de sa capacité à lier le fer, laLF possède une multitude de propriétés à la fois nutritionnelles, fonctionnelles,antimicrobiennes et biologiques.2.2.5.1 Propriétés nutritionnellesComme la plupart des protéines du lactosérum, la LF possède une séquence dont le profilest riche en acides aminés essentiels (Hambreaus & Lonnerdal, 1994). Bien que sa valeurbiologique n'ait pas été déterminée, il est connu que la LF est relativement résistante auxenzymes liées à la digestion. L'effet de la digestion gastrique par l'hydrolyse acide à lapepsine a été étudié in vivo et les résultats démontrent qu'une partie substantielle de la LF(>60%) survit au transit gastrique (Troost et al., 2001). De plus des tests in vitro ont révéléque la LF subit uniquement une hydrolyse limitée par les enzymes intestinales (trypsine etchymotrypsine), libérant principalement des fragments de poids moléculaires élevés(Brines & Brock, 1983; Brock et al., 1976; Mata et al., 1994). La digestibilité de la LFdépend également de son niveau de saturation en fer. En raison de sa structure pluscompacte, la holo-LF possède une plus grande résistance à la protéolyse que la apo-LF

20(Brines & Brock, 1983; Brock et al., 1976; Troost et al., 2001). Le glycovariant A de la LFest aussi 10 fois plus résistant à l'hydrolyse trypsique que le glycovariant B à cause de laprésence d'une chaîne glucidique additionnelle en position Asn28i qui bloque un site decoupure de cette enzyme (van Veen et al., 2004).D'un point de vue nutritionnel, la LF bovine est principalement utilisée dans les formuleslactées pour nourrissons afin de mimer la composition réelle en protéines du lait humain.En effet, le lait humain est riche en LF. Cette dernière représente de 10% à 20% desprotéines totales du lait humain (Lonnerdal et al., 1976), alors qu'elle représente seulement2% des protéines du lait bovin (Cayot & Lorient, 1998). De plus, la concentration élevée dela LF et la grande biodisponibilité du fer provenant du lait humain suggère que cetteprotéine serait impliquée dans le métabolisme d'absorption du fer, d'autant qu'un récepteurspécifique a aussi été identifié à la surface de l'intestin chez l'humain (Iyer & Lonnerdal,1993; Kawakami & Lonnerdal, 1991). Par contre, l'existence d'un mécanisme de transportdu fer par la LF reste encore à ce jour sujet de débat. Enfin, une étude récente de Hernell etLonnerdal (2002) a démontré que le lait maternisé, auquel on a ajouté des suppléments enLF bovine, n'avait pas d'influence sur l'absorption du fer chez le nourrisson.2.2.5.2 Propriétés fonctionnellesLes propriétés fonctionnelles sont des caractéristiques désirées qui contribuent aux qualitésautres que nutritionnelles des produits alimentaires (de Wit, 1989a). Les propriétésfonctionnelles de la LF ont été peu étudiées, probablement en raison de sa faibleconcentration dans le lait et du coût encore élevé des isolats de LF. Par contre,l'accroissement de l'utilisation de la LF comme ingrédient bioactif dans des matricesalimentaires nécessite une meilleure compréhension de ses propriétés fonctionnelles.

21La principale propriété fonctionnelle de la LF à avoir été étudiée est son pouvoirantioxydant. Le mécanisme antioxydant de la LF est principalement lié à sa capacité àchélater des métaux lourds (Fe 3+ , Cu 2+ ) qui catalysent les réactions d'oxydation des acidesgras insaturés, responsables de la rancidité oxydative dans les produits alimentaires. L'effetantioxydant de la LF a été étudié dans différents systèmes modèles comme des extraits secsde matière grasse de soya, des émulsions à base d'huile riches en acides gras insaturés etdes liposomes (Huang et al, 1999; Médina et al., 2002; Steijns & van Hooijdonk, 2000).Les capacités antioxydantes de la LF ont également été évaluées dans une variété dematrices alimentaires telles que des boissons lactées, des mayonnaises et des formuleslactées pour nourrissons (Nielsen et al., 2004; Satue-Gracia et al., 2000).Comme pour la plupart des protéines globulaires, la LF présente de bonnes propriétésémulsifiantes. Ye et Singh (2005) ont étudié la capacité de la LF à s'adsorber à l'interfaced'une émulsion d'huile dans l'eau pour la stabiliser. La LF peut former des émulsions fineset stables sur une gamme de pH variant de 3 à 7. Une caractéristique qui distingue cesémulsions est que les gouttelettes d'huile stabilisées par la LF possèdent une charge desurface positive à pH inférieur au pi de la protéine. Les propriétés gélifiantes de la LF ontégalement été étudiées et les propriétés mécaniques des gels formés dépendent de latempérature de formation du gel, de la force ionique et de la présence de (3-LG (Paulsson &Elofsson, 1994).2.2.5.3 Propriétés antimicrobiennesLa LF possède aussi des propriétés antimicrobiennes contre un vaste spectre de microorganismesincluant des virus, des bactéries, des levures, des moisissures et desprotozoaires (Wakabayashi et al., 2003). Deux mécanismes d'action ont été identifiés. Lepremier est relié à sa grande affinité pour le fer. La LF inhibe la croissance de certainesbactéries et de certains champignons en séquestrant le fer, privant ainsi le milieu de

22croissance de cet élément essentiel (Weinberg, 1995). En plus de son actionbactériostatique, la LF possède un pouvoir bactéricide. Elle peut s'attacher directement à lasurface de la membrane de bactéries Gram" et Gram + mais aussi de levures et demoisissures et ainsi provoquer leur lyse cellulaire (Yamauchi et al., 1993). L'activitébactéricide de la LF serait principalement attribuable au fragment peptidique cationiquelocalisé à l'extrémité N-t de la protéine, la LFcinB (Bellamy et al., 1992b). Lorsque isolé,ce peptide possède un pouvoir antimicrobien supérieur à la LF sur une gamme variée demicro-organismes (Tableau 2.2). Par contre, la LF démontre une activité antiviralegénéralement plus efficace que la LFcinB (Wakabayashi et al., 2003).L'activité antivirale de la LF a été démontrée in vitro à la fois sur des virus à ADN et àARN, incluant le rotavirus, le virus syncytiale respiratoire, le virus de l'herpès, le virus del'hépatite C, l'influenza et le virus de l'immunodéficience humaine (Shin et al., 2005; vander Strate et al., 2001). Dans la plupart des cas, la LF préviendrait l'entrée du virus dans lacellule hôte, en bloquant soit les récepteurs cellulaires associés à l'attachement viral ou ense liant directement au virus. Récemment, une autre séquence peptidique possédant desactivités antimicrobiennes a été identifiée sur le lobe NI de la LF, près de la séquence de laLFcinB qui a été nommée la lactoferrampine (van der Kraan et al., 2004). Ce peptide,obtenu par synthèse, correspond à la séquence 268-284 de la protéine et possède aussi desactivités antimicrobiennes contre la levure Candida albicans et plusieurs bactéries. Lemode d'action de la lactoferrampine serait également relié à une séquence riche en résidusbasiques, dont 5 résidus Lys et un résidu Arg. Il serait aussi relié à sa capacité à adopter uneconformation hélicoïdale lorsque la lactoferrampine est placée dans un environnementhydrophobe (van der Kraan et al., 2005).

23Tableau 2.2 Spectre antimicrobien de la lactoferrine et de la lactoferricine bovine. Tiré deWakabayashi et al. (2003).EspècesCIM en ug/mLRéférencesLF bovineLfcin BBactéries Gram-négativeEscherichia coli 0111Escherichia coli I1D8612000200066Escherichia coli 0157 :H7-A30008Salmonella enteritidis 11D604Yersinia enterocolitica IID981Proteus vulgaris JCM1668TKlebsiella pneumoniae JCM1662TPseudomonas aeruginosa MM 1603>800020002000>8000>800012912912(Shinetal., 1998)Bactéries Gram-positiveListeria monocytogenes IDFlbBacillus subtillis ATCC6633Bacillu cereus MMI27210002000>80000,60,69(Wakabayashi et al., 1992)Streptococcus bovis JCM 5672>80003Enterococcus feacalis ATCCE19433>8000>60Staphylococcus aureus JCM2151Staphylococcus aureus RI (résistant aux antibiotiques)Staphylococcus epidermidis JCM2414T1000>800010003123LevuresCandida albicans T1MM176820012,5(Wakabayashi et al., 1996)MoisissuresTrichophyton mentagrophytes TIMM2789Trichophyton rubrum IFO3 242091001006,313(Wakabayashi et al., 2000)(Wakabayashi et al., 2000)CIM : Concentration inhibitrice minimale. Lorsque qu'aucune référence n'est indiquée, les donnéesproviennent de Bellamy et al. (1992a) ou sont des données non-publiées par l'auteur.Les propriétés antimicrobiennes de la LF et de ses peptides suscitent un intérêt grandissantdans l'industrie alimentaire, notamment en raison de son activité bactéricide contreplusieurs micro-organismes pathogènes (Tableau 2.2). De plus, la LF bovine peutmaintenant être utilisée pour le contrôle de la charge microbienne des carcasses de viandede bœuf aux États-Unis, ce pourquoi elle a reçu une mention GRAS {Generally RecognizedAs Safe) (Taylor et al., 2004).

242.2.5.4 Activités biologiquesOn attribue également à la LF une multitude d'activités biologiques, qui sont des propriétéssusceptibles d'intervenir au niveau de diverses fonctions physiologiques chez l'homme. LaLF posséderait des propriétés anti-inflammatoires, antitumorales, immunorégulatrices etstimulatrices de la croissance des tissus osseux. Plusieurs de ces activités sont partagées parla LfcinB, suggérant que leur mode d'action implique des interactions électrostatiques avecd'autres molécules. Le Tableau 2.3 permet de résumer les principales activités biologiquesde la LF et de la LFcinB et les principaux mécanismes d'action proposés.Pour la plupart, les effets ont été observés in vitro et plusieurs de ces propriétés et activitésbiologiques demeurent controversées (Brock, 2002). Par contre, ces activités biologiques etleurs mécanismes d'action commencent à être appuyés par un nombre croissant d'études invivo et la LF présente un énorme potentiel dans la prévention et le traitement du cancer etde l'ostéoporose et comme agent thérapeutique antimicrobien et anti-inflammatoire (Wardet al., 2005).

Tableau 2.3 Quelques activités biologiques de la lactoferrine et de la lactoferricine B etles mécanismes d'action proposés. Adapté de Steijns & van Hooijdonk (2000) et deWakabayashi et al. (2003).Activités biologiquesLF bovineLfcin BRéférencesImmunorégulationImmunosuppressionInhibition de l'induction par les LPS de la++ (07-41)(MattsbyBaltzer et al.,réponse IL-6 dans les monocytes1996)ImmunostimulationStimulation du relargage des IL-8 par les++(Shinoda et al, 1996)neutrophilesStimulation de la phagocytose par les++(Miyauchi et al., 1998)neutrophilesStimulation de l'activité antimicrobienne desND+ (07-26)(Uetaetal.,2001)neutrophilesAnti-inflammatoireInhibition de la production de cytokines pro-+ND(Haversen et al., 2002)inflammatoiresLiaison de LPS+ND(Cohen et al., 1992)AntitumoraleRégulation des cellules NKInduction de l'apoptose++ND+(Damiens et al., 1998)(Roy et al., 2002; Yoo etal., 1997)Stimulation de la production de l 'interleukine++(Tsudaetal.,2002)IL-18Facteur de croissance des tissus osseuxStimulation de la prolifération des ostéoblastes + ND (Cornish et al., 2004)ND : non déterminé; + : effet positif; les nombres entre parenthèses précédés de la lettre f indiquent laséquence peptidique de la LFcinB pour laquelle un effet a été observé.IL : Interleukine; NK : natural killer

262.3 Stabilité thermique des protéines sériques dans le laitLes traitements thermiques appliqués au lait de consommation ou pour la transformationsont utilisés principalement pour augmenter la durée de conservation et assurer l'innocuitédes produits laitiers. Par contre, le chauffage du lait induit également des modificationsimportantes de ses composantes, notamment au niveau des protéines du lactosérum. Enraison de leur structure globulaire, ces protéines sont sensibles à la chaleur. Lestempératures de dénaturation des différentes protéines du lactosérum se situent entre 65°Cet 75°C (Tableau 2.1). La dénaturation thermique entraîne un changement de conformationdes protéines sériques qui, selon l'intensité du traitement, est réversible ou irréversible. Leprocessus de dénaturation implique la rupture de forces (liens hydrogène, interactionsélectrostatiques et liens disulfure) qui stabilisent la structure native des protéines, ce quipeut entraîner l'exposition de groupements réactifs initialement enfouis au cœur de lamolécule. C'est le cas de la |3-LG dont la dénaturation dans le lait conduit à l'expositiond'un groupement SH. L'exposition de ce SH initie la formation de S-S intermoléculairesavec d'autres protéines du lait possédant des SH (p-LG et BSA) par le biais de réactionsd'oxydation SH/SH, mais aussi avec des protéines possédant uniquement des S-S (a-LA,K-caséine et (X2-caséine) via des réactions d'échange thiol/disulfure (SH/S-S) (Dalgleish,1990; Dalgleish et al., 1997b; Jang & Swaisgood, 1990; Noh & Richardson, 1989; Smits &Vanbrouwershaven, 1980; Vasbinder et al., 2003). Le chauffage du lait provoque donc unesérie d'interactions covalentes entre les protéines du lait. L'une de ces réactions est laformation d'un complexe entre la P-LG et la K-caséine à la surface de la micelle de caséine.À noter, cette interaction impliquerait l'établissement préalable de liens hydrophobes entreces deux protéines (Haque & Kinsella, 1988; Haque et al., 1987; Jang & Swaisgood, 1990).Bien que l'association P-LG/K-caséine soit favorisée, les autres protéines sériques peuventaussi interagir avec la K-caséine à la surface de la micelle suite au bris de S-Sintramoléculaires et à l'exposition de SH (Dalgleish et al., 1997a; Vasbinder et al., 2003).Le chauffage du lait provoque la formation d'autres complexes covalents comme desagrégats de protéines sériques et la formation d'agrégats entre des protéines sériques et descaséines (K-caséine et a.2-caséine) non-micellaires (Vasbinder et al., 2003). Les protéines

27sériques peuvent également interagir avec les protéines de la membrane du globule de graspar le biais de ponts S-S intermoléculaires (Corredig & Dalgleish, 1996; Dalgleish &Banks, 1991; Lee & Sherbon, 2002; Ye et al, 2004a; Ye et al., 2004b). L'impact de ladénaturation thermique des protéines du lactosérum lors du chauffage du lait est doncimportant. D'une part, la modification de leur conformation native peut altérer leurspropriétés fonctionnelles et leurs activités biologiques et, d'autre part, en favorisant laformation de complexes, la dénaturation des protéines sériques peut aussi avoir un impactnégatif sur leur fractionnement (Smithers et al., 1996).2.4 Stabilité thermique de la lactoferrineComme les autres protéines du lactosérum, la LF est une protéine globulaire qui estsensible aux traitements à la chaleur. Par contre, la fixation du fer modifie la conformationde la LF, ce qui influence son comportement à la chaleur. La dénaturation thermique de laLF a été étudiée dans différents systèmes modèles (H2O, tampon phosphate, simulated milkultraflltrated (SMUF)) par la technique de calorimétrie différentielle à balayage (DSC)(Kussendrager, 1994; Paulson et al., 1993; Ruegg et al., 1977; Sanchez et al, 1992).L'analyse en DSC a permis de déterminer les paramètres thermodynamiques de ladénaturation de la LF en fonction de son niveau de saturation en fer. Ces études ontdémontré que la stabilité thermique de la LF augmente avec son niveau de saturation en fer.En effet, l'apo-LF présente une seule transition endothermique avec une température dedénaturation généralement basse, soit entre 60°C et 65°C. L'holo-LF est beaucoup plusstable à la chaleur et présente une transition principale avec une température dedénaturation d'environ 90°C. Par contre, certains auteurs ont observé une autre transitionendothermique pour l'holo-LF à plus faible température, soit entre 70°C et 75°C (Ruegg etal., 1977; Sanchez et al., 1992). Ces deux transitions seraient reliées possiblement à unedifférence de stabilité entre les deux lobes de la protéine lorsque saturée en fer. Le lobe Cserait plus compact que le lobe N et donc plus stable à la chaleur (Sanchez et al., 1992) ou àla formation de formes monoferriques lors du chauffage qui serait causée par la

28séquestration du fer par des ions phosphates présents en solution (Ruegg et al., 1977). LaLF native, qui est partiellement saturée en fer (15%-20%), présente quant à elle deuxtransitions endothermiques. La première transition correspond au pic de dénaturation de laforme apo (~65°C) et la seconde, à température plus élevée, correspond à la dénaturation dela forme holo (~90°C) (Figure 2.9).•fiECMAA „, A ^AV.BC—i 120 40 60 «0 100Tcmperalure (°C)Figure 2.9 Thermogrammes de la lactoferrine (A) apo, (B) native et (C) holo dans l'eauà pH 7,2. Adapté de Paulson et al. (1993)Suite à un chauffage de la LF native jusqu'à 80°C et à une seconde analyse en DSC,Kussendrager (1994) a observé une renaturation de 60% de la transition correspondant à lapartie apo de la protéine. Cet auteur a aussi observé que la seconde transition associée à lapartie holo n'était pas affectée. Ce résultat montre que la fixation du fer contribue àmaintenir sa conformation plus compacte et globulaire après traitement thermique, ce quiexpliquerait la différence de taux de renaturation entre les transitions apo et holo de la LFpartiellement saturée en fer. Par contre, après l'application d'un traitement thermiquejusqu'à 110°C, aucune renaturation n'est observée pour les trois formes ferriques de la LF

(Sanchez et al, 1992). La dénaturation thermique de la LF suivrait également une cinétiqued'ordre 1 (Kussendrager, 1994; Sanchez et al., 1992).D'autres éléments de structure, comme la glycosylation de la LF, ont un impact sur lastabilité thermique de la protéine. En effet, Antonini et al. (2000) ont observé unediminution de la stabilité à la dénaturation à la chaleur de la protéine suite à une hydrolysede ses chaînes glucidiques. Rossi et al. (2002) ont observé que l'hydrolyse des groupementsd'acide neuraminique, aussi nommés groupements d'acide sialique et situés à l'extrémitédes chaînes glucidiques de la protéine, diminue aussi sa stabilité à la chaleur. Ces auteursont également observé que la formation de complexes stables entre ces groupementsd'acide sialique et le Ca 2+ à faible concentration (100 i^M) augmenterait significativementla stabilité thermique de la protéine.L'impact du pH sur la stabilité thermique de la protéine varie cependant selon la techniqued'analyse utilisée. Les études en DSC démontrent que la LF est plus sensible à ladénaturation thermique à pH acide (Kussendrager, 1994; Paulson et al., 1993). Toutefois,Abe et al. (1991) ont observé, en vérifiant l'effet du traitement à la chaleur surl'homogénéité du profil de la protéine en chromatographie liquide haute-performance enphase inverse (RP-HPLC), que la stabilité de la LF était plus grande à pH acide. Cesderniers ont observé que, pour des traitements thermiques à pH 4,0 (90°C-100°C/5minutes), la LF conserve certaines de ses propriétés physiologiques comme sa capacité àlier le fer, son antigénicité et ses propriétés antibactériennes. Ces auteurs suggèrent que cesconditions seraient propices pour la pasteurisation de la protéine. De plus, à ce pH, la LFpréchauffée (70°C/3 min) et subissant un traitement ultra-haute température (UHT)(120°C/2 s) ne perd que 3% de sa capacité à lier le fer. Par contre, à pH inférieur à 4,0, pourdes traitements thermiques plus sévères (100°C à 110°C/5 min), la LF subit une hydrolyseacide provoquant la libération de fragments peptidiques. Les propriétés antimicrobiennes deces fragments sont égales et parfois même supérieures à celles de la protéine non-chauffée(Abe et al., 1991; Saito et al., 1991). Kawakami et al. (1992) ont également observé que la

30LF était plus stable à pH acide qu'à pH neutre et alcalin. En plus, ces auteurs ont démontréque le niveau d'agrégation de la LF augmente avec la force ionique et suggèrent que ceteffet serait dû à la diminution des forces répulsives entre les molécules à pH inférieur à sonpi. D'autre part, à pH neutre et alcalin, l'agrégation et parfois la gélification de la protéineont été observées en fonction de l'intensité du traitement thermique (Abe et al., 1991;Kawakami et al., 1992).Différentes études ont aussi tenté d'évaluer l'impact de différents traitements thermiquessur la stabilité de la protéine de façon indirecte en mesurant l'effet du chauffage sur sespropriétés. Paulson et al. (1993) ont démontré que la pasteurisation haute (HTST; 72°C/15s) avait peu d'influence sur les propriétés bactériostatiques de l'apo-LF alors qu'untraitement UHT (135°C/4 s) inhibe sa capacité bactériostatique. D'autre part, Oria et al.(1993) ont évalué l'effet de différents traitements thermiques (72°C/20 s; 85°C/20 min et137°C/8 s) sur la capacité de la LF à interagir avec des monocytes. L'ensemble de cestraitements s'est avéré avoir peu d'influence sur cette propriété de la LF.Diverses études ont démontré que la stabilité thermique de la LF diminue dans le lait(Sanchez et al., 1992) ou dans le lactosérum (Kussendrager, 1994). Cette diminution seraitattribuable à des interactions électrostatiques entre la LF et les caséines ou les protéines dulactosérum (Kussendrager, 1994; Paulson et al., 1993; Sanchez et al., 1992). Par contre,Sanchez et al. (1992) et Luf et Rosner (1997) affirment que la pasteurisation HTST,couramment utilisée dans l'industrie laitière, a peu d'influence sur la structure de la LF.Dupont et al. (2006) n'ont, pour leur part, pas décelé d'effet de la pasteurisation HTST surla concentration de la LF dans le lait déterminée avec un test immuno-enzymatique ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). Par contre, Paulson et al. (1993) ont observé quela pasteurisation HTST induit une dénaturation partielle (40% à 50%) de la composante apode la protéine partiellement saturée (native). De même, à la fois la pression et lestraitements thermiques conduisent à l'agrégation de la LF dans des CPL (Patel et al., 2004)et dans le lait cru (Nabhan et al., 2004). La présence de la LF dans des agrégats obtenus à

31partir du chauffage du lait écrémé en poudre a également été détectée (Jean et al., 2006).Dans tous ces cas, l'association de la LF avec les autres protéines lors du chauffage de cesproduits laitiers incluait des interactions covalentes. Comme le conclut Kussendrager(1994), la stabilité thermique de la LF est grandement influencée par son environnementphysico-chimique comme le pH, la force ionique, et la présence d'autres protéines(protéines du lactosérum) en solution et, par conséquent, les paramètres de dénaturationthermique de la LF doivent être établis dans les conditions de l'application désirée.2.5 Fractionnement de la lactoferrineEn raison de ses nombreuses activités biologiques, la LF suscite un intérêt majeur pour sonutilisation comme ingrédient bioactif dans les produits alimentaires, pharmaceutiques etcosmétiques. Par contre, comme la concentration en LF dans le lait bovin est très faible(0,02 à 0,3 g.L" 1 ), un fractionnement s'impose pour pouvoir maximiser l'utilisation de cetteprotéine. Le caractère cationique de la LF a été mis à profit pour son fractionnement,principalement sur des résines d'échange cationique (Doultani et al., 2004; Ekstrand &Bjorck, 1986; Fee & Chand, 2006; Francis et al., 1995; Hahn et al., 1998; Law & Reiter,1977; Tsuji et al., 1989; Uchida et al., 2003; Yoshida & Ye, 1991; Yoshida & Yexiuyun,1991), mais également sur des résines d'échange anionique (Gordon et al., 1963; Groves,1960; Groves et al., 1965; Ye et al., 2000; Yoshida, 1989). Le fractionnement de la LFutilisant des résines d'échange ionique a fait l'objet de nombreux brevets (Burling, 1992;Frankinet et al., 1988; Frédéric et al., 1985; Kawakami et al., 1991; Kussendrager et al.,1997; Okogoni et al., 1988; Peyrouset & Spring, 1984; Prieels & Peiffer, 1987; Uchida etal., 1996). À l'échelle industrielle, la principale stratégie utilisée pour le fractionnement dela LF se base sur l'affinité de la LF à pH inférieur à son pi pour les résines d'échangecationique. En effet, au pH du lait (pH -6,7) ou du lactosérum de fromagerie (pH -6,2), laLF possède une charge positive qui contraste avec la charge négative que portent lesprotéines majeures du lait et du lactosérum. La LF est principalement extraite à partir dulait écrémé et du lactosérum de fromage ou de caséinerie (Tomita et al, 2002). Par contre,

32le fractionnement de la LF pourrait s'effectuer à partir d'autres substrats laitiers comme leperméat de microfiltration de lait (Fee & Chand, 2006) ou le colostrum, dont la teneur englycovariants A est plus élevée (Shimazaki & Nishio, 1991; Tsuji et al., 1989; Yoshida etal., 2000). Lorsque mis en contact avec une résine d'échange cationique, la LF chargéepositivement s'adsorbe sur la résine alors que la majorité des autres constituants du lait oudu lactosérum ne sont pas fixés. Toutefois, d'autres protéines mineures possédant uncaractère cationique fort peuvent s'adsorber sur la résine dans ces conditions, comme c'estle cas pour la LP, le lyzozyme, des IgG, des composantes sécrétoires et des facteurs decroissance. Après rinçage de la résine, la LF est éluée en augmentant le pH ou la forceionique. La LF peut être éluée en une seule étape avec les autres constituants mineursbasiques ou éluée de façon séquentielle pour obtenir une fraction purifiée (>90% pureté).Ces étapes peuvent être réalisées en mode cuve agitée (batch) ou dans une colonne. Lafraction de la LF pure ou du mélange de protéines mineures basiques peut par la suite êtreconcentrée par UF, déminéralisée par DF, pasteurisée et lyophilisée. Les deux dernièresétapes de ce procédé peuvent être remplacées par une étape de MF et une étape de séchagepar atomisation (Tomita et al., 2002). Actuellement, de 20 à 30 tonnes de LF sont produitesannuellement dans le monde (Tomita et al., 2002).Cependant, en plus d'être onéreuses, les techniques de chromatographie d'échange ioniquesur colonne sont susceptibles à l'augmentation de pression due au colmatage de la résine,elles s'opèrent en mode semi-continu et elles produisent d'importants volumes d'effluents(Pearce, 1992). Différentes stratégies ont été utilisées pour diminuer le colmatage desrésines soit l'écrémage du lait et la délipidation du lactosérum, l'utilisation de résinespossédant des billes de diamètre de pores plus élevé (100 à 300 |am) (Doultani et al., 2003;Fee & Chand, 2006; Kussendrager et al., 1997) et l'utilisation de colonnes sur un lit fluidisé(Shiozawa et al., 2001). L'utilisation d'une série de colonnes pivotant sur un carrousel(Simulated Moving Bed) permet d'autre part d'effectuer, en parallèle, les différentes étapesde conditionnement, d'adsorption, de désorption et de régénération de la résine, ce quipermet de maintenir un mode de production en continu (Andersson & Mattiasson, 2006).D'autres procédés utilisant des membranes d'échange cationique ont été développés dans le

33but d'améliorer les débits et la rapidité de séparation en raison d'un meilleur transfert demasse, lequel s'effectue par convection comparativement à la diffusion en chromatographiesur colonne (Chiu & Etzel, 1997; Dyonysius et al., 1991; Mitchell et al., 1993; Plate et al.,2006; Plate et al., 2001; Ulber et al., 2001). Toutefois, ce type de procédé en est à l'échellepilote et sa rentabilité reste à démontrer à l'échelle industrielle.De nombreuses méthodes de chromatographie d'affinité ont été développées pour isoler laLF à partir de différents substrats laitiers. Une variété de résines, couplées avec des ligandsd'affinité, ont été développées. Les principaux ligands d'affinité sont des anticorpsmonoclonaux (Kawakami et al., 1987; Li-Chan et al., 1998), de l'ADN (Zhang et al.,2003), de l'héparine (Almashikhi & Nakai, 1987), des métaux immobilisés (IMAC)(Almashikhi et al., 1988; Fukumoto et al., 1994), des colorants (Grasselli & Cascone, 1996;Shimazaki & Nishio, 1991), des gangliosides du lait (Walsh & Nam, 2001) et des phages(Noppe et al., 2006). En raison de leur spécificité, ces techniques permettent généralementd'obtenir des niveaux de pureté élevés, mais leur application à l'échelle industrielledemeure limitée. Chen et Wang (1991) ont, quant à eux, utilisé un ligand d'affinité(héparine) en solution pour augmenter de façon importante la rétention de la LF parmembrane de MF, permettant ainsi de la séparer du reste des protéines du lactosérum. Untel procédé ne semble toutefois pas une stratégie envisageable pour le fractionnement àl'échelle industrielle. À ce jour, bien que des stratégies de séparation par des procédésmembranaires aient été proposées (Zydney, 1998), aucune étude ne rapporte lefractionnement de la LF par membranes à partir du lait ou du lactosérum.2.6 Fractionnement par procédés membranairesLes procédés par membranes sont bien intégrés dans les différents schémas detransformation de l'industrie laitière. Ils sont principalement utilisés pour la concentrationdu lait, la concentration des protéines du lactosérum et de ses dérivés et pour la réduction

34de la charge microbienne du lait. Les procédés par membranes utilisés dans l'industrielaitière sont la MF, l'UF, la nanofiltration (NF) et l'osmose inverse (01). La classificationde ces procédés s'effectue en fonction du diamètre des pores de la membrane. Le tableau2.4 présente les principales caractéristiques de ces membranes.Tableau 2.4 Principales caractéristiques des membranes utilisées dans l'industrie laitère.Tiré de Bazinet et al. (2002)Diamètre des poresEspèces retenues par lesmembranesPression d'opérationMicrofiltration> 0,1 \xm• Particules en0,1-2 barsuspensions• Globules de matièresgrasses• Micelles de caséinesUltrafiltration1-500 nm• Protéines solubles1-10 barNanofiltration0,1-1 nm• Lactose15-30 bar• Minéraux complexesOsmose inverse

352.6.1 Les séparations par membranes2.6.1.1 Principes générauxLa filtration par membranes se définit comme la séparation d'un ou de plusieursconstituants d'un fluide par une membrane. Elle est basée principalement sur l'exclusionstérique des constituants (Cheryan, 1998). Ces procédés utilisent une membrane poreusequi permet de concentrer ou de séparer de manière sélective les solutés d'un solvant. Cesprocédés peuvent être opérés selon deux modes d'alimentation du fluide à filtrer, soit lemode frontal (dead-end) ou le mode tangentiel (Figure 2.10). En mode frontal, la pressionest appliquée de façon perpendiculaire à la membrane, ce qui accroît l'accumulation rapidedes solutés à sa surface, donc son encrassement. Pour cette raison, les procédés de filtrationsont le plus souvent opérés en mode tangentiel où le fluide à filtrer est alimenté de façonparallèle à la surface de la membrane.AlimentationI \1 1 1 1 !PerméatMembraneAlimentationRelcntat1 1 1 1 1PerméatMembraneFigure 2.10Mode d'alimentation en UF et MF : (A) frontal et (B) tangentiel. Tiré deCharcosset (2006)

36Ce mode d'alimentation permet de diminuer l'accumulation de solutés en balayant lasurface de la membrane. Ainsi, ce mode favorise le passage du solvant et des solutés àtravers la membrane, sous l'action de la pression. La fraction qui traverse la membrane senomme le perméat alors que la fraction retenue est le rétentat. De plus, le mode tangentielpermet de recirculer le rétentat vers le réservoir d'alimentation et de poursuivre laséparation ou la concentration des solutés. La vitesse de recirculation (v) correspond à lavitesse du fluide circulant parallèlement à la surface de la membrane. Elle permet decontrôler le régime d'écoulement du fluide, qui peut être laminaire ou turbulent.D'autre part, en filtration, la force motrice de la séparation est la pression transmembranaire(PT) qui induit un flux de solvant à travers les pores de la membrane (Cheryan, 1998).Expérimentalement, le flux de perméation (Jp) représente le volume de solvant qui passe àtravers une membrane exprimé par unité de temps en fonction de la surface membranaire(2.1)Dans cette équation, A correspond à l'aire de la membrane, AV à la variation du volume(V) de perméat et At à la variation du temps (t).2.6.1.2 Concentration de polarisation et colmatageLe gradient de pression génère aussi un transport convectif des solutés en direction de lamembrane. L'accumulation progressive des solutés retenus à la surface de la membraneentraîne une diminution du Jp en fonction du temps. Le colmatage de la membrane est leterme général pour décrire ce phénomène. D'abord, le flux convectif des solutés endirection de la membrane conduit à l'établissement rapide d'un gradient de concentration àla surface de celle-ci. Ce premier phénomène est illustré à la figure 2.11 et se nomme laconcentration de polarisation (Cheryan, 1998; Marshall et al., 1993).

37ci5JSGelw•g•-d1CoucoSI.M oco1AlimPerméatFlux convectifDiffusionFigure 2.11 Schéma illustrant le phénomène de concentration de polarisation. Adapté deCheryan(1998).Par contre, le transport convectif de solutés à la surface de la membrane est contrebalancépar un phénomène de diffusion des solutés en direction inverse, soit vers la solutiond'alimentation (Figure 2.11). En cours de filtration, les forces de convection et de diffusions'équilibrent (Cheryan, 1998). La concentration de polarisation est un phénomèneréversible et disparaît lorsque la pression est annulée. L'ajustement des paramètreshydrodynamiques (Pj et v) permet aussi de contrôler la couche limite de polarisation etd'améliorer les performances de la filtration.Par contre, selon les conditions d'opération, l'accumulation de solutés au niveau de lamembrane peut mener à la formation d'un gel (Cheryan, 1998). Le colmatage est cetteaccumulation réversible ou bien l'adsorption irréversible de solutés à la surface et àl'intérieur des pores de la membrane (Cheryan, 1998; Marshall et al., 1993). Le colmatage

38est réversible lorsque l'ajustement des paramètres hydrodynamiques permet de rétablir leflux de perméation. Il est toutefois considéré comme irréversible lorsque seuls l'arrêt de lafiltration et un nettoyage avec des détergents chimiques permettent de rétablir le Jp. Lecolmatage peut donc avoir un impact négatif sur les performances des opérations et sur lasélectivité de la séparation par membranes.2.6.1.3 Évaluation de la sélectivité des séparations par membranesDivers paramètres permettent d'évaluer la sélectivité de séparation d'une membrane.D'abord, les capacités de séparation d'une membrane d'UF sont définies par son seuil decoupure {molecular weight cut-off; MWCO), ce qui correspond à la masse moléculaire (Da)des solutés pour laquelle est observée une rétention de 90% par la membrane. En MF, c'estplutôt la taille des pores (|xm) de la membrane qui définit ses capacités de séparation. Lacapacité de rétention d'un soluté par une membrane en filtration est déterminée par lecoefficient de rejet (a):(2.2)Dans cette équation, C p correspond à la concentration du soluté dans le perméat et CR à saconcentration dans le rétentat. La capacité de séparation d'un soluté par une membrane peutégalement être exprimée par le pourcentage (%) de transmission (Tr) :7> = (l-o-)*100 (2.3)Le calcul de la Tr d'un soluté peut être utilisé pour déterminer la sélectivité de la séparationentre deux espèces d'un mélange. Ainsi, le facteur de séparation (S) d'une membrane entredeux solutés (x et y) est exprimée par :

39x /yTry(2-4)Cela correspond à la Tr d'un composé x à isoler par rapport à la Tr d'un composé y.2.6.2 Fractionnement des protéines du lactosérum par procédés parmembranesL'application des procédés par membranes pour le fractionnement des protéines dulactosérum suscite un intérêt majeur en vue d'optimiser l'utilisation de leurs propriétésfonctionnelles, nutritionnelles ou biologiques. Divers procédés ont été développés pourfractionner les protéines du lactosérum comme la précipitation sélective, lachromatographie d'échange d'ions, les procédés par membranes ou une combinaison de cesprocédés (Brans et al., 2004; Timmer & van der Horst, 1997; Zydney, 1998). Les études dufractionnement des protéines du lactosérum ont porté principalement sur la séparation desprincipales protéines, soit la p-LG et l'a-LA. L'utilisation des membranes d'UF possédantdes seuils de coupure élevés, c'est-à-dire entre 50 000 Da et 150 000 Da, permet d'obtenirdes fractions enrichies en a-LA (Bottomley, 1991; Lucas et al., 1998; Muller et al., 2003;Roger et al., 1984). Ces procédés se basent sur la rétention sélective de la (3-LG qui seretrouve sous forme dimérique (36 000 Da) dans le lactosérum, contrairement à l'a-LA quiest sous forme monomérique (14 800 Da). L'inconvénient majeur de ces procédés consisteen leur faible performance en terme de pureté et de rendement d'extraction. Différentesstratégies ont été étudiées pour améliorer la performance de la séparation telles que lamodification des conditions physico-chimiques (pH et la force ionique) de séparation(Cheang & Zydney, 2003), la modification des propriétés de surface des membranes et lemode d'opération (Lucas et al., 1998; Muller et al., 1999). D'autre part, des membranesd'UF de 100 000 Da et 500 000 Da ont aussi été utilisées pour concentrer les IgG à partirde CPL (Scott & Lucas, 1989) ou du lactosérum (Bottomley, 1993), mais les rendementssont plutôt faibles. Mehra et Donnelly (1993) ont étudié l'effet du pH sur la séparation desdifférentes protéines du lactosérum avec des membranes d'UF de 100 000 Da et ont réussi

40à séparer partiellement les protéines de faibles poids moléculaires (|3-LG et a-LA) desprotéines de poids moléculaires élevés (BSA, LF et IgG), à pH alcalin (pH: 8,0). Ulber etal. (2001), en clarifiant du lactosérum avec des membranes de MF, ont observé que la Tr dela LF variait selon la taille des pores et le type de membranes utilisé. L'effet des paramètreshydrodynamiques (PT et v) sur le colmatage d'une solution modèle de LF a également étéétudié et l'ajustement du débit de perméation et de v permet de diminuer le colmatage.Outre les effets stériques, la Tr de la LF peut également être influencée par des interactionsde nature électrostatique s'établissant entre la protéine et la membrane. Différentesapproches ont été utilisées en système modèle pour améliorer la séparation de la LF enmettant à profit ces interactions. Il s'agit de la modification de l'environnement physicochimique(pH et force ionique) (Chaufer et al., 2000; Nystrom et al., 1998; Rabiller-Baudryet al., 2001) et de la modification chimique des propriétés de surface des membranes(Rabiller-Baudry et al., 2001).2.7 ElectrofiltrationLa sélectivité des membranes pour la séparation des protéines du lactosérum en UF et MFpeut être modulée par les propriétés de charges électriques des protéines et par un contrôlerigoureux des paramètres hydrodynamiques. Par contre, l'application efficace de l'UF et dela MF pour la séparation des protéines du lactosérum demeure tout de même tributaire deslarges distributions de diamètres de pores de ces membranes, des phénomènes deconcentration de polarisation et de colmatage et des interactions protéine-protéine (van Reiset al., 1997; Vaneijndhoven et al., 1995). Toutefois, la superposition d'un champ électriquependant le processus de filtration pourrait permettre de mettre à profit les différences decharge nette entre les protéines en fonction de l'environnement physico-chimique. Celapermettrait aussi d'augmenter leur sélectivité tout en limitant les inconvénients reliés à laconcentration de polarisation et au colmatage observés en UF et MF conventionnelles.

412.7.1 Principes de l'électrofîltrationLa fïltration assistée par un champ électrique, ou électrofiltration, consiste à appliquer unchamp électrique à un procédé conventionnel de fïltration (Huotari et al., 1999a).L'électrofîltration s'effectue généralement avec des systèmes de fïltration en modetangentiel et différentes géométries de module sont accessibles, soit le module plan et lemodule tubulaire (Figure 2.12). Généralement, le champ électrique est appliqué entre deuxélectrodes, l'une insérée dans le compartiment rétentat, l'autre dans le compartimentperméat (Figure 2.12a). La membrane peut également servir directement d'électrodelorsque le matériau membranaire est conductif. Dans ce cas, le champ est appliqué entre lamembrane et une autre électrode, localisée dans le compartiment rétentat (Guizard et al.,1989; Huotari et al., 1999a) (Figure 2.12b). Bien que cette configuration permette de limiterle phénomène d'électro-osmose, son usage est limité par le manque de membranes poreusesfaites de matériaux conducteurs.CATHODE MEMBRANE AJNODECationsAn son 3PermeateftowAMOOEe: - •ftowî FeedflowFigure 2.12 Différentes géométries d'un module d'électrofiltration : (A) module plan et(B) module tubulaire. Tiré de Huotari et al. (1999b)

La force motrice en électrofiltration est à la fois la PT et le champ électrique. La sélectivitéde la séparation est donc influencée par des différences de taille et des différences demobilité électrophorétique entre les molécules à séparer. De plus, lorsqu'un gradient depotentiel électrique est établi en électrofiltration, deux phénomènes électrocinétiquespeuvent s'établir, soit l'électrophorèse et l'électro-osmose (Huotari et al., 1999b; Jagannadh& Muralidhara, 1996). L'électrophorèse est le mouvement d'une particule chargée induitpar un champ électrique par rapport à celui du liquide (Huotari et al., 1999b). Enélectrofiltration, l'électrophorèse s'effectue dans la direction de l'électrode de signe opposéet dans le sens du vecteur du champ électrique, c'est-à-dire en direction normale par rapportà la membrane (Figure 2.12a) (von Zumbusch et al., 1998).La mobilité électrophorétique d'une particule chargée dans un champ électrique est décritepar l'équation de Henry :(2.5,Dans cette équation, |a e représente la mobilité électrophorétique de la particule, s laconstante diélectrique de l'électrolyte, Ç le potentiel zêta de la particule, f(ka) la fonctiond'Henry et r| la viscosité de la solution. Selon la valeur de la constante diélectrique del'électrolyte, les valeurs de f(ka) les plus fréquemment utilisées sont les approximations deHuckel (1,0) et de Smoluchowski (1,5).

Or, la |a e de la particule chargée dans un champ électrique est reliée à sa vélocitéélectrophorétique selon l'équation suivante :(2.6)Dans cette équation, v e représente la vélocité électrophorétique et E le champ électriqueappliqué.Les deux équations précédentes montrent que la mobilité électrophorétique d'une protéinedépend du champ électrique appliqué, de la constante diélectrique, de la viscosité et dupotentiel zêta de la protéine. Ce dernier varie avec les conditions physico-chimiques (pH etforce ionique) du milieu. Il augmente lorsque le pH de la solution s'éloigne de part etd'autre du pi de la protéine (pH où la charge nette de la protéine est égale à zéro) etdiminue avec la force ionique. Cet effet de la force ionique sur le potentiel zêta peut êtreexpliqué par une diminution du rayon hydrodynamique de la protéine suite à uneaugmentation de l'effet d'écran des contre-ions sur sa double couche électrique. D'autrepart, une augmentation de la constante diélectrique de la solution permet d'augmenter lamobilité électrophorétique. Enfin, la mobilité électrophorétique dépend de la viscosité de lasolution, qui elle diminue avec la température.L'application d'un champ électrique de part et d'autre d'une membrane chargée peutégalement entraîner un phénomène d'électro-osmose (Huotari et al., 1999b; Jagannadh &Muralidhara, 1996). Lorsqu'une membrane chargée est mise en contact avec une solutiond'électrolyte, il se forme une couche diffuse de contre-ions à sa surface. L'application d'unchamp électrique de part et d'autre de la membrane provoque le déplacement des contreionsvers l'électrode de charge opposée. Le déplacement des contre-ions entraîne unmouvement du liquide à travers la membrane qui se nomme le flux électro-osmotique

44(Huotari et al, 1999b; Jagannadh & Muralidhara, 1996). Afin d'améliorer le J P par électroosmose,la charge nette de la membrane doit être du même signe que la particule chargée(Huotari et al., 1999b). L'amélioration de Jp grâce au phénomène d'électro-osmosedemeure toutefois faible par rapport à celle induite par l'électrophorèse (Huotari et al.,1999b).Par ailleurs, d'autres effets électriques peuvent se produire lorsqu'un champ électrique estappliqué en électrofïltration, comme l'effet Joule (production de chaleur) et des réactionsélectrolytiques à la surface des électrodes (Huotari et al., 1999b; Jagannadh & Muralidhara,1996; Weigert et al., 1999). Les réactions électrolytiques pouvant survenir aux électrodessont la formation de gaz, une accumulation de dépôts à la surface des électrodes, lacorrosion des électrodes, et la modification du pH (Huotari et al., 1999b; von Zumbusch etal., 1998). Les réactions d'électrolyse de l'eau à la cathode et à l'anode sont décrites par leséquations suivantes (Akay & Wakeman, 1996) :2H 2 O + 2é -> H 2 (g) + 2OH~Cathode: et (2.7)M" + +ne~ ->M6H 2 O -> O 2 (g) + 4H.O+ + 4é~Anode: et (2.8)M,, -+M" + +ne~Dans ces équations M représente le métal qui compose chaque électrode. La production degaz à la surface des électrodes peut avoir, dans certains cas, un effet bénéfique sur le Jp. Lesbulles de gaz microscopiques empêcheraient la formation de la couche de polarisation et le

colmatage de la membrane (Huotari et al., 1999b; Mameri et al., 1999; Weigert et al.,1999).2.7.2 Séparation des protéines par électrofîltrationL'électrofiltration des protéines a initialement été utilisée comme stratégie pour améliorerles Jp en prévenant la concentration de polarisation et le colmatage des membranes(Brunner & Okoro, 1989; Huotari et al, 1999b; Iritani et al., 2000; Lentsch et al, 1993;Oussedik et al., 2000; Park, 2005; Radovich et al., 1985; Rios & Freund, 1991; Rios et al.,1988; Robinson et al., 1993; von Zumbusch et al., 1998; Wakeman, 1998; Yukawa et al.,1983). Ces études, réalisées avec des solutions modèles de protéines, ont démontré que leflux de convection généré par la PT peut être contrebalancé par l'application d'un champélectrique et ainsi améliorer de façon importante le Jp par rapport à la filtrationconventionnelle. En effet, pour le processus d'électrofiltration d'une protéine chargée, ilexiste une valeur de champ électrique pour laquelle la migration en direction de lamembrane est nulle. Cette valeur est appelée la force de champ électrique critique (E c )(Henry et al., 1977; Huotari et al., 1999b). Lorsque la force du champ électrique estsupérieure à E c et que sa polarité est de signe opposé à la particule chargée, la migration dela protéine peut s'effectuer contre le flux de convection. En minimisant l'accumulation deprotéines à la surface de la membrane, l'application d'un champ électrique à une valeursupérieure à E c permet de prévenir la concentration de polarisation et le colmatage à lasurface de la membrane, puis d'augmenter le Jp (Radovich et al., 1985; Rios et al., 1988).De plus, Wakeman (1998), en utilisant une suspension de BSA, a démontré que la rétentionde cette protéine observée sous l'effet d'un champ électrique permet l'utilisation demembranes avec des diamètres de pores plus larges. Bien que de nombreux auteurs aientobservé des augmentations importantes de Jp en électrofiltration de solutions simples deprotéines, peu de données ont démontré l'impact des champs électriques sur la filtration demélanges complexes de protéines.

46D'autre part, la superposition d'un champ électrique permet aussi d'augmenter lefractionnement de mélanges complexes de bio-molécules. Quelques études ont obtenu uneaugmentation de la sélectivité de séparation de mélanges d'acides aminés et d'hydrolysatspeptidiques (Bargeman et al., 2000; Bargeman et al., 2002a; Bargeman et al., 2002b;Daufin et al., 1995; Lapointe et al., 2006). Par contre, peu d'études portant sur la séparationde protéines en électrofiltration ont été effectuées (Lentsch et al., 1993; Rios et al., 1988;Yukawa et al., 1983). Radovich et al. (1980) ont observé une augmentation entre 2 et 6 dufacteur de séparation d'un mélange binaire de BSA et d'IgG avec une membrane d'UF de300 kDa, avec l'application d'un champ électrique. Cependant, la différence de rétentiondes deux solutés était relativement faible : 59% pour la BSA et 97,5% pour l'IgG. Lentschet al. (1993) ont étudié, quant à eux, un mélange BSA et polyéthylène glycol (PEG; 20 000Da) en électro-ultrafiltation. Ces auteurs ont observé que, sous l'effet d'un champélectrique (anode côté rétentat), la BSA chargée négativement à pH 6,8 était repoussée de lamembrane alors que le PEG neutre était attiré vers la membrane. La migration sélective dessolutés sous l'effet d'un champ électrique a permis d'augmenter la transmission du PEGalors que la rétention de la BSA a été améliorée. Malgré le nombre restreint d'études sur lepotentiel de séparation de l'électrofiltration de mélanges de protéines, les résultats obtenussuggèrent la possibilité de fractionner des protéines en combinant des différences de tailleet de charge nette en filtration assistée d'un champ électrique.

47Chapitre 3 But, hypothèses et objectifsEn raison de ses nombreuses activités biologiques, la LF suscite un intérêt majeur quant àson utilisation comme ingrédient nutraceutique. Cependant, cette protéine se retrouve àl'état dilué dans le lait (0,02-0,3 g.L" 1 ) et une purification s'impose. Le fractionnement de laLF à l'échelle industrielle s'effectue par chromatographie d'échange cationique. Cettetechnique se base sur les propriétés de charges distinctives de la LF par rapport aux autresprotéines que l'on retrouve dans le lait ou le lactosérum. Par contre, plusieurs inconvénientssont liés à ce mode de production, dont son coût d'opération élevé, ce qui justifie larecherche de solutions plus économiques et mieux adaptées à l'industrie laitière. Le but dece projet était de développer une nouvelle approche de fractionnement de la LF bovine parprocédé électromembranaire, soit en appliquant un champ électrique en cours de filtration.Cette nouvelle approche supposait que nous puissions mettre à profit le caractère cationiquede la protéine à pH 7.0, où les protéines majeures du lactosérum sont chargéesnégativement, ce qui nous permettait de l'attirer de façon sélective vers la cathode. Laproblématique de recherche sous-jacente à nos travaux a été formulée en deux voletsprincipaux, soit :Volet I Caractérisation de l'agrégation thermique de la LF et de ses interactions avecles autres protéines lors du chauffage du lait.L'état de la LF dans le lait (saturation en fer, interactions avec les autres constituants,agrégation) est mal connu. Or, l'utilisation de membranes pour la séparation de n'importequel composé présuppose que ce dernier ne soit pas en interaction avec d'autres espèces ensolution. Il a été proposé que les traitements thermiques appliqués au cours des opérationsde traitement du lait pouvaient induire une dénaturation irréversible de la protéine etmodifier son état d'association. Par ailleurs, plusieurs études ont porté sur l'effet du niveaude saturation en fer de la LF sur sa susceptibilité à la dénaturation thermique. En fixant le

4

49pour sa séparation en électrofiltration. Ce second volet visait à démontrer le potentiel dePélectrofiltration, qui combine la taille et la charge électrique comme facteurs deséparation, pour le fractionnement de la LF en présence de protéines du lactosérum.L'hypothèse de recherche proposée pour ce volet de recherche était:« L'application d'un champ électrique permet d'améliorer la sélectivité d'un procédéconventionel de microfiltration pour la séparation de la LF à partir d'un mélange deprotéines de lactosérum en combinant les transports convectif et électrophorétique desprotéines »Les objectifs définis pour vérifier cette deuxième hypothèse étaient :Objectif 3 : Évaluer l'influence des paramètres du champ électrique (force etpolarité) sur la sélectivité du fractionnement de la LF en présence deprotéines du lactosérum.Objectif 4 : Étudier l'impact du niveau de saturation en fer de la LF sur satransmission en électrofiltration en présence de protéines du lactosérum.Les chapitres 4, 5 et 6 présentent les résultats des travaux effectués au cours de cette thèse.Le chapitre 4 traite du premier objectif visant à déterminer l'effet du niveau de saturationen fer de la LF sur son mécanisme d'agrégation thermique à pH neutre. Le chapitre 5 metl'accent sur les résultats de l'objectif 2 portant sur l'influence des traitements thermiques dulait sur la récupération de la LF dans le lactosérum issu de la coagulation présure. Lechapitre 6 présente l'ensemble des travaux réalisés dans le cadre du volet 2 qui consistait àdéterminer le potentiel du fractionnement de la LF en présence de protéines du lactosérumpar électrofiltration (objectifs 3 et 4).

50Chapitre 4 Agrégation thermique de la lactoferrinebovine à pH neutre : effet du niveau de saturation en fer« Heat-induced aggregation of bovine lactoferrin : effect of ironsaturation »L'objectif de ce chapitre était d'étudier l'impact du niveau de saturation en fer de la LF surles diverses interactions impliquées lors de son agrégation thermique à pH neutre. Lesrésultats obtenus ont permis de proposer un mécanisme général pour l'agrégation thermiquede cette protéine à pH neutre.

514.1 RésuméCette étude avait pour but de caractériser l'effet de la saturation en fer de la lactoferrinebovine (LF) sur son agrégation thermique à pH neutre. Les résultats démontrent que lasaturation en fer augmente de façon importante la stabilité thermique de la LF et diminueainsi sa susceptibilité à l'agrégation. Lorsque chauffée à température inférieure à 80°C,l'holo-LF forme des polymères solubles, alors que l'apo-LF et la LF native forment desagrégats insolubles. L'agrégation thermique de l'holo-LF s'effectue essentiellement via desinteractions non-covalentes, tandis que des interactions thiol/disulfure intermoléculairessont observées seulement à partir de 80°C. Pour l'apo-LF et la LF native, les interactionsthiol/disulfure intermoléculaires sont plus importantes. Ce résultat suggère que des thiolslibres seraient générés au cours du chauffage de la protéine. Ces derniers initieraient lesréactions menant à la formation de liens intermoléculaires covalents. La fixation du fer parla LF contribuerait à maintenir l'intégrité de ses ponts disulfures, ce qui la protégeraitcontre l'agrégation thermique. De plus, nous avons observé que l'apo-LF, traitéethermiquement en présence de N-éthylmaléimide, forme de larges agrégats qui sontassociés uniquement par des interactions non-covalentes et ce, malgré l'inhibition desinteractions intermoléculaires par des ponts disulfures. Un mécanisme pour l'agrégationthermique de la LF en fonction de son degré de saturation en fer est proposé.

524.2 AbstractThe goal of our study was to characterize the effect of iron saturation on the thermalaggregation of lactoferrin (LF). Iron saturation markedly increased the thermal stability ofLF and decreased aggregation. Heating holo-LF at 80°C led to soluble polymer formationwhereas apo and native LF associated into large insoluble aggregates. The thermalaggregation of holo-LF was mainly driven by non-covalent interactions, withintermolecular thiol/disulphide reactions also observed above 80°C. For apo and native LF,intermolecular thiol/disulphide reactions increased, suggesting that free thiol residuesinitiated cross-linking reactions and that iron saturation contributed to maintaining LFdisulphide bond integrity and protecting the protein from aggregation. We demonstratedthat apo-LF in the présence of N-ethylmaleimide (NEM) could undergo large aggregateformation through non-covalent interactions without the participation of intermoleculardisulphide links. A mechanism for the thermal aggregation of LF is proposed, emphasizingthe influence of iron saturation.

534.3 IntroductionLactoferrin (LF) is an 80 kDa iron-binding glycoprotein of the transferrin familyprésent in various extemal sécrétions of mammals such as milk. Bovine milk contains 0.02to 0.2 g L" 1 of LF, which is only partly saturated with iron (15-20%) (Steijns & vanHooijdonk, 2000). LF consists of a single, 689-amino-acid polypeptide chain with 17intramolecular disulphide bonds (S-S) but no free cysteine (Cys) residues (Pierce et al.,1991). LF also has an isoelectric point between 8.0 and 9.0 (Shimazaki et al., 1993). Theprotein is folded into two homologous globular lobes connected by a short a-helix peptide.Each lobe is subdivided into two domains with the ability to reversibly bind a ferrie ion(Fe 3+ ) in coordination with a carbonate ion (CO3 2 ") within a deep cleft between theinterdomain (Anderson et al., 1989; Baker et al., 2002; Moore et al., 1997). The two lobesof the protein are locked in a closed state in the iron-loaded form (holo-LF) whereas, in theiron-depleted form (apo-LF), the N lobe adopts an open conformation while both the closedand open conformations hâve been observed for the C terminal lobe (Anderson et al., 1990;Baker et al., 2002; Jameson et al., 1998).Various biological properties hâve been reported for LF, including antimicrobial, antiinflammatory,antitumour, immuno-modulatory and enzymatic activities (Brock, 2002).Thèse attractive functions of LF hâve increased interest for its use as a natural bioactiveingrédient in food and health products. LF is currently extracted on an industrial scale fromskim milk and cheese whey by ion exchange chromatography (Tomita et al., 2002).However, the heat treatments used in milk processing, cheesemaking and proteinmanufacturing might irreversibly alter the conformation of the protein and resuit in a lowerrecovery and/or loss of activity (Smithers et al., 1996).The thermal stability of LF has been studied extensively using a wide range oftechniques (Abe et al., 1991; Elagamy, 2000; Kawakami et al., 1992; Kussendrager, 1994;

54Luf & Rosner, 1997; Oria et al, 1993; Paulson & Visser, 1992; Paulson et al, 1993;Ruegg et al., 1977; Sanchez et al., 1992). Differential scanning calorimetry (DSC) studies(Kussendrager, 1994; Paulson & Visser, 1992; Paulson et al., 1993; Ruegg et al., 1977;Sanchez et al., 1992) hâve shown that the thermal résistance of LF to unfolding increaseswith iron saturation. Two thermal transitions hâve been observed for native LF(Kussendrager, 1994; Paulson et al., 1993). The first transition (65°C) corresponds to theapo-LF form and the second (90-92°C) to the holo-LF form. Conflicting results hâve beenreported on the effect of pH on LF heat stability. DSC thermal unfolding studies suggestedthat LF is more sensitive at acidic pH (Kussendrager, 1994; Paulson & Visser, 1992). Incontrast, Abe et al. (1991) reported that LF is more thermo-resistant at acidic pH whereasturbidity and sometimes gelation were observed upon heating at neutral and alkaline pH.Kawakami et al. (1992) also showed that LF aggregation increases with ionic strength.Sanchez et al. (1992) and Luf et al. (1997) reported that high-temperature short-time(HTST) pasteurisation (72°C for 16 s) commonly used in the fluid milk industry has alimited effect on LF denaturation. However, Paulson et al. (1993) showed that HTSTpasteurisation affects the lower unfolding transition of native LF. Thermal unfolding of LFhas been reported to occur faster in the présence of whey proteins (Kussendrager, 1994;Paulson & Visser, 1992; Sanchez et al., 1992). Moreover, both pressure and thermaltreatments hâve been reported to induce LF aggregation in whey protein concentratesolutions (Patel et al., 2004) and raw milk (Nabhan et al, 2004).Despite the existing data on LF denaturation, little is known about the mechanisminvolved in thermal aggregation. The goal of this work was to study the effect of ironsaturation on the thermal aggregation process of LF at neutral pH and low ionic strength.Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and highperformance size-exclusion chromatography (HPSEC) analyses were performed to comparethe aggregation behaviour of the différent iron forms. We also studied possiblethiol/disulphide (SH/S-S) interchange reactions involved in the aggregation process duringheating.

554.4 Materials and methods4.4.1 Isolation of LFLF in its native state (native LF) was purified from raw skim milk by cation-exchangechromatography (Uchida et al., 1996). The raw milk (Laiterie Mont St-Hilaire, ParmalatCanada, St-Hyacinthe, Que., Canada) was skimmed at 37°C using a pilot scale centrifugalseparator (Westfalia, type LWA-205, Englewood, NJ), then refrigerated and kept at 4°C,before being passed through an SP Sepharose Big Beads resin (Amersham PharmaciaBiotech, Baie d'Urfé, Que., Canada) column. The column was eluted in two steps using 50mM phosphate (KH 2 PO 4 /Na2HPO4) containing 0.4 M NaCl at pH 6.8, and 50 mMphosphate containing 0.7 M NaCl at pH 6.8 (LF fraction). The LF fraction was extensivelydialysed against Milli-Q water (4°C) before being freeze-dried.4.4.2 Modification of LF iron saturationIron-depleted apo-LF was obtained according to the method of (Mazurier & Spik, 1980).Briefly, the purified native LF was dissolved (1% protein, w/v) in 1.05 M aceticacid/sodium acétate buffer (ionic strength = 0.2), pH 4.0, containing 40 mM EDTA and 0.2M sodium phosphate and allowed to equilibrate at 4°C overnight. The solution was thendialysed against Milli-Q water for 3 d at 4°C and freeze-dried. Holo-LF was prepared bydissolving LF (1% protein, w/v) in 10 mM Tris-Ci buffer containing 75 mM NaCl, pH 7.2.This solution was then mixed with a freshly prepared FeNTA solution (9.9 mM Fe(NÛ3)3and 8.5 mM nitrilotriacetic acid (NTA) in water adjusted to pH 7.0 with solid sodiumbicarbonate (NaHCC^). The volume proportion of the solutions was adjusted to achieve afour-fold iron to LF molar ratio (van Berkel et al., 1995). Excess of iron was removed bycontinuous diafiltration with a spiral-wound ultrafiltration (UF) cartridge (S1Y30, 30 kDa,

56Amicon, Beverly, MA, USA) and then freeze-dried. The percent of LF iron saturation wasestimated by spectrophotometric analysis using absorbances at 280 and 465 nm(Hashizume et al., 1987). The protein content was measured on a LECO FP-528nitrogen/protein analyser (LECO, St. Joseph, MI, USA) based on a standard method (IDF,2002). LF purity was determined by reverse-phase HPLC (RP-HPLC) according to themethod of Palmano and Elgar (2002). The characteristics of the LF préparations aresummarized in Table 4.1.Tableau 4.1 Some physico-chemical properties of the LF iron préparationsLFProteinLF PurityIron SaturationApo(%)94.0(% of total protein)92.4(%)4,6Native83.193.819.2Holo88.491.71004.4.3 Sample préparation and heat treatmentsThe LF samples were dissolved at a protein concentration of 0.5%, w/v, in phosphatebuffer (10 mM sodium phosphate, pH 7.0) and stirred for 1 h. In some experiments, N-ethylmaleimide (NEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was added (50 uL of a 0.34M solution) to achieve a 20-fold molar excess ratio of thiol-blocking agent to LF Cysgroups, and mixed for 1 h prior to heating. Aliquots (0.4 mL) of sample solution weretransferred into thin-walled glass tubes (0.75 mL, 50 mm long x 6 mm o.d.) (VWR,Mississauga, ON, Canada), which were sealed with Teflon® tape and heated in a water bathat températures ranging from 50 to 90°C for 5 min. Heated samples were then rapidly

57cooled in ice water to room température. Heating experiments were performed in triplicate,except for NEM treatments which were carried out in duplicate.4.4.4 HPSEC analysisAfter cooling, the tubes were centrifuged at 10,000 g for 10 min to separate insolubleprotein aggregates. Aliquots of the supernatant (100 uL) were removed and analyzed byHPSEC using a TSK G3000 PW XL column (300 mm long x 7.8 mm i.d.) (TosoHaas,Montgomeryville, PA, USA). The column separated proteins with molecular massesranging from 0.5 to 800 kDa. The void volume eluted at 6.75 min as determinedexperimentally using blue dextran (2,000 kDa); (Sigma-Aldrich). The column wasequilibrated with phosphate buffer (50 mM, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN 3 , pH 7.0) at a flowrate of 0.8 mL min" 1 and was kept at 25°C. Analyses were performed using an HPLCSystem from Waters (Milford, MA, USA) equipped with two pumps (model 600E), a UVvisibledetector (model 486) set at 280 nm and an automatic injector (Hewlett-Packardséries 1100, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Data acquisition and analysiswere performed using Millennium 2.1 chromatographic software (Waters). The molecularweight (MW) markers were bovine thyroglobulin (660 kDa), apoferritin (443 kDa), (îamylase(200 kDa), alcohol dehydrogenase (150 kDa), bovine sérum albumin (66 kDa),carbonic anhydrase (29 kDa) and cytochrome C (12.4 kDa) (Sigma-Aldrich). Thepercentage of residual monomeric LF was determined from the ratio of the area of the LFmonomeric peak (mAU*s) of the heated samples and the area of the LF monomeric peak ofthe unheated control samples (% LF/LFo).4.4.5 SDS-PAGE analysisThe protein samples were analysed by SDS-PAGE under reducing and non-reducingconditions according to Laemmli (1970). The heated samples were extensively

58homogenised and aliquots (5 uL) were taken and diluted 1:20 with the appropriate samplebuffer. Samples (10 uL) were loaded on 10% gels (1.5 mm thick) for both SDS-PAGEconditions. The electrophoresis was performed with a Mini-Protean III electrophoresis cellSystem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). The gels were stained usingCoomassie Brilliant Blue R-250. The MW markers were myosin (201.1 kDa), p-galactosidase (115.7 kDa), BSA (93.6 kDa), ovalbumin (50.4 kDa), carbonic anhydrase(37.4 kDa), soybean trypsin inhibitor (29.0 kDa), lysozyme (19.4 kDa) and aprotinin (6.9kDa), ail from Bio-Rad Laboratories.4.5 Results4.5.1 Changes in the LF molecular weight profilesThe degree of thermal aggregation of the différent LF préparations was assessed byHPSEC. The heated samples were centrifuged to remove the insoluble protein fractions.HPSEC analysis of the soluble protein fraction resolved larger protein polymers from themonomeric protein. The thermal behaviours of the various iron forms of LF are shown inFigure 4.1. At low ionic strength and neutral pH, thermal aggregation of the différentprotein préparations began at 60°C for apo-LF, 65°C for native-LF and 70°C for holo-LF.Those températures correspond approximately to the first unfolding transition of each ironstate (Kussendrager, 1994; Paulson et al., 1993; Ruegg et al., 1977; Sanchez et al., 1992).At higher températures, the monomeric protein content of the apo and native-LF formsdecreased markedly compared to the more stable holo form. Native-LF had a slightlyhigher thermal stability than the apo protein, which could be attributed to partial ironsaturation of the native protein (Table 4.1). In the température range studied, the ironsaturatedportion of native-LF remains almost unaffected (Kussendrager, 1994; Paulson et

59al., 1993). At the highest température (90°C), less than 5% of monomeric proteins weredetected in the iron-LF préparations.50 60 65 70 80Température (°C)90Figure 4.1 Effect of iron saturation on the percent of residual monomeric lactoferrin(LF), (%LF/LFo) in the holo-LF (black), native LF (grey) and apo-LF (white) solutions(0.5% protein, w/v, in 10 mM phosphate buffer, pH 7.0) heated at différent températures (5min) and analysed by high performance size-exclusion chromatography (HPSEC). Errorbars represent standard déviation of triplicates. LFo represent the unheated control sample.Typical UV absorption profiles of the soluble fractions obtained with heat-treated nativeand holo-LF are presented in Figure 4.2. The HPSEC profiles of unheated samples hâve amajor peak corresponding to the monomeric proteins of both iron forms. Accurateestimation of the MW of the monomeric peak of the différent LF iron forms was notpossible with the HPSEC method. According to our column calibration curve, the apparentMW values were lower than the theoretical LF MW value (80 kDa). Lower apparent MWvalues hâve previously been observed for LF using HPSEC and may arise from stronginteractions between the protein and the column packing material (Lampreave et al., 1990).The elution profiles of the unheated samples for each iron préparation showed the présenceof minor components with a faint shoulder on the right side of the monomeric LF peak(rétention time around 11 min) and another small peak eluting at 12 min. Although they

60were not formally identified, thèse minor contaminants were apparently not involved in theaggregation process since the respective areas of thèse peaks remained almost constant inthe température range tested. As seen in Figure 4.2A, the area under the peak of themonomeric native-LF sample decreased with increasing température and large insolubleprotein aggregates were formed. Similar changes were observed for apo-LF (results notshown).However, the HPSEC profiles of holo-LF treated at 70°C and above (Fig. 4.2B) hadanother peak eluting near the void volume (MW> 800 kDa) of the column, whichcorresponded to soluble oligomers of holo-LF. The intensity of this peak increased withtempérature. Moreover, holo-LF précipitation was only observed upon centrifugation ofsolutions heated above 80°C. This resuit illustrâtes that iron-binding had an effect on thetype of aggregates formed upon heating.

6180°C-i 1 1 1 1 1 r1 2 3 4 5 6 7T 1 1 1 1 1 1 1 1 1 119 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Time (min)60°CControlB60°C1 2 3 4 5 6 ! 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Time (min)Figure 4.2 Typical HPSEC profiles of unheated (Control) and heated samples (60°C,65°C, 70°C, 80°C/5 min) of native-LF (A) and holo-LF (B) (0.5% protein [w/v] in 10 mMphosphate buffer, pH 7.0).

62Figure 4.3 shows the effect of the heat treatment (70°C for 5 min) in the présence of excessof NEM on the HPSEC profiles for the différent LF iron forais. Heating holo-LF in theprésence of NEM (Fig. 4.3 A) résultée in an HPSEC profile with three peaks. The first peak(1) corresponded to soluble polymers that elute near the void volume, whereas the secondpeak (2) corresponded to the monomeric protein. The third peak (3) corresponded to theunreacted excess of NEM, as confirmed by the elution profile of NEM-containing buffer(data not shown). The NEM peak overlapped the previously mentioned minor contaminantpeaks. The lower amount of monomer detected in the présence of NEM was due to thedilution effect of the NEM solution added to the sample (50 uL). Heating native-LF inprésence of excess NEM inhibited the formation of a precipitate, suggesting that theassociation of the protein polymers into larger insoluble aggregates depended mainly onintermolecular SH/S-S reactions. Instead, soluble polymers were formed (Fig. 4.3B),indicating that non-covalent links were also involved during native-LF aggregation.Heating apo-LF in the présence of NEM did not prevent thermal aggregation (Fig. 4.3C).

63I81 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Time (min)Figure 4.3 Typical high performance size-exclusion chromatography (HPSEC) profilesof unheated (control) and heated samples (60°C, 65°C, 70°C, 80°C for 5 min) of nativelactoferrin (LF) (A) and holo-LF (B) (0.5% protein, w/v, in 10 mM phosphate buffer, pH7.0). Peak (1) soluble aggregates, (2) monomeric Lf, (3) NEM and minor contaminants.4.5.2 Changes in the SDS-PAGE profilesHeated samples were submitted to SDS-PAGE analysis under non-reducing and reducing(Fig. 4.4) conditions to further characterise the nature of the intermolecular links involvedin the aggregation of the différent iron forms of LF. Under non-reducing conditions, asingle band was found for the unheated control samples that corresponded to themonomeric form of each iron state. For apo-LF (Fig. 4.4A), a progressive drop in theintensity of the monomeric protein bands occurred as the température increased. Asimultaneous increase in lower mobility protein material was observed in the stacking gel.

64Thèse bands were associated with covalently bonded LF aggregate species. The last band ofthe non-reducing SDS-PAGE gel corresponded to the LF sample heated in the présence ofan excess of NEM. The NEM inhibited the formation of aggregates by intermolecularSH/S-S interchanges. The shift from monomeric LF to large aggregates proceeded lessrapidly for the native protein (Fig. 4.4B). In the case of holo-LF (Fig. 4.4C), the aggregateband was only observed at 80°C. The soluble polymers observed at 70°C in thecorresponding HPSEC profile (Fig. 4.3A) were not présent in the non-reducing SDS gel.This suggests that the thermal association of holo-LF might first involve non-covalentinteractions between protein molécules, which are broken in the présence of SDS.Furthermore, when the différent LF iron samples heated at 80°C were submitted to SDS-PAGE under reducing conditions (Fig. 4.4), the aggregates dissociated into monomeric LFbands, indicating that they were covalently linked.

NRRBNRNRRC60 70 80 NC60 70 80 NLargeaggregatesLF -*Std(kDa) v T' Large- 201-ne~ 94- 50&aggregatesLFLargeaggregatesLF ->29Figure 4.4 Typical non-reducing (NR) and reducing (R) SDS-PAGE patterns (10% T) of samples of apo-lactoferrin (apo-LF) (A),native LF (B) and holo-LF (C) solutions (0.5% protein, w/v, in phosphate buffer, pH 7.0) unheated (control C) and heated at 60°C,70°C and 80°C for 5 min. N = LF samples heated at 70°C in the présence of an excess of N-ethylmaleimide (NEM) for 5 min.

664.6 DiscussionIn this study, a combination of HPSEC and electrophoretic methods were used to study theeffect of iron saturation on LF thermal aggregation. It has been demonstrated in previousstudies using DSC, that iron binding markedly increases the thermal stability of LF(Kussendrager, 1994; Paulson et al., 1993; Ruegg et al, 1977; Sanchez et al., 1992). Theincrease in thermal stability has been attributed to the more compact conformation adoptedby holo-LF by binding a ferrie ion in the interdomain cleft of each lobe. The stabilisingeffect of iron on LF thermal aggregation we observed is thus in agreement with previousstudies. Our HPSEC data also highlighted major changes in the polymers formed duringheating, depending upon the iron state of LF. Heating holo-LF to under 80°C inducedsoluble polymer formation, whereas large insoluble aggregates were observed for both apoand native-LF (Fig. 4.2). This effect may be due to the higher thermal unfolding rate ofapo-LF and the partly iron saturated native state compared to the holo protein(Kussendrager, 1994). The fact that the two lobes of the protein are closed in the holo statemight hâve masked potential interactive sites buried within the interdomains of both lobesof the protein. However, the HPSEC pattern of the 19% iron-saturated native-LF did notdisplay a thermal aggregation behaviour that combines both the one observed for its apopart and holo counterpart as no holo-LF related soluble aggregates were observed.Moreover, the partly iron-saturated native-LF is a mixture composed of apo-LF, holo-LFbut also possibly of monoferric LF species saturated at either their N or C lobe. Theprésence of monoferric species in the native-LF préparation has been previously observedin human LF (Makino and Nishimura 1992) and buffalo LF (Kumar and Bhatia, 1988).Thus, their respective individual behaviour in the native-LF mixture might hâve beenaffected by the présence of the more labile iron forms such as the apo-LF that promotedtheir co-precipitation.We also observed that the addition of NEM prior to heating native-LF favoured solublepolymer formation at the expense of larger aggregates (Fig. 4.3B). Thus, intermolecular

67SH/S-S reactions likely contributed to larger polymer associations. Heat-treatment of LFalso likely led to the cleavage of intramolecular S-S, resulting in the exposure of freereactive SH groups. In the présence of NEM, the SH were blocked, inhibiting SH/S-Sinterchanges and the build-up of larger insoluble aggregates. However, this effect was notobserved when apo-LF was heated in the présence of NEM (Fig. 4.3C). Insolubleaggregates were formed and no soluble polymers were detected (Fig. 4.3C). The SDS-PAGE analysis (Fig. 4.4) revealed that thèse aggregates were non-covalently linked. Thisresuit suggests that in the more heat sensitive apo-state (Fig. 4.3A), the protein denaturedmore readily increasing the occurrence of intramolecular S-S cleavages. Thus, the probablymore unfolded structure of apo-LF increased the exposure of non-covalent sites normallyburied in the core of both lobes of the protein favouring intermolecular interactions and theformation of insoluble aggregates.Protein aggregation through intermolecular disulphide cross-links normally occurs via SHoxidatio (S-S formation) or intermolecular SH/S-S interchange reactions that are initiatedby the présence of free SH groups. As previously mentioned, LF does not hâve free SHgroups. Nevertheless, heat-induced changes to LF may be related to those observed for a-lactalbumin (a-LA), a calcium metallo-protein (Hiraoka et al, 1980; Vanaman et al., 1970)that also possesses 4 intramolecular S-S and no free Cys (Hiraoka et al., 1980; Vanaman etal., 1970). Heating a-LA above 85°C induces the formation of disulphide-linked polymers(Chaplin & Lyster, 1986; Hong & Creamer, 2002; McGuffey et al., 2005). The a-LAprotein may undergo intramolecular S-S bond cleavage upon heating, exposing free SH thatinitiate SH/S-S interchange reactions resulting in the formation of polymers and largeraggregates (Hong & Creamer, 2002; McGuffey et al., 2005). According to Hong andCreamer (2002), the apo protein is more reactive than the holo form. The thermal behaviourof LF observed in our study showed some similarity with a-LA, especially with regards tothe stabilising effect of métal binding on intramolecular S-S bond cleavage. Moreover, weshowed that LF intermolecular S-S did not form upon heating in the présence of NEM. Thisresuit supports our hypothesis that free SH residues were available to catalyseintermolecular SH/S-S reactions. The formation of larger insoluble aggregates seemed to

68dépend upon the accessibility of free SH groups arising from intramolecular S-S cleavages,which, in turn, were affected by the iron saturation of LF. For the more heat-sensitive apoand native-LF, free SH residues seemed to be more accessible, and the non-covalentlylinked soluble polymers formed in the early stages of aggregation associated rapidly toform insoluble aggregates by intermolecular S-S linkages. We also observed that the apostate could associate into large insoluble polymers by non-covalent interactions without theparticipation of intermolecular S-S cross-links. The more heat-sensitive apo-LF probablyexposed sites normally buried inside the molécule that increase protein association. In itsiron-saturated conformation, the protein is more compact and the binding of the ferrie ioncontributes to maintaining the structure and disulphide bonding integrity.Figure 4.5 summarises the mechanisms proposed for the thermal aggregation of LF. Duringthe early stage, a first thermal transition allows the formation of non-covalently linkedsoluble oligomers. Thereafter, the oligomers associate into larger insoluble aggregatesthrough intermolecular SH/S-S reactions and non-covalent interactions. The extent of thèseinteractions dépends on LF iron saturation. In our expérimental conditions, the more heatsensitiveapo-LF denatured readily at ~60°C to expose non-covalent interaction sites andform non-covalent oligomers that underwent large polymer associations via non-covalentand covalent disulphide interactions (Fig. 4.5A). For holo-LF (Fig. 4.5B) the binding ofiron stabilised the protein structure and helped to maintain its S-S bond integrity up to80°C. As a resuit, holo-LF formed essentially non-covalently linked soluble polymerswhereas higher températures were required to initiate intermolecular SH/S-S cross-linkingreactions.

69LF -• Oligomers Large aggregates~60°C•>Non-covalent~60°C-•Intermolecular disulfideApo-LF•>Non-covalent (buried sites)B• Non-covalent80°C• Intermolecular disulfideHolo-LF~90°C•>Non-covalent (buried sites)Figure 4.5 General mechanism proposed for the thermal aggregation of apo-lactoferrin(apo-LF) (A) and holo-LF (B) (see text for détails).4.7 ConclusionOur study showed that the aggregation of LF dépends on iron saturation. Apo-LF andnative-LF were more heat sensitive and formed large insoluble aggregates. Conversely, ironsaturation increased the stability of holo-LF, resulting in less aggregation and more soiubleprotein polymers. The more compact conformation of holo-LF prevented it fromaggregating when heated. It appears that LF aggregation proceeded via a combination ofnon-covalent interactions and intermolecular SH/S-S reactions that did not require free SHresidues. Iron saturation also stabilised LF intramolecular S-S bond integrity at higher

70températures. Thermal aggregation of the more stable holo-LF first involved non-covalentinteractions between protein molécules. At higher températures, intramolecular S-S bondcleavage also occurred and free SH catalysed intermolecular SH/S-S reactions. Furtherwork is needed to understand the effect of other physicochemical conditions such as pH,ionic strength and concentration.4.8 AknowledgementsThis work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Council(NSERC), the Fonds Québécois de Recherche sur la Nature et les Technologies (FQRNT)Novalait Inc., and the Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation duQuébec (MAPAQ). We thank Louis-Philippe Desmarchais for the assistance duringlactoferrin isolation.

71Chapitre 5 Effet du niveau de saturation en fer sur larécupération de la lactoferrine dans le lactosérum issu dela coagulation présure de lait écrémé chauffé« Effect of iron saturation on lactoferrin recovery in rennet wheyfront heat treated skim milk »Les résultats du chapitre 4 ont permis de mettre en évidence l'importance du niveau desaturation en fer sur l'agrégation thermique de la LF. Les résultats ont démontré quel'agrégation thermique des formes apo et partiellement saturée de la LF s'effectue via unecombinaison d'interactions non-covalentes et covalentes (réactions d'échangethiol/disulfure intermoléculaires) qui favorise la formation rapide d'agrégats insolubles. Lafixation du fer par la protéine stabilise sa structure, particulièrement ses ponts disulfures,inhibant ainsi les réactions d'échanges thiol/disulfure intermoléculaires et favorisant laformation de polymères solubles maintenus par des liens non-coavalents. Par contre, cesrésultats se limitent aux conditions d'un système tamponné à pH neutre. Les travaux reliésau présent chapitre correspondent au deuxième objectif du volet 1. Le but était de vérifier lecomportement à la chaleur de la LF dans le lait écrémé afin de vérifier l'influence de lafixation du fer sur les interactions avec les autres protéines du lait et l'impact de cesinteractions sur sa récupération dans le lactosérum obtenu par coagulation du lait à laprésure.

725.1 RésuméLe but de cette étude était de déterminer l'effet des traitements thermiques du lait sur larécupération de la lactoferrine (LF) dans le lactosérum obtenu à partir de la coagulation dulait à la présure. Cette étude visait également à déterminer l'impact du niveau de saturationen fer de la protéine sur sa stabilité dans le lait écrémé enrichi avec de la LF ayant diversniveaux de saturation en fer. Le pourcentage de récupération de la LF dans la fraction dulactosérum a été déterminé par chromatographie liquide haute-performance en phaseinverse. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfateen une et deux dimensions a aussi été effectuée sur les caillés présures pour caractériser lesinteractions impliquant la LF au cours du chauffage du lait. Les résultats démontrent que lepourcentage de récupération de la LF dans le lactosérum diminue rapidement à partir de60°C (88%) jusqu'à 75°C (0%). Le niveau de saturation en fer contribue à augmenter lastabilité de la protéine et à améliorer son pourcentage de récupération dans le lactosérum.L'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide a permis de démontrer quel'association de la LF dans les caillés de lait non-chauffé implique des interactions noncovalentesalors que des interactions covalentes de type ponts disulfures intermoléculairessont aussi impliquées dans les caillés de lait chauffé. Selon l'intensité du traitementthermique, la LF forme des agrégats avec d'autres protéines possédant des cystéines tellesque la p-lactoglobuline, l'a-lactalbumine, la K-caséine, la a S 2-caséine et la K-caséine, viades réactions d'échange thiol/disulfure intermoléculaires. Ces interactions covalentes etnon-covalentes expliquent la plus faible récupération de la LF obtenue à partir de lacoagulation présure du lait chauffé.

735.2 AbstractThe aim of this study was to détermine the effect of heat treatments on the recovery oflactoferrin (LF) in whey from rennet coagulated skim milk. The impact of LF ironsaturation was also assessed using skim milk spiked with différent LF iron forms. Therecovery of LF in the rennet whey fraction was determined by reverse-phase highperformanceliquid chromatography. One and two dimensional sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis analyses were performed on rennet curds to characterisethe protein interactions involving LF in heated milk. The extent of LF recovered in thewhey fraction was found to decrease with increasing the heating température. The bindingof iron by LF improved its thermal stability and its recovery in the whey fraction.Polyacrylamide gel electrophoresis results showed that the association of LF in the rennetcurd of unheated milk involved non-covalent interactions while upon heating LF alsointeracted via intermolecular disulfide link. Depending on the severity of the heat treatment,LF aggregates with Cys containing proteins (P-lactoglobulin, a-lactalbumin, oc S 2-casein,and K-casein) occured via thiol/disulfide exchange reactions. Thèse non-covalent andcovalent interactions explained the lower recovery of LF in whey obtained from heatedmilk.

745.3 IntroductionLactoferrin (LF) is an iron-binding protein occurring in différent external sécrétionsincluding the milk of several species. The concentration of LF in bovine milk varies withthe lactation period and values between 0.02 and 0.2 g L' 1 hâve been reported (Steijns &van Hooijdonk, 2000). LF is a single polypeptide chain glycoprotein of about 80 kDa (689-amino-acids) that includes 17 intramolecular disulphide bonds (S-S) but no free cysteine(Cys) residues (Pierce et al., 1991). The protein folding consists into two globular lobeslinked by an a-helix peptide. Each lobe is subdivided into 2 domains that form a deeppocket within which a ferrie ion (Fe 3+ ) binds reversibly with a bicarbonate ion (CO3 2 ")(Moore et al, 1997). In bovine milk, LF is only partially saturated with iron (15-20%)(Steijns & van Hooijdonk, 2000). However, depending on the environmental conditions,the protein could adopt an iron-free form (apo-LF), or an iron-loaded form (holo-LF).Ward et al. (2005) recently discussed the various biological properties ascribed to LF thatincluded antimicrobial, anti-inflammatory, antitumour, immuno-modulatory and bonegrowth factor activities. The strong potential of LF as a natural bioactive ingrédient forfood and health products hâve stressed the development of suitable techniques for itsisolation from milk fluids. LF has a high isoelectric point (pi) between 8.0 and 9.0(Shimazaki et al., 1993) and that distinct basic character allows its extraction from skimmilk or, more commonly, from cheese whey by cation-exchange chromatography.Nowadays, LF isolâtes of high purity are available commercially. However, the heattreatment of milk before cheesemaking might dénature the protein and reduce its recoveryin whey (Smithers et al., 1996).The résistance of LF to thermal denaturation dépends on its iron saturation as the morecompact conformation of the holo-LF improves its heat stability compared to the moreopen apo form (Kussendrager, 1994; Paulson et al., 1993; Sanchez et al., 1992). Sanchez et

75al. (1992) also suggested that HTST pasteurization (72°C/15 s) generally used in the fluidmilk industry has a limited effect on LF denaturation. However, Paulson et al. (1993)reported that HTST pasteurization affected the lower unfolding transition of native LF,whereas UHT treatment led to a complète denaturation of the protein.It was recently observed that the LF thermal aggregation process implied intermolecularthiol/disulphide (SH/S-S) interchange reactions (Brisson et al.). Thèse reactions areinitiated by free thiols (SH) likely generated from intramolecular S-S cleavages as LF doesnot possess free Cys residues. The binding of iron was shown to increase LF disulphidebond integrity. The thermal stability of LF has also been studied in more complex Systemswhere it was found that the denaturation rate of LF increases in the présence of wheyproteins (Kussendrager, 1994; Sanchez et al., 1992). Moreover, combined pressure and heattreatments (HTST pasteurization and UHT treatment) also seem to induce LF aggregationin whey protein concentrate solutions (Patel et al., 2004) and raw milk (Nabhan et al., 2004;Patel et al., 2006). The présence of LF in sérum protein aggregates from heatedreconstituted skim milk (90°C for 10 min) has also been reported (Jean et al., 2006). Inthose cases, the thermal association of LF with other proteins was thought to involveintermolecular disulphide bridges and thèse interactions might impair LF recovery incheese whey. However, a récent study suggested that the level of LF recovered in cheesewhey dépends on the cheesemaking process rather than the HTST pasteurization treatmentof milk (Dupont et al, 2006).The aim of this study was to investigate the effect of iron saturation on the thermalassociation of LF in milk and the impact on its recovery in rennet whey. The experimentswere performed on heat treated skim milk and ultrafiltered milk samples spiked with eitherthe apo, native and holo-LF forms. One and two dimensional sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (1D and 2D-SDS-PAGE) analyses were used tocharacterize the nature of the interactions involved between LF and the other milk proteinsin cheese.

765.4 Materials and methods5.4.1 Purification of lactoferrinLF was isolated from raw skim milk by cation-exchange chromatography based on themethod of Uchida et al. (1996). The raw milk (Laiterie Mont St-Hilaire, Parmalat Canada,St-Hyacinthe, Que., Canada) was skimmed at 37°C using a pilot scale centrifugal separator(Westfalia, type LWA-205, Englewood, NJ). The skim milk was then refrigerated and keptat 4°C, before being passed through an SP Sepharose Big Beads resin (AmershamPharmacia Biotech, Baie d'Urfé, Que., Canada) column (Amersham Pharmacia Biotech,Baie d'Urfé, QC, Canada). LF fraction was eluted with a 2 steps elution consisting in 50mM phosphate (KH 2 PO4/Na 2 HPO 4 ) buffers at pH 6.8 containing respectively 0.4 M NaClto elute lactoperoxydase and 0.7 M NaCl to elute LF. The desorbed LF fraction was thenextensively dialysed against Milli-Q purifïed water (4°C) before being freeze-dried. Theisolated native LF will be referred as LF in this article.5.4.2 Modification of lactoferrin iron statusThe previously isolated LF was used as the starting material to prépare the LFs withmodified iron content. The apo-LF was prepared by the method of Mazurier and Spik(1980). The saturation of LF with iron was obtained with a freshly prepared FeNTAsolution (9.9 mM Fe(NÛ3)3 and 8.5 mM nitrilotriacetic acid (NTA) according to van Berkelet al. (1995). The excess of iron was removed by continuous diafiltration with a 30 kDamolecular weight cut-off spiral-wound ultrafiltration cartridge (Amicon, model S1Y30,Beverly, MA, USA) fitted to a bench top Amicon Ultrafiltration Cell (Amicon) and thenfreeze-dried. LF iron saturation status was estimated by the ratio of light absorbances at 280and 465 nm (Hashizume et al., 1987). The protein content was determined with a LECO

77FP-528 nitrogen/protein analyser (LECO, St. Joseph, MI, USA) based on a standardmethod (IDF, 2002) and the purity was assessed by RP-HPLC according to the method ofPalmano and Elgar (2002) as described below. The characteristics of the différent LF ironforms are reported in Table 5.1.Tableau 5.1the study.Physico-chemical characteristics of the différent LF iron préparations used inLFApo-LFLFHolo-LFProtein(%)94.083.188.4LF Purity(%of totalprotein)92.493.891.7Iron Saturation(%)4.619.21005.4.3 MilksupplyRaw skim milk was obtained from a local dairy farm. The milk was kept at 4°C beforebeing skimmed at 37°C using a pilot scale centrifugal separator (Westfalia, type LWA-205,Englewood, NJ, USA). Sodium azide was added (0.02%) to the raw skim milk to preventbacterial growth and the milk was stored at 4°C and used within 2 days.5.4.4 Sample préparation and heat treatmentsIn some experiments, raw skim milk was spiked with the différent LF iron forms at aprotein concentration of 0.25% (w/v) and stirred overnight at 4°C. Before thermaltreatments, ail milk samples (enriched and non-enriched controls) were allowed toequilibrate at room température (2 h.). Aliquots of milk samples (5.0 mL) were transferredinto polypropylene centrifuge tubes (17 mm of i.d. and 118 mm length) (VWR,

Mississauga, ON, Canada), screwed cap, and heated in a water bath at températures rangingfrom 60 to 80°C for 10 min. To decrease the heat-up time, the samples were placed in anethylene glycol bath set at 30°C over the target température and the milk température wasmonitored with a thermocouple. While coming near the targeted température (within 3°C),the sample tubes were rapidly transferred into the water bath and held at the desiredtempérature for the predetermined time (10 min). The times required to reach the targettempérature varied between 75 s and 135 s for the range of température studied. Heatedsamples were then rapidly cooled on ice water and then allowed to equilibrate to roomtempérature (2 h.).5.4.5 Rennet coagulation of milkThe heated milk samples were submitted to rennet coagulation to separate the wheyfraction from the colloïdal phase using the method described by Noh and Richardson(1989) with modifications. Briefly, before renneting, 50 uL of a 15% (w/v) CaCb solutionwas added to improve coagulation of the heated milk samples and stirred at roomtempérature for 60 min. The milk was then preheated at 30°C for 20 min and doublestrength rennet (Chymax, CHR Hansen, Milwaukee, WI, USA) diluted (1:10) in deionizedwater was added (5 uL). The milk samples were further incubated at 30°C until milkcoagulation (~30 min). The coagulated milks samples were eut and then cooked at 40°C for30 min. Whey was recovered by centrifugation at 3000G for 5 min. Rennet curds werewashed twice with deionized water made up approximately to 5 mL and then re-centrifugedat 3000G for 5 min.

795.4.6 Reverse-phase high-performance liquid chromatographyThe individual whey protein concentration in the whey fraction was determined by reversephase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) according to the method ofPalmano and Elgar (2002) using a 1 mL Resource RPC column (Amersham PharmaciaBiotech). Analyses were performed with a HPLC System from Waters (Milford, MA, USA)equipped with two pumps (model 600E), a UV-visible detector (model 486) set at 214 nmand an automatic injector (Hewlett-Packard séries 1100, Agilent Technologies, Palo Alto,CA, USA). Data acquisition and analysis were performed using the Millennium 2.1chromatographic software (Waters). The protein standards were glycomacropeptide (GMP),oc-lactalbumin (a-LA), LF, bovine sérum albumin (BSA), pMactoglobulin (P-LG), andimmunoglobulins (IgG) ail from Sigma (St. Louis, MO, USA). Before analysis, aliquots (1mL) of whey samples were transferred in microtube and centrifuged (16 000G for 3 min)before injection to remove the insoluble protein aggregates material. The percentage of LFrecovery was determined from the ratio of the concentration of LF in the whey fraction ofthe heated samples on the initial concentration (% [LF] W /[LF] O ). Since the HPLC methodused did not allow determining directly the endogenous LF content in milk, the initialconcentration obtained by HPLC analysis in the unheated whey was used as the initialréférence. The initial concentration in the unheated whey was also used as the initialréférence for the other whey proteins.5.4.7 One and two dimensionnal polyacrylamide gel electrophoresisOne dimensional and two dimensional (1D and 2D) SDS-PAGE were performed on theprecipitated curd samples. The precipitated rennet curds were dispersed based on themethod of Vasbinder et al. (2003). The rennet curd were dispersed in 50 mM Tris-HClbuffer pH 6.8 containing 5% SDS made-up to 5 mL. The samples were stirred overnight atroom température to allow their solubilization. After dispersion, the samples were further

80diluted in the SDS buffer at ratio of 1:10. In some samples, p-mercaptoethanol was added(1%, v/v) and then boiled for 4 min to reduce disulphide bonds. The protein samples werefirst analysed by 1D-SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions according tothe method of Laemmli (1970). Prior to electrophoresis, ail samples were diluted 1:2 with apremixed Laemmli sample buffer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Samples(20 uL) were loaded on 13.5% gels (1.5 mm thick) for both reducing and non-reducingSDS-PAGE conditions. The electrophoresis of the protein samples was performed with aMini-Protean III electrophoresis cell System (Bio-Rad Laboratories). The gels were stainedwith Coomassie Brilliant Blue R-250. The MW markers were myosin (201.1 kDa), p-galactosidase (115.7 kDa), BSA (93.6 kDa), ovalbumin (50.4 kDa), carbonic anhydrase(37.4 kDa), soybean trypsin inhibitor (29.0 kDa), lysozyme (19.4 kDa) and aprotinin (6.9kDa), ail from Bio-Rad Laboratories. On some samples, 2D-SDS-PAGE analysis wereperformed according to the technique developed by Havea et al. (1998). The fïrst nonreducingSDS-PAGE dimension was accomplished as described above. After the firstdimension electrophoresis, a sample gel strip was eut, reduced and submitted to a secondSDS-PAGE dimension to further characterize the interactions occurring in the rennet curd.5.5 Results and discussion5.5.1 Changes in protein recovery in wheyFigure 5.1 illustrâtes the effect of milk heating température on the recovery of lactoferrin inrennet whey obtained from skim milk. In our experiments the level of LF released in thewhey fraction of the unheated rennet skim milk (181 ^g mL" 1 ) was used to estimate theendogenous LF concentration of the initial milk. This value was in range of the LFconcentrations reported recently for raw milk (157-176 u.g mL" 1 ) as determined byimmunoassays techniques (Chen & Mao, 2004; Dupont et al., 2006; Hagiwara et al., 2003).

However, our method could underestimated the real value in milk as part of the LF couldhâve been retained in the cheese curd as reported by Dupont et al. (2006). Thèse authorsobserved that, depending on the cheese making procédure, only 19% to 39% of the initialLF was recovered in whey corresponding to LF concentration values of approximately 25to 70 (j.g mL" 1 respectively. The large différences with our results may be ascribed to thefact that the authors used bacteria starters for acidification of milk prior rennet coagulation.In fact, Nuyens and van Veen (1999) observed that acid précipitation of milk (pH 4.6)impaired the recovery of LF in whey. Moreover, as the heating température increased, aprogressive decrease of the concentration of LF recovered in the whey fraction rennetcoagulated skim milk. This resuit suggests that the thermal treatment induced LFassociation in milk with either the casein micelles or the other whey proteins which causedthe protein to be retained in the rennet curd. At 75°C, no residual LF was detected in thewhey fraction of rennet treated skim milk.10080ET 60^ 40TTT20A60 65 70 75Température (°C)Figure 5.1 Effect of thermal treatments on the percent of LF recovered (% [LF] W /[LF] O )in the rennet whey of skim milk heated at différent températures (10 min) and analysed byRP-HPLC. Errror bars represent standard déviation of triplicates independent samples.In order to study the influence of LF iron saturation on its recovery in whey, the milksamples were spiked with the différent LF iron forms. The changes observed in the level of

82LF recovered in the whey of the thermally treated enriched skim milk was also assessed byRP-HPLC and the results are shown in Figure 5.2. As for the non-spiked milks, a sharpdecrease of the percent of LF recovered was observed while increasing the severity of theheat treatment (Figure 5.2A). The décline started at around 65°C for the 3 différent LF ironforms enriched milk. However, above 65°C the recovery of LF in the rennet whey fractionincreased with the protein iron content.10080ET 6040201-I60 65 70 75c.X0• Holo-LF• LF• Apo-LFTempérature (°C)Figure 5.2 Effect of iron saturation on the percent of LF recovered (% [LF] W /[LF] O ) inthe rennet whey fraction from thermally treated (10 min) skim milk enriched (0.25%protein [w/v]) with holo-LF (black bars), LF (grey bars) and apo-LF (white bars), andanalysed by RP-HPLC. Errror bars represent standard déviation of triplicates independentsamples.As expected, the holo protein was the more heat-stable iron form whereas the partiallysaturated LF and the apo protein showed lower stability. Thèse results are in agreementwith Sanchez et al. (1992) who suggested that the increase in the thermal stability of holo-LF in milk was related to its more compact structure compared to the more openconformation of the apo protein. Also, the thermal stability of the 19% iron saturated LFwas slightly higher than that of the apo protein. This was probably due to the more stableholo-part of the partially saturated LF as observed by Kussendrager (1994). Thèse results

83suggest that the extent of the LF recovery in whey from thermally treated milk dépends onits iron saturation.The RP-HPLC method also allowed to monitor the influence of the heat treatments on therecovery of the two major whey proteins (P-LG and a-LA) in the whey fraction. Theresults are summarized in Figure 5.3. In skim milk, P-LG was more susceptible to thermaltreatments as a lower level of P-LG was recovered in the whey fraction compare to a-LA.Thèse results are in agreement with the literature (Vasbinder et al., 2003). However, in milksamples spiked with the différent LF iron forms, a more important decrease in theconcentration of P-LG and a-LA in the whey fraction was observed for more severe heattreatments. At 75°C, a clear différence in the percent of P-LG recovered in the whey of LFenriched milk was observed compared to that of the corresponding skim milk.This resuit suggests that LF could associate with P-LG in enriched milk. In fact, uponheating milk, P-LG denatured and expose a free SH residue. The denatured p-LG couldassociate to the casein micelle by forming a S-S linked complex with K-casein (1 S-S)located at the surface layer of the casein micelle. P-LG could also interact with other wheyproteins possessing Cys residues but to a lesser extent than with casein micelles as showedby Vasbinder et al. (2003). LF has 17 intramolecular S-S but no free Cys residue. LF couldhâve had undergone SH/S-S intermolecular exchange reactions with the denatured P-LGand cause the aggregated proteins to either be retained in the rennet curd or expulsed in thewhey fraction upon centrifugation. We suggested that P-LG behave with LF in a similarmanner than with other S-S containing proteins such as a-LA that possesses 4intramolecular S-S but no free SH. Several studies hâve showed that a-LA intermoleculardisulfide reactions upon heating are favoured in the présence of free SH containing proteinsuch as P-LG, but also BSA and ovalbumin (Dalgleish et al., 1997a; Havea et al., 2000;Hong & Creamer, 2002; Sun & Hayakawa, 2001).

84A100• Skim milk• Holo-LFDLF• Apo-LF65 70 75Température (°C)B100£ 80•J 60< 4020IIIDSkim milk• Holo-LF• Native-LFD Apo-LF60 65 70 75Température (°C)Figure 5.3 Effect of LF iron saturation on the percent of P-LG (A) and a-LA (B)recovered in the rennet whey fraction from thermally treated (10 min) skim milk (dark greybars) and milk spiked (0.25% protein [w/v]) with holo-LF (black bars), LF (grey bars) andapo-LF (white bars), and analysed by RP-HPLC. Errror bars represent standard déviation oftriplicates independent samples.For the more heat résistant a-LA, différences in the concentration recovered in wheybetween skim milk and spiked milk was only observed at 80°C. The higher stability of a-

85LA in LF enriched milk could be ascribed to its structure stabilized by 4 intramolecular S-Sbridges. Dalgleish et al. (1997b) showed that the présence of the free SH containing (3-LGwas necessary for a-LA to associate with K-casein upon heating. However, the LF ironsaturation status did not influence the level of P-LG and a-LA recovered in the whey ofrennet spiked milk. This resuit suggests that the binding of iron did not influencesignificantly the thermal association of LF with the other whey proteins in enriched milk.5.5.2 Changes in protein association in rennet curdsIn order to détermine the nature of the interactions that causes the thermal association ofLF, one dimensional (1D) and two dimensional (2D) SDS-PAGE analysis were performedon the rennet curd of skim milk and LF enriched milk. Figure 5.4A shows the 1D-SDS-PAGE pattern of the rennet curds of skim milk samples under non-reducing condition. Thefirst lane corresponds to the unheated control and the subséquent lanes to the heatedsamples (60°C, 70°C, and 80°C). In SDS-PAGE under non-reducing condition, theunheated sample separated into several bands. The major bands were the caseins. Abovethe casein, a band that corresponds to the electrophoretic mobility of LF was resolved. ThisLF band was possibly overlapped by another band of covalently linked protein oligomers.This oligomer was later identified by the 2D-SDS-PAGE analysis as dimeric a S 2-casein(see below).

AHMW aggregatesLMW aggregatesLF + dimeric oc s2 -CNa-&-p-CNNR-SDS-PAGEC 60 70 80R-SDS-PAGEC 60 70 80 LFpara-K-CN7-NR-SDS-PAGEC 60 70 80R-SDS-PAGEC 60 70 80 LFHMW aggregatesLMW aggregatesLF + dimeric a s2 -CNa-&-|3-CNpara-K-CN7 —Figure 5.4 Non-reduced (NR) and reduced (R) SDS-PAGE of rennet curd from (A)skim milk and (B) milk spiked with LF (0.25% protein [w/v]) unheated (C) and heated at60°C, 70°C and 80°C (10 min). LMW = Low molecular weight, HMW = High molecularweight, LF = lactoferrin standard, CN = caseinAbove the LF + a s2 -casein band, a group of slow migrating bands were observed betweenthe top and the bottom end of the stacking gel. Those bands were covalently linked lowmolecular weight (bottom end) and high molecular weight (top) aggregates. The intensity

87of thèse bands increased with the severity of the heat treatment. This resuit suggests thatcovalent protein association occurred upon the heating of milk, probably via SH/S-Sintermolecular reactions. The formation of intermolecular S-S among whey proteinscontaining Cys residues ((3-LG, a-LA, and BSA) and/or with K-casein (1 S-S), but alsowith a S 2-casein (1 S-S), are also known to occur upon heating (Patel et al., 2006; Vasbinderet al., 2003). We previously reported that LF undergo intramolecular S-S cleavages uponheating that initiate aggregation through SH/S-S intermolecular exchange reactions(Brisson et al.). As mentioned above, the présence of LF in covalently linked aggregateshas also been observed in heated milk (Nabhan et al., 2004; Patel et al., 2006) andreconstituted skim milk (Jean et al., 2006) suggesting that LF undergoes such reactionswith either the whey proteins and/or the caseins.Similar results were observed in the SDS-PAGE pattern of the milk spiked with native-LF(Figure 5.4B) as well as with the holo and apo protein (results not shown). However, theintensity of the overlapped LF band was higher in the case of the curd obtained from themilk spiked with LF. This was probably due to the increased concentration of LF in theenriched milk samples. Moreover, in the non-reduced SDS-PAGE pattern of the LFenriched milk, the bands related to both the low and high molecular weight aggregates wasalso more intense than that observed in the skim milk, particularly for the more severe heattreatments (70°C and 80°C). Also, the decrease of the LF + a S 2-casein band intensity wasmore important in the thermally treated enriched milk samples. Thèse results suggest thatthe susceptibility of LF to the formation of intermolecular S-S linked aggregates in milkincreases with its concentration in milk. Moreover, the respective intensity of the bandcorresponding to both the low and high molecular weight aggregates was lower suggestingthat very large covalently linked aggregates that did not enter the stacking gel were formed.Furthermore, when submitted to SDS-PAGE under reducing conditions, the high molecularweight aggregates observed in the non-reducing SDS-PAGE pattern of both skim milk andthe native-LF spiked milk were disrupted into their individual proteins. Apart from the

caseins, an important band was observed at the bottom end of the resolving gel. This bandwas identified as para-K-casein, the insoluble product of the rennet cleavage of K-casein.This resuit shows that part of the para-K-casein, that preserved the 2 Cys residues of theformer K-casein, was covalently linked in the rennet curd. We also observed an increase inthe intensity of the LF band as the thermal treatment increased. This resuit also confirmsthat the level of LF covalently linked to the casein by intermolecular S-S interactionsincreased with the heating températures. The présence of (Î-LG and to a lesser extent a-LAwas also detected at 80°C suggesting that they were also associated in the curd by S-Slinkages.A second SDS-PAGE dimension was performed on the 1D-SDS-PAGE sample gel strip, inorder to identify the proteins that associated into the covalently linked aggregates observedin the first SDS-PAGE dimension. A gel strip of the first SDS-PAGE dimension wasremoved and reduced prior the second dimension to cleave the covalently linked aggregatesinto their respective monomeric protein thus allowing their identification. The 2D-SDS-PAGE patterns of the unheated and heated (70°C) samples of skim milk rennet curd arepresented in Figure 5.5. In the unheated sample 2D-SDS-PAGE pattern (Figure 5.5A), theoverlapped LF band in the first SDS-PAGE dimension was reduced to give bandscorresponding respectively in order of electrophoretic mobility to the monomeric forms ofLF and a s2 -casein (in dimeric form in the first SDS-PAGE dimension). The présence ofa S 2-casein dimers has also been reported in milk protein concentrate powder (Havea, 2006)and skim milk (Patel et al., 2006). Patel et al. (2006) also observed that the oc S 2-caseindimers electrophoretic mobility in the first SDS-PAGE dimension is very close to that ofLF (overlapped in our experiments). This resuit shows that maybe a small fraction of LFwas retained in the rennet unheated milk sample either by non-covalent links with thecaseins or simply physically entrapped in the curd. The présence of lactoperoxidase, thatalso hâve a molecular weight of 80 kDa could not be rule out. Moreover, the band observedat the bottom end of the stacking gel in the first dimension after réduction resolved asmonomeric para-K-casein in the second dimension. For the heated skim milk sample, thelow molecular aggregates observed in the first dimension were reduced in their individual

proteins among which LF, a S 2-casein, P-LG, and para-K-casein were identified (Figure5.5B). Ail thèse proteins contain either SH residues (P-LG) and/or S-S bridges (P-LG, LF,a S 2-casein, and para-K-casein). This resuit suggests that those proteins likely associatedupon heating to form large covalently linked copolymers by means of SH/S-Sintermolecular exchange reactions. Indeed, the covalently-associated LF caused the proteinto be retained in the rennet curd of thermally treated milk. Although not formallydetermined, the expulsion of LF containing aggregates in the whey fraction uponcentrifugation could not be ruled out. This would also help to explain the lower LFrecovery observed in the whey fraction. The amount of high molecular weight aggregatesobserved for the heated milk in the first dimension was too low to be detected as individualproteins in the second dimension.

1D-SDS-PAGEB1D-SDS-PAGEduced siimpierégate00ooes' + dimeos"s& P-CN-Stainedgelstrip- Reduced samplegel strip- Stacking gelStained gel stripReduced samplegel stripStacking gelNiDZa & P-CN— Resolvinggelc—— Resolving gel—para-K-CNmmFigure 5.5 2D-SDS-PAGE patterns : non-reduced (NR) SDS-PAGE in the first dimension (horizontally): and reduced (R) SDS-PAGE in the second dimension (vertically) of rennet curd obtained from (A) non-heated, (B) heated skim milk (70OC/10 min). LMW= Low molecular weight, HMW = High molecular weight, LF = lactoferrin, CN = casein.

91The heated (70°C) LF enriched milk sample was also submitted to 2D SDS-PAGE and thepattern is shown in Figure 5.6. The more intense high molecular weight aggregates bandobserved in the first SDS-PAGE dimension were resolved into their individuai protein inthe second reduced SDS-PAGE dimension. As a resuit, the présence of LF and para-Kcaseinbut also a faint band of (3-LG was observed meaning that they were either selfaggregatedand/or co-precipitated in rennet treated enriched milk.1D-SDS-PAGE• Stained gel stripReduced samplegel strip— Stacking gelaIna.-,-— Resolving gelOmFigure 5.6 2D-SDS-PAGE patterns : non-reduced (NR) SDS-PAGE in the firstdimension (horizontally): and reduced (R) SDS-PAGE in the second dimension (vertically)of rennet curd obtained from heated skim milk (70°C/10 min) spiked with LF (0.25%protein [w/v]). LMW = Low molecular weight, HMW = High molecular weight, LF =lactoferrin, CN = casein.

925.6 ConclusionThis study showed that thermal treatment can induce the association of LF in rennetcoagulated skim milk and lower its recovery in the corresponding whey. The saturation ofLF by iron increases its thermal stability in milk, favouring its recovery in whey. It appearsthat the thermal association of LF in milk occurred by a combination of non-covalentinteractions but also intermolecular SH/S-S intermolecular exchange reactions for moresevere heat treatment. Thermal aggregation of LF in milk apparently involves both wheyproteins and caseins possessing Cys residues such as P-LG, a-LA, a S 2-casein, and K-casein.5.7 AknowledgementsThis work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Council(NSERC), the Fonds Québécois de Recherche sur la Nature et les Technologies (FQRNT)Novalait Inc., and the Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation duQuébec (MAPAQ).

93Chapitre 6 Séparation de la lactoferrine d'un mélange deprotéines de lactosérum par microfiltration tangentielleassistée par un champ électrique« Electrically-enhanced crossflow microfiltration for theséparation of lactoferrin front whey protein mixtures »Les travaux présentés dans ce chapitre correspondent au second volet de la problématique.Le but était de vérifier le potentiel d'un procédé de microfiltration assisté par un champélectrique pour améliorer le fractionnement de la LF en présence de protéines dulactosérum. Les objectifs spécifiques de ce chapitre étaient premièrement de vérifier l'effetdes paramètres du champ électrique sur la sélectivité du fractionnement et d'évaluerl'impact de la saturation en fer de la LF sur sa transmission.

946.1 RésuméCette étude visait à déterminer l'effet de l'application d'un champ électrique durant lamicrofiltration de la LF en présence de protéines du lactosérum. L'impact de la force duchamp électrique (0-3333 V m" 1 ) et de sa polarité sur le flux de perméation et sur latransmission des différentes protéines a été étudié. L'influence du niveau de saturation enfer de la LF a aussi été évaluée. Des expérimentations de microfiltration assistée par unchamp électrique ont été effectuées sur un module plan fabriqué à cette fin, en utilisant unemembrane de 0,5 um de diamètre de pores. Les conditions opératoires de la filtrationimpliquaient un mode recirculation complète et des conditions hydrodynamiques depression transmembranaire (0,7 bar) et de vélocité (0,12 m s" 1 ) faibles. Les résultats ontdémontré que l'application du champ a un impact important sur la transmission desdifférentes protéines. Ainsi, l'application d'un champ électrique a permis d'augmenterconsidérablement la sélectivité de la séparation des protéines, particulièrement lorsque lacathode se trouve du côté rétentat. Dans cette configuration, à 3333 V m" 1 , les facteurs deséparation entre la LF et la P-lactoglobuline et Pa-lactalbumine ont respectivementaugmenté de 3,0 et 9,1. Dans ces conditions, le flux de perméation a aussi augmenté d'unfacteur 3 par rapport à la microfiltration sans champ électrique, suggérant ainsi unediminution importante des phénomènes de concentration de polarisation et d'encrassementde la membrane. La saturation en fer de la LF influence de façon marquée sa transmissionen présence d'un champ électrique de 1667 V m" 1 et les facteurs de séparation entre la holo-LF et la P-lactoglobuline et l'a-lactalbumine ont augmenté respectivement de 6,7 et 62,4.Cette étude démontre le potentiel de la microfiltration assistée d'un champ électrique pourle fractionnement de la LF pour des solutions complexes comme le lactosérum defromagerie.

956.2 AbstractThe effect of applying an external electrical field during microfiltration of lactoferrin (LF)and whey protein solutions has been investigated. The impact of electrical field strength (0-3333 V.m" 1 ) and polarity on the permeation flux and protein transmission were investigatedand the influence of LF iron saturation was also assessed. The electrically-enhancedmembrane filtration experiments were performed on a purpose-built flat-sheet moduleusing a PVDF microfiltration membrane of 0.5 um of pore diameter. The filtrations wereoperated in a full recirculation mode at low transmembrane pressure (0.7 bar) and feedvelocity (0.12 m.s" 1 ). The results showed that the application of an electrical field had animportant impact on protein transmission. Selectivity enhancement was obtained,particularly with the cathode on the retentate side. In that configuration at 3333 V.m" 1 , theséparation factors obtained between LF and the two main whey proteins (3-lactoglobulin (P-LG) and a-lactalbumin (a-LA) were 3.0 and 9.1 respectively. Under those conditions theelectric field increased permeation flux by a factor 3, suggesting an important decrease ofmembrane fouling. LF iron saturation also influenced markedly its transmission under theelectrical field and séparation factors between holo-LF and P-LG or a-LA were up to 6.7and 62.4 respectively at 1667 V.m" 1 . This study shows the potential of the electricallyenhancedmembrane filtration process for the fractionation of LF from more complex fluidssuch as cheese whey.

966.3 IntroductionLactoferrin (LF) is an iron-binding glycoprotein of 80 kDa that belongs the transferrinfamily. In bovine milk, LF is found in minor amounts varying from 0.02 to 0.20 g/L (Law& Reiter, 1977). LF is only partly saturated with iron (15-20%) in its native state in milk(Steijns & van Hooijdonk, 2000). LF has multiple biological activities that includeantimicrobial, anti-inflammatory, anticarcinogenic, immunomodulatory, and bone growthfactor properties (Brock, 2002; Ward et al., 2005). There is considérable interest for its useas a natural bioactive ingrédient in food, health and nutritional products. It has alsotriggered the development of suitable techniques for its isolation. LF has a strong basiccharacter with a pi between 8.0 and 9.0 (Shimazaki et al., 1993). The cationic pi of LFcontrasts with the acidic pi bear by the major proteins in milk: the caseins (pi ~4.6) and thetwo main whey proteins p-lactoglobulin (P-LG; pi of 5.13) and a-lactalbumin (a-LA; pi of4.2-4.5) (Farrell et al., 2004). That distinct charge property allows LF extraction from skimmilk or cheese whey by cation-exchange chromatography and LF isolâtes of high purity(>90% protein) are nowadays available commercially. However, this process at industrialscale has some limitations such as its high cost and relatively low throughputs. Membranefiltration process could represent an interesting alternative to chromatography for thefractionation of LF as it is already well integrated in the dairy industry. However, foulingand poor selectivity in protein séparation hâve been associated with such processes.Différent stratégies hâve been investigated to overcome the limitations associated with theséparation of LF by membrane filtration including the variation of the hydrodynamicparameters (Chilukuri et al., 2001), the modification of the physico-chemical environment(Chaufer et al., 2000; Rabiller-Baudry et al., 2001), the use of différent membrane types(Mehra & Donnelly, 1993; Ulber et al., 2001), and the modification of the membranesurface properties (Rabiller-Baudry et al., 2001).Electrically-enhanced membrane filtration (EMF) consists in superimposing an electricalfield to a conventional membrane filtration unit. In EMF, the electrical field acts as an

97additional driving force to the transmembrane pressure (PT). Accordingly, in EMFdifférences in protein electrophoretic mobility are coupled to the sieving effect of themembrane to enhance the selectivity of membrane fractionation. EMF has been mainlyused as a strategy to improve permeation flux (Jp) of protein solutions by preventingconcentration polarization and membrane fouling (Brunner & Okoro, 1989; Huotari et al.,1999b; Iritani et al., 2000; Lentsch et al., 1993; Oussedik et al., 2000; Park, 2005; Radovichet al., 1985; Rios & Freund, 1991; Rios et al., 1988; Robinson et al, 1993; von Zumbuschet al., 1998; Wakeman, 1998; Yukawa et al., 1983) and could represent a feasible approachfor the séparation of LF. Furthermore, selectivity enhancement for the séparation ofbiomolecules such as amino-acids and peptides hâve been obtained using EMF (Bargemanet al., 2000; Bargeman et al, 2002a; Bargeman et al., 2002b; Daufin et al, 1995; Lapointeet al., 2006). However, only few studies reported the effect of EMF on the selectivity ofséparation of complex protein solutions (Lentsch et al., 1993; Rios et al., 1988; Yukawa etal., 1983). The objective of this study was to investigate whether EMF could increase theselectivity of LF séparation from a mixed solution using a whey protein isolate (WPI) asmodel. The influence of EMF parameters such as the electrical field strength and polarityon protein transmission (Tr) were investigated. The impact of the iron saturation of LF onthe selectivity of the séparation was also assessed.6.4 Materials and methods6.4.1 MaterialsBovine LF (protein 93.2%; purity 85.0%; moisture 4.4%; ash 1.6%; and iron saturation23%) was from DMV International (Fraser, NY, USA). A commercial WPI, namely theBiPRO (Davisco Food International Inc., Le Sueur, MN) was used throughout theexperiments. Its overall composition consisted of proteins (92.1%); moisture (5.2%) and

ash (1.8%). The protein composition of the WPI was: 62.8% P-LG and 27.1% a-LA asdetermined by reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis(see below). Ail powder characteristics are expressed on as is basis.6.4.2 Préparation of iron saturated lactoferrinIron-saturated LF (holo-LF) was prepared according to van Berkel et al. (1995). Briefly, LFwas dispersed (1% protein [w/v]) in 10 mM Tris-Cl buffer containing 75 mM NaCl, pH7.2. This solution was then mixed with a freshly prepared FeNTA solution (9.9 mMFe(NÛ3)3 and 8.5 mM nitrilotriacetic acid (NTA) in water adjusted to pH 7.0 with sodiumbicarbonate (NaHCÛ3). The volume proportion of the solutions was adjusted to achieve a4-fold iron to Lf molar ratio. The excess of iron was removed by continuous diafiltrationwith a spiral-wound ultrafiltration (UF) cartridge (S1Y30, 30 kDa) (Amicon, Beverly, MA)before being freeze-dried. The prepared holo-LF isolate had the following characteristics:protein 96.1%; purity 92.4%; moisture 3.8%; ash 1.1%; and iron saturation >99%).6.4.3 Electrophoretic mobility measurementsA Zetasizer System (model 2000, Malvern, Worcesthershire, UK), was used to measure theelectrophoretic mobility of the différent protein sources. Protein dispersions, 0.125% (w/v)dissolved in 16 mQ.cm" 1 deionized water (Super-Q System, Millipore, Billerica, MA)were prepared and adjusted with HC1 or NaOH at the desired pH. Ail electrophoreticmobility measurements were performed on triplicate samples.

996.4.4 Membrane and module set-upThe microfiltration (MF) membranes used in this study were polyvinylidene fluoride(PVDF) membranes of 0.5 um of pore size diameters obtained from PTI AdvancedFiltration (Oxnard, CA). The EMF experiments were performed on the purpose-built flatsheet EMF module and using the expérimental set-up described in Lapointe et al. (2006).Briefly, the EMF module consisted in two plates of polivinyl chloride (PVC) in whichplatinized titanium électrodes hâve been cast. The séparation distance between theélectrodes was 0.003 m and the effective électrode and membrane areas were 0.0139 m 2and 0.0159 m 2 respectively. The constructed EMF module allowed two électrodeconfigurations or polarities namely the cathode in the retentate side of the membrane(anode in the permeate side) or the anode in the retentate side of the membrane (cathode inthe permeate side).6.4.5 EMF experimentsBefore each EMF experiments, membrane coupons were conditioned by initially rinsingwith fresh distilled water for 10 min at 45°C; followed by an alkaline cleaning step (pH11.0) with Ultrasil 25 (EcoLab, Mississauga, ON, Canada; 0.3%), a surfactant (Ultrasil 10,EcoLab, 0.02%), and 150-180 ppm of active chloride (XY-12, EcoLab). This solution wasrecirculated during 30 min at 45°C. The System was then rinsed at 25°C until reaching theneutral pH of water (-20 L). The initial pure water flux was then estimated after 30 min ofrecirculation at a transmembrane pressure (PT) of 0.7 bar and feed flow velocity (v) of 0.12m.s" 1 .The feed phase for the single protein solutions was prepared by dissolving 6.26g of proteinin 5 L (0.125% protein w/v) of 16 mQ.cm" 1 deionized water (Millipore). The protein

100mixture (LF+WPI) was prepared at a 1:1 protein ratio. The pH of the protein solution wasadjusted to 7.0 using NaOH or HC1 and the solution was stirred for 1 hour prior each run.The water in the EMF System was then flushed and replaced by the feed solution. The feedsolution was recirculated at PT of 0 bar and v of 0.12 m.s" 1 for 10 min. After 10 min, the pHwas again adjusted and a sample of the feed was taken for protein détermination. Thissample was used as the référence for the initial protein concentration. The hydrodynamicsparameters were then set at PT of 0.7 bar, and at v of 0.12 m.s" 1 . Ail filtrations wereoperated in a full recycle mode by continuously recycling the retentate and the permeateinto the feed tank. The température of the feed phase was thermostatically maintained at25°C (± 2°C) during the course of the experiment. A gradient of electrical field was applied,starting with a first control with no electrical field (0 V.m" 1 ) and consecutively increased at1667 V.m" 1 and 3333 V.m" 1 that corresponded respectively to 5 V and 10 V potentialdifférence between the working électrodes The electrical field strength was reverted to asecond control at 0 V.m" 1 and the électrode configuration was inversed and the samegradient of voltage was performed and completed with a final control (0 V.m" 1 ). The feedwas recirculated at each electrical field strength for 30 min. The electrical current wasapplied with a direct current (DC) power supply (Xantrex, model XHR, Vancouver, BC,Canada) and two multi-meters (model 52-0052-2, Mastercraft, Toronto, ON, Canada) wereused to monitor the potential différence and the current intensity during the course of theEMF trials. After 30 min, the Jp was measured and samples of both the permeate and thefeed were collected for protein Tr détermination. The conductivity (k) and the pH weremeasured in the feed, the retentate (at the outlet), and the permeate solutions using aportable pH/conductivity meter (model HI 991301, Hanna Instruments, Laval, QC, Canada)equipped with a HI 1288 multitask probe (Hanna Instruments).The cleaning procédure of the MF membrane was as followed: a first rinsing step withdistilled water (20 L), followed by an alkaline cleaning procédure (as described below), asecond water rinsing step until reaching normal water pH (20 L), and then the acid cleaningstep (pH 2.0) (Ultrasil 75, EcoLab, 0.3%) for 30 min at 45°C. The system was finally rinsedwith distilled water (~20 L). The alkaline cleaning procédure was repeated until at least

10185% recovery of the initial pure water permeation flux (J\y) was reached. Each membranecoupon was not used more than two times. The membranes were selected based on theirinitial water flux. The mean value for the initial Jw for the 6 membranes selected was 366 Lm' 2 h" 1 ± 72.6.4.6 Analytical methodsThe protein content of the différent protein isolâtes was measured on a LECO FP-528Nitrogen/protein analyser (LECO, St-Joseph, MI) based on a standard method (IDF, 2002).The percent of protein purity and composition of the WPI, LF and holo-LF powders weredetermined by RP-HPLC according to Elgar et al. (2000) and by integrating the peak areaof the target protein as a percentage of the total chromatogram area. Moisture and ashcontents were determined by the AOAC methods 927.05 and 930.30 respectively (AOAC,1990). The percent of LF iron saturation was estimated by spectrophotometric analysisusing the absorbance at 280 and 465 nm according to Hashizume et al. (1987).Protein concentration in the feed and the permeate samples were also estimated from peakarea determined by the RP-HPLC described above. The observed Tr were calculatedaccording to:(6.1)

102where Cp and CF refer to the protein concentrations in the permeate and the feedrespectively. The observed séparation factor between the target and the contaminantproteins was defined according to:v=T L (6 " 2)/y T r ywhere S is the séparation factor between the target protein x and the contaminant protein y.6.4.7 Statistical analysisEach EMF experiments were performed in duplicate according to a split plot factorialdesign with the feed solution type in the main plot and the polarity and electrical fieldstrength in the subplot. Data were subjected to the gênerai linear model procédure of theStatistical Analytical System (SAS) software (version 8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC).6.5 Results and discussion6.5.1 Electrophoretic mobility measurementsIn EMF, the physico-chemical parameters hâve to be set to maximize différences betweenthe protein electrophoretic mobilities in order to successfuUy operate their fractionation.Preliminary measurements of the electrophoretic mobility of the différent protein solutions

103were made in the pH range between their pi values, where the proteins of interest wereexpected to hâve opposite charges. The results are presented in Figure 6.1. The positiveelectrophoretic mobility of LF decreased progressively from 1.4 x 10' 8 m 2 .V"'.s"' to 0.3 x10" m .V" .s" while increasing pH from 6.0 to 8.0. Similar results were obtained for thepartially saturated LF and the iron saturated holo-LF. This resuit showed that the ironcontent did not influence LF surface charge. In contrast, the electrophoretic mobilities ofthe main WPI species were négative above their pi values (around 5.0). Therefore, thenégative electrophoretic mobility of the WPI species in solution increased with the pH.Over the pH range studied, the optimal electrophoretic mobility différence between theWPI and both LF solutions was at neutral pH. For that reason, neutral pH was chosen forail the EMF experiments.-Holo-LF•LF-WPIPHFigure 6.1 Electrophoretic mobility (ja e ) of the différent protein dispersions (0.125%protein [w/v] in water) as a function of pH determined by Zetasizer apparatus (Malvern).Data are the mean of three independent experiments.

1046.5.2 EMF of single protein solution6.5.2.1 EMF of the WPI solutionFigure 6.2 illustrâtes the effect of the applied electrical field on the Jp and the Tr of themain whey proteins obtained with the WPI solution (0.125% [w/v]). A schematic drawingof the EMF module depicting the polarity, the protein net charge and the expectedmigration of the protein has been inserted left of both figures. As seen on Figure 6.2A, forthe negatively charge WPI species at neutral pH and with the anode on the retentate side,the Tr of both P-LG and a-LA decreased with the applied electrical field. Due to theelectrophoretic movement of the negatively charged WPI species toward the anode, theprotein migration toward the membrane surface decreased. Consequently, with higherprotein rétention, an important increase of the Jp was observed with the applied electricalfield. However, the fact that the Jp increased almost linearly and the partial Tr observed forthe WPI protein species suggested that the system was operated below the critical electricalfield strength (E c ). The E c value is defined as the electrical field at which the net particlemigration toward the membrane is zéro (Henry et al., 1977; Huotari et al., 1999b). Whenthe applied electrical field is above E c the electrophoretic movement of the protein towardthe électrode of opposite charge balances the convective flow toward the membrane surfacewhich prevents concentration of polarization and membrane fouling. Despite operatingunder the E c , Jp increase by a factor 1.4 at 1667 V.m" 1 and 2.1 at 3333 V.m" 1 as compared toMF without an applied electrical field (0 V.m" 1 ). This resuit clearly showed that, with theanode on the retentate side, the application of an electrical field reduced membrane foulingfor the WPI solution.

10516012080 Eéa.40îp-LGa-LA-Jp3333B1001608U120— 60* 40i80 E1 p-LG=]a-LA•—Jp204001667E (V.m 1 )3333Figure 6.2 Evolution of the transmission (Tr) of P-LG and a-LA and the permeationflux (J P ) during the EMF of a WPI solution (0.125% protein [w/v]) at pH 7.0. Error barsrepresented the standard déviations calculated from the least square means of respectivelyTr and Jp values.With the cathode on the retentate side, the Tr of P-LG and a-LA did not increase asexpected, as suggested on the schematic drawing on Figure 6.2B. A progressive réductionof the Tr was observed for both WPI species with the electrical field. The Tr of P-LGgradually decreased from 51% without an applied electrical field (the second control at 0

106V.m" 1 ) to 34% at 1667 V.m" 1 , and 24% at 3333 V.m" 1 , whereas the Tr of oc-LA went from82% to 61%, and to 48% for the same electrical field gradient. However, a concomitantdécline of the Jp was observed (Fig. 6.2B) suggesting that membrane fouling increased.With the cathode on the retentate side, the electrophoretic movement of the negativelycharged proteins was oriented in the same direction as the convective flow. Thus, under thelow v (0.12 m.s" 1 ) condition, the electrical field probably favoured a rapid particledéposition at the membrane surface which reduced both the Jp and protein Tr.During the EMF of the WPI solutions, important changes in the permeate k and pH wereobserved (Table 6.1). Therefore, electrolytic reactions (water dissociation) at bothélectrodes interface were suspected. Water dissociation produced hydroxyl ions (OH") andhydrogen (H2) at the cathode and hydronium ions (H^O + ) and oxygen (O2) at the anode.Depending on the polarity, either a basification or an acidification of the retentate or thepermeate side were observed. The k and pH modifications were lower in the retentate (atthe outlet) than in the permeate. This was probably due to the short résidence time of theretentate in the compartment (high flow rate) and to some extent its buffer capacity.Conversely, the more important changes observed in the permeate solution could beascribed to its longer contact time with the électrode (low flow rate) in the permeatecompartment.For the WPI solution with the anode on the retentate side, the pH in the permeate increasedmarkedly (pH >10.0) with the electrical field strength due to the production of OH" at thecathode. This also led to an increase of the permeate k from 0.02 with no applied field, to0.16 at 1667 V.m" 1 , and 0.19 mS.cm" 1 at 3333 V.m' 1 . While reverting the polarity, thepermeate k increased to a lesser extent and a simultaneous acidification of the permeate wasobserved.

Tableau 6.1 Effect of the electric field parameters (polarity and electrical field strength [E]) on the conductivity (k) and pH of thefeed, the retentate (at the outlet), and permeate solutions obtained during the EMF of single protein solutions (0.125% protein [w/v] atpH 7.0) operated at 0.7 bar and 0.12 m.s" 1 .FeedWPIT FHr>1r> î FPolarity(Retentate)H(-)(+)(-)(+)(-)E(V.m- 1 )016673333016673333016673333016673333016673333016673333Feed0.030.030.030.030.030.030.080.080.080.080.080.070.060.060.060.060.080.07k(mS.cm 1 )Retentate0.030.030.030.030.030.030.080.080.090.080.080.090.060.070.070.070.090.11Permeate0.020.160.190.030.020.060.080.250.400.080.591.040.060.190.290.060.661.07Feed7.07.17.17.17.07.07.07.07.07.17.17.27.07.17.06.77.07.4pHRetentate7.16.86.77.07.06.97.16.56.37.07.98.77.06.76.46.68.08.7Permeate7.010.510.77.05.43.87.010.911.07.02.72.56.910.710.96.72.62.3

1086.5.2.2 EMF of lactoferrin solutionThe influence of EMF parameters and iron saturation on the filtration of LF single solutionswere also assessed. The corresponding effects observed on the Jp and protein Tr are showedin Figure 6.3A and 6.3B. Despite increasing the soluté transport toward the membrane, thesuperimposition of an electrical fïeld improved the Jp for both LF solutions. At 1667 V.m" 1 ,the Jp increased by 3.5 and a 2.9-fold factors for respectively the LF and the holo-LFsolutions. Those factors augmented to 4.3 and 4.9 at 3333 V.m" 1 . As seen in Table 6.1,important pH and k changes were measured in the retentate and the permeate solutionsduring EMF suggesting that water dissociation occurred at both électrodes. Thus, O2production at the anode during EMF might hâve contributed to improve the Jp. Mameri etal. (1999) hâve suggested that the production of gas at the anode at high fïeld strengthcontributed to improve the Jp while performing electrically enhanced UF of a BSA solution.Several studies hâve also shown that the injection of compressed air during membranefiltration (gas sparging) could enhanced the Jp of protein solution (Ghosh et al., 1998; Li etal., 1997; Li et al., 1998). For the MF of both LF solutions without an electrical field, the Trof the fully saturated holo-LF (18%) was almost 2 times higher than that of LF (10%). Bybinding a ferrie ion, both lobes of LF adopt a more compact structure compare to the apoform(Baker et al., 2002). Thus, the more globular structure of holo-LF probably helped itsTr. While applying an electrical fïeld with the anode on the retentate side, the Tr of both LFiron forms increased markedly to approximately 60% at 1667 V.m" 1 . In that configuration,the electrophoretic movement of LF toward the membrane forced the protein Tr. However,two fold increases of the electrical fïeld strength (3333 V.m" 1 ) did not resuit in aproportional rise of both LF Tr. An unexpected réduction of their Tr was rather observed.However, as LF came into contact with the basic permeate solution (pH -11.0; Table 6.1),a net charge reversai of the protein could be expected. Therefore, as the protein net chargehad the same sign as the permeate électrode, a migration back toward the retentate sidecould not be ruled out while increasing the electrical field strength.

B1008CCç 60;0 4—100801667 3333E(V.m" 1 )16C140120 _100 ^CXI80 E60 iQ.40 "»200100Figure 6.3 Evolution of the transmission (Tr, %) and the permeation flux (Jp) of LF (A) and holo-LF (B) during the EMF of LFsolutions (0.125% protein [w/v]) at pH 7.0. Error bars represented the standard déviations calculated from the least square means ofrespectively Tr and Jp values.

110With the cathode on the retentate side, sharp increases of the Jp were also observed for bothLF iron forms with the applied electrical field. At the highest electrical field strength, the Jpincreased by a factor 3.2 and 4.0 for respectively the LF and the the holo-LF solutions.Thus, decreases of both LF Tr would hâve had been anticipated from the protein net chargeand électrode configuration. However, a 3.5-fold augmentation of LF and holo-LF Tr wasobserved at 1666 V.m" 1 . A large increase of the retentate pH to a value around 8.0 wasobserved for both LF solutions (Table 6.1). At that pH, the electrophoretic mobility of LFand holo-LF is close to zéro (Figure 6.1) and the electrical field has no effect on LFmobility. At pH close to its pi, LF likely adopted a more compact structure due to adiminution of protein répulsive force and an augmentation of internai attraction. At lowionic strength, the Tr of a protein is normally higher at a pH corresponding to its pi(Nystrom et al., 1998; Saksena & Zydney, 1994). But while increasing the appliedelectrical field to 3333 V.m" 1 , the Tr of both LF iron forms decreased markedly to less than10%. This time, the acidification of the permeate due to electrolytic reactions at the anodeprobably increased the positive net charge of the protein. This caused the protein to berepulsed toward the retentate at a rate that likely increased with the electrical field intensity.6.5.3 EMF of mixed protein solution6.5.3.1 EMF of lactoferrin in the présence of whey proteinsThe effect of EMF on the séparation of LF from a WPI was also investigated. The resultsobtained for each électrode configurations are summarized in Figure 6.4. With the anode onthe retentate side (Fig. 6.4A), the Jp improved in a similar manner than that observed for thepure LF solution. This resuit suggested that the présence of whey proteins did not hâve animportant influence. For that électrode configuration, the electrophoretic movement of LFtoward the cathode improved its Tr (43%) at 1667 V.m" 1 but to a lesser extent than for the

111pure LF solution (63%). As observée for pure LF solution, the Tr of LF in the présence ofwhey was reduced at 3333 V.m" 1 . Again, this réduction of LF Tr could be ascribed to theelectrolytic reactions occurring during the EMF of LF in the présence of whey proteins asan important basification of the permeate was again observed (Table 6.2). Whereas in theWPI single solution a progressive decrease in the Tr of P-LG and a-LA with the electricalfield strength was observed, protein Tr decreased only at 3333 V.m" 1 in the présence of LF.However, without the application of an electrical field the Tr of P-LG (26%) and a-LA(38%) in the mixed solution were also much lower (Fig. 6.4A) than that observed in theindividual WPI solution, 69% for P-LG and and 90% for a-LA (Fig. 6.1). Ionic interactionsbetween the positively charged LF and the negatively charged p-LG could occur at neutralpH as reported by Lampreave et al. (1990). Thus, the association of LF with anionic P-LGmolécules could explain the sharp réduction of their Tr (Fig. 6.4A) compare with theirrespective behaviour in the LF and WPI single protein solutions (Fig. 6.2A and Fig. 6.3Arespectively). Although no association of a-LA with bovine LF hâve been observed atneutral pH (Lampreave et al., 1990), the level of a-LA transmitted also decreased. With atleast part of the P-LG associated to LF, an augmentation of the repulsion of negativelycharged a-LA toward the anode might hâve happen.

11210080g 60È 402001LF-JpLF+WP!0 1667 3333160140120 _100 ]=80 \60 i40 "*20010080g 6 °£ 40200P p-U• ot-UV1667r* 13333E(V.m" 1 )E (V.m 1 )B0 16673333160140: 120 _100 ^80 E60

Tableau 6.2 Effect of the electric field parameters (polarity and electrical field strength [E]) on the eonductivity (k) and pH of thefeed, the retentate (at the outlet), and permeate solutions obtained during the EMF of mixed protein solutions containing LF or holo-LFwith a WPI (1:1 protein ratio, 0.125% protein [w/v] at pH 7.0) operated at 0.7 bar and 0.12 m.s" 1 .FeedIIn1r> T F 1 WPTPolarity(Retentate)(+)(-)(+)(")E(V.rn" 1 )016673333016673333016673333016673333Feed0.050.050.050.050.050.050.030.040.040.040.030.03k(mS.cm" 1 )Retentate0.050.060.060.050.060.050.0350.050.040.040.030.03Permeate0.050.210.330.050.340.660.030.170.250.040.290.34Feed7.07.06.97.06.97.17.07.07.17.06.76.9pHRetentate7.06.76.66.97.27.67.06.96.97.06.97.1Permeate7.010.711.07.03.62.87.110.711.07.15.03.2

114With the cathode on the retentate side, the présence of whey proteins did no influence themagnitude of the Jp improvements observed compare to those obtained with the pure LFsolution. The Tr of LF in the présence of whey proteins (Fig. 6.4B) was also similar to thatobserved in the individual LF solution (Fig. 6.3A). LF Tr increased slightly with theapplication of an electrical fïeld from 11 % without applying an electrical field to 17% at1667 V.m" 1 . While further increasing the electrical field intensity to 3333 V.m" 1 , the Trdecreased to less than 10% likely due to electrolytic reactions at the anode in the permeatecompartment as observed for the pure LF solution. For both WP1 species, pronouncedincreases in the protein Tr were observed at 1667 V.m" 1 , 2.7 and 3.1 times for |3-LG and a-LA respectively compare to the second control without an applied electrical field (0 V.m" 1 ).At that electrical field intensity, the Tr of a-LA (95%) was also greater than that of the P-LG (43%). As previously stated, interactions between LF and P-LG probably impaired P-LG Tr whereas lack of interaction of LF with a-LA allowed the increase of its Tr.6.5.3.2 EMF of holo-lactoferrin in the présence of wheyThe influence of LF iron saturation on its behaviour during EMF was then assessed in themixed solution with the WPI. The results are report in Figure 6.5. As previously observedfor the EMF of LF in the présence of whey proteins, the Jp increases observed for the holo-LF in the présence of whey proteins were similar to those of the pure holo-LF solution.During conventional MF (0 V.m" 1 ), the Tr of the fully saturated holo-LF (46%) was almost2 times higher than that previously observed for the partially saturated LF (24%) in theprésence of whey proteins. As previously stated, the greater Tr observed for holo-LF couldbe attributed to the more compact structure that the protein adopts by binding to ferrie ions.With the anode on the retentate side (Fig. 6.5A), the effect of the electrical field on the Trof holo-LF in the mixed solution was similar to that observed for LF. This was expectedfrom their comparable electrophoretic mobilities at pH 7.0 (Fig. 6.1). Moreover, the Tr ofthe main whey proteins in the présence of holo-LF were practically the same as for LF

115mixed solution. The influence of the electrical field on the Jp of holo-LF in mixed solutionwas also analogous to that obtained with the LF and WPI mixed solution.However, more important effects were observed when the électrode configuration wasinverted with the cathode on the retentate side (Fig. 6.5B). At 1667 V.m" 1 , theelectrophoretic migration of the positively charged holo-LF toward the cathode reduced theprotein concentration at the membrane surface and the holo-LF was almost totally retained.This resuit suggested that the E c was attained as further incrementing the electrical field at3333 V.m' 1 , did not increased markedly the Jp. Différences were also observed for the Tr ofthe main WPI species. At 1667 V.m" 1 , P-LG Tr decreased markedly in the présence of holo-LF (2%) compare to the partially saturated LF (17%), while the increase previouslyobserved for a-LA in the présence of LF (95%) was less important than with holo-LF(60%). As previously stated, LF has a more compact conformation when iron-loadedcompared to the apo-LF. Despite not observing a surface charge modification with the ironbinding(Fig. 6.1), its hydrodynamic diameter and conformation are likely to change. Thèsemodifications may hâve in turn affected its Tr under the electrical field. The results alsoshowed that LF iron saturation had also an impact on the Tr of P-LG which might berelated to an increase of its association with P-LG. Again, detrimental effect on both wheyprotein Tr were observed at higher field strength (3333 V.m" 1 ) as protein Tr decrease to 2%for P-LG and 16% for a-LA. Electrolytic reactions at both the électrodes surfaces were alsoless severe than those observed for the holo-LF single solution and the solution of LF in theprésence of whey proteins (Table 6.2).

116R• \+*100 ;80? 60É 40200• • Holo-LF-.-Jp Holo-LF+WPI16673333160140120 _100 %80 E60 ~Q.40 •»; 20010080g 6 °E 4020T0 J—• p-lja a-LA-r1667 3333E (V.rrr 1 )E (V.m 1 )BHolo-LF-Jp Holo-LF+WPI10080D p-L'a a-LA60402001667 3333E (V.m 1 )E(V.nV 1 )Figure 6.5 Effect of the électrode configuration (A) anode on the retentate side and (B)cathode on the retentate side on the transmission (Tr, %) of holo-LF and the WPI species P-LG and a-LA and the permeation flux (Jp) during the EMF of holo-LF and WPI mixedsolution (1:1 protein ratio, 0.125% protein [w/v] at pH 7.0). Error bars represented thestandard déviations calculated from the least square means of respectively Tr and Jp values.

1176.5.4 Effect of EMF on membrane selectivityAs the electric field parameters allowed to modify LF Tr when mixed with WPI species,this might also hâve an impact on the membrane selectivity. Table 6.3 summarizes theobserved séparation factor (S) values obtained under the various expérimental conditionsinvestigated. For the anode on the retentate side (Fig 6.4A), a 2 fold increase of theséparation factors SLF/P-LG and SLF/a-LA was observed at 1667 V.m'l due to the improved LFTr. Despite the decrease in the Tr of LF observed at 3333 V.m" 1 , a slight increase of theséparation factor was observed. In those conditions, the rétention of the negatively chargedP-LG and a-LA also increased. However, more pronounced effects were observed with thecathode on the retentate side. As previously reported, the Tr of both WPI species in theprésence of LF increased markedly with the applied electrical field (Fig. 6.4B) despitepotential interactions between LF and P-LG. Thus, the séparation factor values rise from2.6 for SP-LG/LF P-LG and 5.56 for S a .LA/LF a-LA at 1667 V.m" 1 to 3.0 and 9.1 respectively at3333 V.m" 1 . Thèse latest results clearly show that EMF can improve the selectivity of theséparation of LF from whey protein species, particularly with the cathode on the retentateside.As discussed before, the iron status of LF also influence its Tr in the présence of wheyproteins. In conventional MF, the Tr of holo-LF increased compare to LF resulting in animprovement of the selectivity for the séparation of holo-LF and the two main WPI species(Table 6.3). With the anode on the retentate side selectivity enhancements were observedfor Shoio-LF/p-LG and S ho io-LF/a-LA with the applied electrical field.

118Tableau 6.3 Effect of the electric field parameters (polarity and electric field strength [E])and the iron-saturation of LF on the séparation factor (S) obtained between the différentproteins species during the EMF of solutions containing LF or holo-LF mixed with a WPI(1:1 protein ratio, 0.125% protein [w/v] at pH 7.0).LF+WPIHolo-LF+WPIPolarityE (V.m" 1 )W L GS LF / a -LASholo-LF/p-LGSholo-LF/a-LAR /00.90.61.31.016671.71.22.2 .13'\ \P33332.51.43.21.7S(3-LG/LFSa-LA/LFSp-LG/holo-LFSa-LA/holo-LF'R\ X\p0166733331.52.63.02.85.69.10.96.71.01.162.47.8However, more important changes of the membrane selectivity were obtained with thecathode on the retentate side. The largest séparation factors obtained between both wheyproteins and holo-LF were obtained at 1667 V.m" 1 where values reached 6.7 for Sp.LG/hoio-LFand 62.4 for S a _LA/hoio-LF- Such high S a . L A/hoio-LF value was due to the low Tr of holo-LF inthose conditions and also to the important increase in a-LA compare to P-LG (Fig 6.5B).Thèse results clearly show that the modification of LF structure induced by the binding ofiron had an effect on the membrane selectivity in EMF with the cathode on the retentateside.

1196.6 ConclusionThis study indicates that the application of an electrical field can modify the protein Trdepending on their net charge and the electrical field parameters such as the field strengthand the électrode configuration. Différences in electrophoretic mobilities between LF andthe main whey protein species at neutral pH hâve been used to improve their séparation inEMF. The iron-binding properties of LF hâve been used to modify its Tr behaviour in EMFin the présence of whey proteins and improve the selectivity of the séparation. However,electrolytic reactions occurring at the électrodes/solution interface during EMF hâve beenobserved. Those reactions had a négative impact on the protein séparation. Even so, thèsefindings hâve shown the potential of EMF for the séparation of more complex proteinmixture such as LF in cheese whey.6.7 AknowledgementsThe authors thank DMV for providing the LF isolate and PTI Advanced Filtration forproviding the microfiltration membranes used throughout the experiments. The authors alsowant to thank Jean-François Poulin an Julie Paquin for their valuable help duringpreliminary work. This work was supported by grants from Natural Sciences andEngineering Council (NSERC), the Fonds québécois de la recherche sur la nature et lestechnologies (FQRNT), Novalait Inc., the ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et del'Alimentation du Québec (MAPAQ).

120Chapitre 7 ConclusionLe but de ce projet était de développer une nouvelle approche de fractionnement de la LFbovine par le recours à un procédé électromembranaire qui consistait à surimposer unchamp électrique en cours de filtration. L'hypothèse générale de cette thèse de doctoratsupposait que la microfïltration assistée par un champ électrique permettrait d'améliorer laséparation de la LF à partir d'un mélange de protéines de lactosérum. C'est la chargedistincte de la LF par rapport aux protéines majeures du lactosérum qui a mené àrenonciation de cette hypothèse. La problématique de cette thèse a été traitée en deuxvolets. D'une part, puisque le chauffage du lait peut entraîner l'agrégation de la LF et nuireainsi à son fractionnement par procédés membranaires, le premier volet consistait àdéterminer l'impact des traitements thermiques du lait sur la récupération de la LF dans lelactosérum. D'autre part, l'approche de séparation par membrane assistée d'un champélectrique telle que proposée supposait que nous puissions mettre à profit des différences decharge entre les protéines à séparer. Ainsi, le caractère cationique de la protéine à pH 7.0,qui se distingue de la charge négative des protéines majeures du lactosérum, permet del'attirer de manière sélective vers la cathode et d'améliorer sa séparation sous l'effet d'unchamp électrique.Les résultats présentés dans cette thèse confirment la pertinence de ces deux hypothèses.Tout d'abord, les traitements thermiques du lait ont démontré un impact important sur l'étatd'association de la LF dans le lait chauffé et son influence marquée sur son niveau derécupération dans le lactosérum. Puis, la surimposition d'un champ électrique à un procédéconventionnel de microfïltration a permis d'accroître de manière importante la sélectivitéde la séparation de la LF par rapport aux protéines majeures du lactosérum en tirantavantage du fait qu'elles possèdent des charges opposées à pH neutre.

1217.1 Principaux résultats et contributions à l'avancement desconnaissancesLe premier volet de la problématique avait pour but de caractériser l'impact des traitementsthermiques sur l'état d'association de la LF et sur sa récupération dans le lactosérum. Dansle cadre de ce volet, le premier objectif visait à étudier l'influence du niveau de saturationen fer de la LF sur l'agrégation thermique de la protéine à pH neutre dans un systèmetamponné (chapitre 4). Les principales observations faites dans le cadre de cette étudemettent en évidence l'impact important de la saturation en fer de la LF sur la résistance dela protéine à l'agrégation thermique. Bien que l'effet du niveau de saturation en fer sur lastabilité thermique de la LF était connu, son influence sur le type de polymères formés encours de chauffage en fonction de la nature des liens intermoléculaires impliqués a, pour lapremière fois, été démontrée dans cette étude et constitue ainsi un élément original. Noussavons maintenant que la LF saturée forme essentiellement des polymères solubles, alorsque les LF désaturée et partiellement saturée forment plutôt des agrégats insolubles. Cettedifférence est attribuable à la fois au type de liens brisés et formés entre les molécules encours de chauffage. L'agrégation thermique de la LF s'effectuerait via une combinaisond'interactions non-covalentes et covalentes. Ces derniers impliquent le bris de pontsdisulfures intramoléculaires, et ce, même en absence de tout autre protéine possédant unrésidu SH libre. La fixation du fer par la LF contribuerait à ce titre à maintenir l'intégrité deses ponts disulfures. Les résultats suggèrent que la fixation du fer protégerait la protéinecontre la formation de liens ponts disulfures intermoléculaires, ce qui contribueraitégalement à diminuer l'accessibilité à certains sites d'interactions non-covalentes,probablement des régions hydrophobes, normalement enfouis au cœur de la molécule.L'effet stabilisant du fer sur la stabilité thermique de la LF s'apparente à celui de l'ioncacium sur l'a-LA.Ces résultats ont permis d'élucider les principaux liens impliqués lors de l'agrégation de laLF à pH neutre et de proposer un mécanisme d'agrégation de la protéine en fonction de son

122niveau de saturation en fer. Par contre, ces conclusions se limitent aux conditionsexpérimentales du système étudié soit à faible force ionique et à pH neutre. De plus, lasusceptibilité des ponts disulfures de cette protéine aux traitements thermiques pourraitfavoriser son association avec d'autres protéines dans le lait en cours de chauffage et nuireégalement à sa récupération dans le lactosérum. De plus, l'agrégation irréversible de la LFvia des liens covalents pourrait également nuire à son fractionnment par un procédémembranaire.Le deuxième objectif défini dans le cadre du premier volet de la problématique avait doncpour but de déterminer l'impact des traitements thermiques du lait sur la récupération de laLF dans le lactosérum issu de la coagulation présure (chapitre 5). Les résultats obtenus ontdémontré que la récupération de la LF dans le lactosérum diminuait de manière importanteen fonction de l'intensité du traitement thermique. Le niveau de saturation en fer contribueà ce titre à augmenter la stabilité de la protéine et à améliorer sa récupération dans lelactosérum. De plus, une analyse détaillée par électrophorèse sur gel a permis de déterminerà la fois la nature des interactions menant à l'association de la LF dans les caillés de typeprésure et les protéines qui sont impliquées dans le processus. Les interactions impliquantla LF s'effectueraient par l'établissement d'une combinaison de liaisons non-covalentes etcovalentes qui sont favorisées lorsque l'intensité de chauffage du lait augmente. Lesrésultats suggèrent que, selon la sévérité du traitement thermique appliqué, la LF formeraitdes ponts disulfures intermoléculaires avec d'autres protéines du lait possédant descystéines, incluant à la fois des protéines du lactosérum et des caséines. La formation de cesponts disulfures intermoléculaires serait induite par des réactions d'échanges thiol/disulfureentre ces protéines et la LF.Ces observations permettent d'expliquer le plus faible niveau de récupération de la LF dansle lactosérum obtenu à partir de caillés présure de lait chauffé par rapport à celui obtenu àpartir du lait cru. Les traitements thermiques du lait auraient donc, dans l'ensemble, unimpact négatif sur la récupération de la LF dans le lactosérum de lait coagulé par la présure.

123Notre étude a aussi permis, pour la première fois, de proposer des mécanismes par lesquelsla LF serait retenue dans la matrice fromagère obtenue à partir de lait chauffé.Le deuxième volet de cette étude avait pour but de démontrer le potentiel de la filtrationassistée par un champ électrique pour le fractionnement de la LF en présence de protéinesdu lactosérum. Les deux objectifs liés à ce volet ont été traités conjointement dans lechapitre 6. D'abord, l'objectif 3 consistait à déterminer l'influence des paramètres duchamp électrique (force et polarité) sur la sélectivité du fractionnement de la LF enprésence de protéines du lactosérum. Les résultats présentés dans cette étude ont permis dedémontrer que l'application d'un champ électrique permettait de modifier la transmissiondes protéines selon leur charge, en fonction des paramètres de force de champ électrique etde la polarité. De plus, des différences de mobilité électrophorétique entre la LF et lesprincipales protéines du lactosérum à pH neutre permettent d'accroître la sélectivité de laséparation en appliquant un champ électrique comparativement à la microfiltration sanschamp électrique. Les augmentations les plus importantes ont été observées lors del'application d'un champ électrique avec la cathode du côté rétentat. Dans cette polarité, lechamp appliqué permet de maintenir la rétention de la LF chargée positivement etd'augmenter de façon importante les transmissions des principales protéines du lactosérumqui sont chargées négativement. Ainsi, dans cette configuration à 3333 V m" 1 , des facteursde séparation de 3,0 et de 9,0 entre la LF et respectivement la (3-lactoglobuline et l'otlactalbumineont été obtenus. Par contre, des interactions électrostatiques entre la LF et laP-LG nuiraient à la séparation de ces deux protéines. D'autre part, l'application d'un champélectrique dans ces conditions a aussi permis d'augmenter le flux de perméation d'unfacteur 3 par rapport au flux de perméation obtenu par microfiltration du mélange sanschamp électrique. Ces résultats suggèrent que l'application d'un champ électrique constitueune stratégie efficace pour diminuer les phénomènes de concentration de polarisation et ducolmatage de la membrane. Toutefois, des réactions électrolytiques qui causent desmodifications de pH, particulièrement du côté du perméat, ont été observées et semblentnuire à la séparation lorsque la force du champ électrique appliqué augmente.

124Le quatrième objectif consistait à étudier l'impact du niveau de saturation en fer de la LFsur sa transmission en microfiltration assistée par un champ électrique en présence deprotéines du lactosérum. Lorsque saturée en fer, la LF adopte une structure plus compactequi permet d'augmenter sa transmission en microfiltration conventionnelle. La saturationen fer de la LF influence aussi de façon marquée sa transmission en microfiltration assistéepar un champ électrique. Avec la cathode du côté rétentat, les facteurs de séparation entre laholo-LF et la P-lactoglobuline et l'a-lactalbumine sont respectivement de 6,7 et de 62,4 à1667 V m' 1 .7.2 Importance des résultatsLes résultats obtenus concernant le premier volet de cette thèse ont un impact important surla compréhension des mécanismes impliqués lors de l'agrégation thermique de la LF et quiaffectent sa récupération dans le lactosérum. Ces résultats ont permis de mettre en évidencel'impact important de la saturation en fer de la LF sur la stabilité de la protéine à la chaleuret plus particulièrement sur la stabilité de ses ponts disulfures intramoléculaires en cours dechauffage. Puisque les ponts disulfures contribuent de façon importante au maintien de laconformation de la protéine, le bris de ces liaisons peut avoir un impact négatif sur lespropriétés fonctionnelles et les activités biologiques de la LF. De plus, considérant lanécessité des traitements thermiques appliqués au lait de consommation et celui utilisé pourla transformation dans l'industrie laitière, ces résultats apportent un éclairage nouveau surles conditions optimales de récupération de la LF dans le lactosérum. Cette récupération dela LF serait optimale à partir du lactosérum obtenu à partir de lait cru.Dans le second volet, les observations faites en microfiltration assistée par un champélectrique ont permis de repousser les limites associées à la filtration conventionnelle.D'une part, il est possible de tirer profit de différences de charges pour augmenter lasélectivité de séparation et d'autre part, il possible de diminuer l'impact négatif relié à la

125concentration de polarisation et au colmatage de la membrane. Cette étude démontre aussile potentiel de ce nouveau procédé de filtration assistée d'un champ électrique pour lefractionnement de la LF, une protéine possédant de multiples activités biologiques, à partirde solutions plus complexes comme le lactosérum de fromagerie.7.3 PerspectivesL'étude de la stabilité thermique de la LF ouvre la voie à d'autres recherches pour validerl'impact des traitements thermiques utilisés par l'industrie fromagère tels que lathermisation et la pasteurisation HTST sur l'association de la LF et sa récupération dans lelactosérum de fromagerie. L'élargissement des connaissances concernant l'influencespécifique du procédé fromager (coagulation acide, coagulation à la présure, ou coagulationmixte) sur la récupération de la LF est également une voie intéressante à explorer pourdissocier l'effet du traitement thermique de l'effet du procédé fromager. Étant donnél'impact important du niveau de saturation en fer sur les propriétés physico-chimiques de laLF, il serait intéressant de vérifier s'il est possible de modifier in situ dans le lait son niveaude saturation en fer par l'ajout de sel comprenant des ions ferriques. Bien que l'influencedes changements induits par le chauffage du lait et du degré de saturation en fer sur lespropriétés biologiques de la LF étaient en dehors des objectifs de nos travaux, ces aspectsdevront être abordés dans des études ultérieures, et ce, afin de s'assurer que les procédés defractionnement de la LF lui procurent la valeur ajoutée attendue. De même, l'utilisation denouveaux procédés pour assurer l'innocuité du lait tels que la microfïltration et lestraitements haute-pression pourraient constituer des alternatives intéressantes auxtraitements thermiques du lait lorsque le fractionnement de la LF est visé.Concernant le deuxième volet de cette étude, pour diminuer l'impact négatif des réactionsélectrolytiques observées aux électrodes, diverses stratégies mériteraient d'être explorées.Premièrement, les paramètres du champ électrique et la force ionique pourraient être

126optimisés de façon à limiter ces réactions. Deuxièment, la protection des électrodes par desmembranes échangeuses d'ions pourrait permettre de limiter le contact des produits deréactions électrolytiques avec les solutions du rétentat et du perméat. L'évaluation de laperformance de ce procédé en différents modes de filtration, tels que les modesconcentration et diaflltration en continu est indiquée pour valider le potentiel à plus grandeéchelle du procédé de filtration assistée par un champ électrique de la LF à partir dulactosérum. Il faudrait également étudier l'état d'association de la LF dans le lactosérum ettrouver un moyen efficace de contrôler les interactions protéine-protéine en solution sansnuire à l'efficacité du champ électrique appliqué. L'impact des réactions d'oxydo-réductionaux électrodes sur les propriétés de la LF devrait également faire l'objet d'une étude plusapprofondie.

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