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UNIVERSITY OF DEFENSE :Université Paul Sabatier (Toulouse, France). Ecole nationalevétérinaire (Toulouse)PhD Thesis, 2009Experimental infection by viruses Bovine viral diarrhea (BVDV) : Evaluation offetal protection live vaccine induced attenuatedABSTRACTBVD virus is a pathogen of news, causing various disorders grouped under the name of syndromeBVD / MD, Bovine Viral Diarrhea or syndrome / disease of mucous membranes. The pathogenesis ofthe infection is characterized by the possibility of vertical transmission in utero, may give rise toindividuals playing a key role in the spread of the disease, not only within but also between breedingherd. Main control used, vaccination should now not only protect individuals against horizontaltransmission standard, but especially against a fetal transmission epidemiological consequencesmuch more serious. The presented work aims to study the effectiveness of fetal protection of a liveattenuated vaccine (Mucosiffa ®, Merial) against a challenge inoculation with BVDV. In fact today, theAMM of this vaccine only contains the indication "clinical protection" against horizontal transmission.The first part will summarize the bibliographic data currently available on the BVD virus, theepidemiology of the disease, especially the control methods available. Then in the second part wepresent the experimental set up in order to achieve our goals, the results obtained at the end of thestudy, as well as interpretation and discussion of these data.KEYWORDS : Bovine virus diarrhea, Vaccine, Experimental infectionRESUMELe virus BVD est un agent pathogène d’actualité, à l’origine de troubles divers regroupés sous le nomde syndrome BVD / MD, ou syndrome Diarrhée Virale Bovine / Maladie des Muqueuses. Lapathogénie de l’infection est caractérisée par la possibilité d’une transmission verticale in utero,pouvant donner naissance à des individus jouant un rôle clé dans la propagation de la maladie, nonseulement au sein du troupeau mais aussi entre élevages. Principal moyen de lutte utilisé, lavaccination doit aujourd’hui non seulement protéger les individus contre une transmissionhorizontale classique, mais aussi et surtout contre une transmission foetale aux conséquencesépidémiologiques beaucoup plus graves. Le travail présenté a pour objectif d’étudier l’efficacité de laprotection foetale d’un vaccin vivant atténué (Mucosiffa®, Mérial) contre une inoculation d’épreuveà virus BVD. En effet à l’heure actuelle, l’AMM de ce vaccin ne contient que l’indication « protectionclinique » contre les transmissions horizontales. La première partie synthétisera les donnéesbibliographiques actuellement disponibles concernant le virus BVD, l’épidémiologie de la maladie, etsurtout les moyens de lutte disponibles. Puis nous présenterons en seconde partie le protocoleexpérimental mis en place afin d’atteindre nos objectifs, les résultats obtenus à l’issue de l’étude,ainsi qu’une interprétation et une discussion de ces différentes données.MOTS CLE : BVD, Vaccination, Infection expérimentale…/…1

TABLE OF CONTENTI) Le virus de la Diarrhée Virale Bovine : présentationA) Historique et importanceB) TaxonomieC) Propriétés structurales et organisation génomiqueD) Propriétés biologiques1) Sensibilité du virus2) Variabilité génétique3) Notion de biotypeII)Pathogenèse, expression clinique et conséquencesépidémiologiquesA) Infection hors gestation1) Pathogenèse2) Expression cliniquea) Forme subcliniqueb) Troubles digestifs(i) Diarrhée virale bovine aiguë bénigne(ii) Entérite diarrhéique néonatalec) Troubles de la reproductiond) Autres troubles(i) Syndrome hémorragique(ii) Troubles respiratoiresB) Infection d’une femelle gravide1) Pathogenèse et signes cliniques associésa) Conséquences en fonction du stade de gestation(i) Infection pendant le premier mois(ii) Infection entre 1 et 5 mois(iii) Infection entre 3 et 5 mois(iv) Infection entre 5 et 9 mois(v) Infection quelques jours avant la mise bas(vi) Cas particulier de l’infection entre 1 et 4 mois de gestation (40-120 jours)b) Bilan des troubles observés2) Cas de la maladie des muqueuses au sens stricta) Pathogenèseb) Expression clinique(i) Forme aiguë de la maladie des muqueuses(ii) Forme chronique de la maladie des muqueusesC) Conséquences épidémiologiques de l’immunotolérance1) Les bovins IPI : principale source de virus à l’échelle individuelle2) Les bovins IPI : origine de la contamination à l’échelle du troupeau3) Les bovins IPI : maintien de la circulation virale au sein du troupeau2

III)Les moyens de lutte contre la Diarrhée Virale BovineA) Mesures sanitaires1) Elimination des IPI2) Stratégies collectivesa) Contrôles à l’introductionb) Certification des cheptelsc) Garantie d’animaux non IPIB) Mesures médicales : la vaccination1) Objectifs de la vaccination contre le BVDVa) Protection cliniqueb) Protection foetale2) Les vaccinsa) Vaccins vivantsb) Vaccins inactivésc) Caractéristiques des vaccins commercialisés en France3) Performances des vaccinsa) Innocuitéb) Efficacité vaccinale(i) Protection clinique post-natale(ii) Protection foetale(iii) Protection hétérologue(iv) Durée d’immunitéc) Performances des vaccins utilisés en FranceC) Les différentes stratégies de lutte contre le virus BVD1) Echelle individuellea) Cas des élevages à circulation virale démontréeb) Cas des élevages sains à risque2) Echelle collectiveETUDE EXPERIMENTALEI) Objectifs de l’étudeII) Matériel et méthodesA) AnimauxB) VaccinationC) Reproduction et sélection des vaches gravidesD) InoculationE) Abattage des génissesF) Paramètres étudiés1) Suivi sérologiquea) Utilisation de kits ELISAb) Séroneutralisation2) Suivi clinique et hématologiquea) Suivi clinique, pendant les 20 jours post-inoculationb) Suivi des avortements, de l’inoculation jusqu’à l’abattagec) Suivi hématologique, pendant les 20 jours post-inoculation3) Suivi virologiquea) Dans le sang des génisses, pendant les 20 jours post-inoculation3

L’amplification a été répétée quarante fois.L’analyse des résultats a été réalisée à l’aide du logiciel LightCycler 480b) Dans les tissus foetaux, après abattage des génissesIII) RésultatsA) Résultats de reproductionB) Résultats sérologiques1) Kits ELISA2) Détection des anticorps neutralisantsC) Suivi des avortementsD) Etude de la réponse cliniqueE) Résultats hématologiquesF) Suivi virologique1) Dans le sang des génisses2) Dans les tissus foetauxIV) DiscussionCONCLUSIONREFERENCES BIBLIOGRAPHIQUESLISTE DES ABREVIATIONSAMM : Autorisation de Mise sur le MarchéBDV : Border Disease VirusBVD : Bovine Viral DiarrheaBVDV : Bovine Viral Diarrhea VirusCP : CytoPathogèneCSFV : Classical Swine Fever VirusCt : threshold Cycle (=cycle seuil)DICC : Dose Infectieuse Concentration CellulaireED : Effective DoseEDTA : Ethylène Diamine Tetra-AcétateELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayIA : Insémination ArtificielleIPI : Infecté Permanent Immunotolérantkb : kilobasekDa : kilodaltonMD : Mucosal DiseaseMDBK : Madin-Darby Bovine KidneyMEM : Minimum Essential MediumMM : Maladie des MuqueusesnCP : non CytoPathogènenm : nanomètreNS : Non StructuralesPCR : Polymerase Chain ReactionPGF2α : Prostaglandine F2αPMSG : ancien nom de l’eCG (equine Chorionic Gonadotrophin)PSPB : Pregnant Specific Protein BRT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain ReactionTCID : Toxic Cell Infectious Dose4

LISTE DES FIGURESFigure 1 : Organisation génomique du virus BVDFigure 2 : Superposition partielle des trois conséquences d'une infection par le BVDVpendant les deux premiers trimestres de la gestationFigure 3 : Conséquences de l’infection par le BVDV en fonction du stade de gestationFigure 4 : Diagramme du protocole expérimental de l'étudeFigure 5 : Evolution de la moyenne des titres en anticorps neutralisantsFigure 6 : Evolution du nombre de leucocytes après infectionFigure 7 : Evolution du nombre de lymphocytes après infectionFigure 8 : Evolution de la virémie après infectionLISTE DES TABLEAUXTableau 1 : Caractéristiques des biotypes CP et nCPTableau 2 : Caractéristiques des souches vaccinales utilisées en FranceTableau 3 : Efficacité de protection foetale des vaccins commercialisés en FranceTableau 4 : Bilan des résultats de reproductionTableau 5 : Charges virales sur tissus foetaux le jour de l’abattageLISTE DES PHOTOGRAPHIESPhoto 1 : Inoculum conservé dans la glacePhoto 2 : Contention et inoculation intranasale=========================5