Etude chimique et toxicologique des principes toxiques des extr

UNIVERSITE DE MADAGASCAR 

FACULTE DES SCIENCES 

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE 

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES DE 

BIOCHIMIE 

Option : BIOCHIMIE APPLIQUEE AUX SCIENCES MEDICALES 

ETUDE CHIMIQUE ET TOXICOLOGIQUE DES EXTRAITS 

TOXIQUES DE FEUILLES DE Xylopia humblotiana 

(ANNONACEAE) 

Présenté par : 

RASOLONDRAIBE Onjasoa Nambinina 

épouse RAMANANTOANINA 

Maître ès-sciences 

Soutenu publiquement le : 21 Septembre 2007 

Devant la commission de jury composée de : 

Présidente 

Rapporteur 

Examinateurs 

: Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette 

: Professeur JEANNODA Victor 

: Docteur RANDRIANIERENANA Ando 

: Docteur RAVONINJATOVO Marc

UNIVERSITE DE MADAGASCAR 

FACULTE DES SCIENCES 

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE 

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES DE 

BIOCHIMIE 

Option : BIOCHIMIE APPLIQUEE AUX SCIENCES MEDICALES 

ETUDE CHIMIQUE ET TOXICOLOGIQUE DES EXTRAITS 

TOXIQUES DE FEUILLES DE Xylopia humblotiana 

(ANNONACEAE) 

Présenté par : 

RASOLONDRAIBE Onjasoa Nambinina 

épouse RAMANANTOANINA 

Maître ès-sciences 

Soutenu publiquement le : 21 Septembre 2007 

Devant la commission de jury composée de : 

Présidente 

Rapporteur 

Examinateurs 

: Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette 

: Professeur JEANNODA Victor 

: Docteur RANDRIANIERENANA Ando 

: Docteur RAVONINJATOVO Marc

A la mémoire de notre petite IFALIANA et de sa grand-mère,.vous 

qui auriez voulu être parmi nous en ce jour,... 

A mon très cher époux pour l’équilibre que tu apportes dans ma vie 

et pour tous tes encouragements... 

A mes parents et mon beau-père, que vous trouviez en ce travail le 

fruit de votre patience et de vos sacrifices, 

A mes sœurs, mes belles-sœurs, mon frère et mes beaux-frères, 

pour toute votre affection et votre compréhension,...

i 

REMERCIEMENTS 

Notre stage a été réalisé au sein des laboratoires LABASM (LAboratoire de Biochimie 

Appliquée aux Sciences Médicales) et LMA (Laboratoire de Microbiologie Appliquée) du 

Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée de la Faculté des Sciences. 

Ce travail ne serait jamais parvenu à terme sans le concours de nombreuses personnes. 

Nos vifs remerciements vont à l’endroit de : 

Monsieur le Professeur JEANNODA Victor, Chef de Département de Biochimie 

Fondamentale et Appliquée et Chef de Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences 

Médicales, pour nous avoir accueillie dans son laboratoire, mais aussi pour avoir bien voulu 

prêter intérêt à ce travail et accepter d’en être le rapporteur, malgré ses lourdes et multiples 

tâches, 

Madame le Docteur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle. A. Doll, pour nous 

avoir guidée tout au long de nos stages et pour la qualité de son encadrement, 

Madame le Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette qui, malgré ses 

nombreuses responsabilités, nous a fait le grand honneur d’accepter de présider le jury de ce 

mémoire, qu’elle trouve par le présent mémoire l’expression de notre profonde gratitude, 

Madame le Docteur RANDRIANIERENANA Ando et Monsieur le Docteur 

RAVONINJATOVO Marc, qui ont eu l’amabilité d’apporter leur compétence dans le 

jugement de ce travail, malgré leurs emplois du temps bien remplis, 

Nous tenons à remercier également, 

le Docteur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna et Madame RAKOTOBE 

Lolona, pour les nombreux conseils qu’ils nous ont prodiguée au cours de nos stages, 

Tous nos collègues, pour l’entraide qui n’a pas été vaine, 

la famille RANDIMBIARISON, qui a bien voulu apporter son aide dans l’élaboration 

de ce mémoire, 

Tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la finalisation de ce travail et tous 

ceux qui ont souhaité nous voir arriver à ce stade.

ii 

LISTE DES ABRÉVIATIONS 

ANP 

B/A/E 

CCM 

CL 50 

CNARP 

DL 50 

E 3 

EB 

FOFIFA 

h 

IMVAVET 

IPM 

LABASM 

LMA 

min 

PBS 

PVP 

trs 

UV 

: Acétate Neutre de Plomb 

: Butanol/Acide acétique/Eau 

: Chromatographie sur Couche Mince 

: Concentration qui tue 50% des animaux testés en 24h 

: Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques 

: Dose létale tuant 50% des souris testées en 24h 

: Extrait purifié 

: Extrait brut 

: FOibem-pirenena momba ny FIkarohana ampiharina ho amin’ny 

Fampandrosoana ny eny Ambanivohitra 

: heure 

: Institut Malgache des Vaccins Vétérinaires 

: Institut Pasteur de Madagascar 

: Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales 

: Laboratoire de Microbiologie Appliquée 

: minute 

: Phosphate Buffered Saline (tampon phosphate) 

: Polyvinylpyrrolidone 

: tours 

: ultra-violet

iii 

GLOSSAIRE 

Contorsion abdominale 

Enophtalmie 

Hyperhémie 

Ichtyotoxique 

Néphrotoxique 

Piloérection 

: étirement de l’animal avec torsions du corps. 

: enfoncement des globes oculaires. 

: augmentation de la quantité de sang tissulaire exprimée par une 

coloration rouge suite à une dilatation des vaisseaux sanguins. 

: toxique pour les poissons. 

: toxique au niveau du rein. 

: hérissement des poils.

iv 

TABLE DES MATIÈRES 

Page 

Remerciements.............................................................................................................................i 

Liste des abréviations..................................................................................................................ii 

Glossaire.................................................................................................................................... iii 

Table des matières......................................................................................................................iv 

Liste des figures......................................................................................................................... ix 

Liste des tableaux.......................................................................................................................xi 

INTRODUCTION GENERALE................................................................................ 4 

ETUDE CHIMIQUE................................................................................................... 4 

INTRODUCTION................................................................................................................. 4 

MATÉRIELS ET MÉTHODES..................................................................................................4 

I.1.MATÉRIELS....................................................................................................................... 4 

I.1.1.Matériel végétal...................................................................................................... 4 

I.1.1.1.Position systématique ..................................................................................... 4 

I.1.1.2.Description botanique......................................................................................5 

I.1.1.2.1.Description du genre Xylopia ............................................................................ 5 

I.1.1.2.2.Description de l’espèce Xylopia humblotiana..................................................... 5 

I.1.1.3.Distribution géographique .............................................................................. 6 

I.1.1.4.Date et lieu de récolte...................................................................................... 6 

I.1.1.5.Préparation et conservation du matériel végétal..............................................6 

I.1.2.Les produits chimiques........................................................................................... 6 

I.2.METHODES........................................................................................................................9 

I.2.1.Méthodes d’extraction des principes toxiques........................................................9 

I.2.1.1.Extraction à froid............................................................................................. 9 

I.2.1.2.Extraction à chaud........................................................................................... 9 

I.2.2.Méthodes de purification...................................................................................... 10 

I.2.2.1.Précipitation par l’éthanol 50%..................................................................... 10 

I.2.2.1.1.Principe............................................................................................................. 10 

I.2.2.1.2.Mode opératoire................................................................................................ 10 

I.2.2.2.Fractionnement par l’acétate d’éthyle............................................................10 

I.2.2.2.1.Principe............................................................................................................. 10

v 


I.2.2.3.Fractionnement par le n-butanol....................................................................11 

I.2.2.3.1.Principe............................................................................................................. 11 


I.2.2.4.Précipitation par l’acétone 50%.....................................................................11 

I.2.2.4.1.Principe............................................................................................................. 11 


I.2.2.5.Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)........................................11 

I.2.2.5.1.Principe............................................................................................................. 11 


I.2.2.6.Dialyse........................................................................................................... 12 

I.2.2.6.1.Principe ............................................................................................................ 12 


I.2.2.6.2.1.Préparation de la membrane de dialyse...................................................... 13 

I.2.2.6.2.2.Mise en route de la dialyse......................................................................... 13 

I.2.2.7.Filtration sur charbon actif.............................................................................13 

I.2.2.7.1.Principe............................................................................................................. 13 


I.2.3.Méthode de concentration.....................................................................................14 

I.2.4.Calcul du rendement............................................................................................. 14 

I.2.5.Méthodes d’analyse.............................................................................................. 14 

I.2.5.1.Chromatographie sur couche mince ............................................................. 14 

I.2.5.1.1.Principe............................................................................................................. 14 


I.2.5.1.2.1.Dépôt des échantillons............................................................................... 14 

I.2.5.1.2.2.Développement du chromatogramme........................................................ 15 

I.2.5.1.2.3.Révélation du chromatogramme................................................................ 15 

I.2.5.2.Criblage phytochimique.................................................................................15 

I.2.5.2.1.Préparation des extraits à tester......................................................................... 15 

I.2.5.2.1.1.Extrait aqueux............................................................................................ 15 

I.2.5.2.1.2.Extrait hydroalcoolique.............................................................................. 16 

I.2.5.2.1.3.Extrait acide............................................................................................... 16 

I.2.5.2.1.4.Extrait chloroformique............................................................................... 16 

I.2.5.2.2.Principes et méthodes........................................................................................ 16 

I.2.5.2.2.1.Alcaloïdes.................................................................................................. 16 

I.2.5.2.2.2.Flavonoïdes et leucoanthocyanes............................................................... 17

vi 

I.2.5.2.2.3.Stéroïdes et triterpènes............................................................................... 17 

I.2.5.2.2.4.Saponines................................................................................................... 18 

I.2.5.2.2.5.Tanins........................................................................................................ 18 

I.2.5.2.2.6.Anthraquinones (Test de BORNTRÄGER)............................................... 19 

I.2.5.2.2.7.Désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI)................................................. 19 

I.2.5.2.2.8.Iridoïdes..................................................................................................... 19 

RÉSULTATS....................................................................................................................19 

I.3.PRÉPARATION DES EXTRAITS TOXIQUES.................................................................................20 

I.3.1.Extraction..............................................................................................................20 

I.3.2.Purification .......................................................................................................... 21 

I.3.2.1.Méthodes adoptées dans le protocole de purification ...................................21 

I.3.2.1.1.Précipitation par l’éthanol 50%......................................................................... 21 

I.3.2.1.2.Fractionnement par l’acétate d’éthyle............................................................... 21 

I.3.2.1.3.Fractionnement par le n-butanol........................................................................ 22 

I.3.2.2.Méthodes non adoptées dans le protocole de purification.............................22 

I.3.2.2.1.Précipitation par l’acétone 50%........................................................................ 22 

I.3.2.2.2.Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)............................................ 22 

I.3.2.2.3.Dialyse.............................................................................................................. 22 

I.3.2.2.4.Traitement par le charbon actif......................................................................... 22 

I.4.ANALYSE DES EXTRAITS PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE....................................... 24 

I.5.RENDEMENT DE PURIFICATION............................................................................................ 25 

I.6.CARACTERISATION CHIMIQUE..............................................................................................25 

I.6.1.Propriétés physico-chimiques...............................................................................25 

I.6.2.Nature chimique....................................................................................................25 

DISCUSSION ET CONCLUSIONS........................................................................................... 27 

ETUDE TOXICOLOGIQUE.................................................................................... 29 

INTRODUCTION............................................................................................................... 29 

MATÉRIELS ET MÉTHODES................................................................................................29 

I.1.MATÉRIELS..................................................................................................................... 29 

I.1.1.Les animaux d’expérimentation............................................................................29 

Les animaux à sang chaud : les souris...................................................................... 29

vii 

Les animaux à sang froid.......................................................................................... 29 

I.1.1.1.1.Les têtards......................................................................................................... 29 

I.1.1.1.2.Les poissons...................................................................................................... 30 

I.1.1.1.3.Les larves de moustique.................................................................................... 30 

Les hématies de mouton............................................................................................30 

I.1.2.Les plantes d’expérimentation..............................................................................30 

I.1.3.Les microorganismes............................................................................................ 31 

Les souches............................................................................................................... 31 

Les milieux de culture...............................................................................................31 

I.2.MÉTHODES......................................................................................................................31 

I.2.1.Méthodes d’étude des effets sur les animaux....................................................... 31 

Etude des effets sur les animaux à sang chaud......................................................... 31 

I.2.1.1.1.Etude de la toxicité sur souris .......................................................................... 31 

I.2.1.1.1.1.Estimation de la toxicité............................................................................. 31 

I.2.1.1.1.2.Détermination de la DL50......................................................................... 31 

I.2.1.1.2.Etude du pouvoir hémolytique des extraits....................................................... 32 

I.2.1.1.2.1.Principe...................................................................................................... 32 

I.2.1.1.2.2.Mode opératoire......................................................................................... 33 

Etude des effets sur les animaux à sang froid........................................................... 34 

I.2.1.1.3.Effets sur les têtards et les alevins..................................................................... 34 

I.2.1.1.3.1.Expérience sur les têtards de grenouille..................................................... 34 

I.2.1.1.3.2.Expérience sur les alevins de carpe............................................................ 34 

I.2.1.1.3.3.Détermination de la CL50.......................................................................... 34 

I.2.1.1.4.Méthode d’étude des effets sur les larves de moustique.................................... 35 

I.2.2.Méthodes d’étude des effets sur les végétaux.......................................................35 

Effets sur le pouvoir germinatif des graines............................................................. 35 

Effets sur la croissance des jeunes plantules.............................................................35 

I.2.2.1.1.Trempage.......................................................................................................... 35 

I.2.2.1.2.Germination...................................................................................................... 36 

Effets sur la levée de la dominance apicale des bourgeons axillaires.......................36 

I.2.3.Etude des effets sur les microorganismes.............................................................36 

Stérilisation............................................................................................................... 36 

Coloration GRAM.....................................................................................................37 

I.2.3.1.1.Principe............................................................................................................. 37 

I.2.3.1.2.Mode opératoire................................................................................................ 37

viii 

I.2.3.1.2.1.Préparation et fixation................................................................................ 38 

I.2.3.1.2.2.Coloration.................................................................................................. 38 

Tests de sensibilité des microorganismes aux extraits..............................................38 

I.2.3.1.3.Antibiogramme ou test de diffusion sur gélose................................................. 38 

I.2.3.1.3.1.Principe...................................................................................................... 38 

I.2.3.1.3.2.Mode opératoire......................................................................................... 39 

I.2.3.1.4.Détermination de la CMI ................................................................................. 39 

RÉSULTATS....................................................................................................................40 

I.2.4.Effets des extraits sur les animaux........................................................................40 

Effets des extraits sur les animaux à sang chaud...................................................... 40 

I.2.4.1.1.Toxicité sur souris............................................................................................. 40 

I.2.4.1.1.1.Description des symptômes d’intoxication................................................ 40 

I.2.4.1.1.2.Détermination de la DL50 (24h)................................................................ 41 

I.2.4.1.2.Pouvoir hémolytique des extraits...................................................................... 42 

Effets sur les animaux à sang froid........................................................................... 43 

I.2.4.1.3.Effets de l’extrait brut sur les têtards et les alevins........................................... 43 

I.2.4.1.3.1.Effets sur les têtards de grenouille............................................................. 43 

I.2.4.1.3.2.Effets sur les alevins de carpe.................................................................... 44 

I.2.4.1.4.Effets de l’extrait brut sur les larves de moustique............................................ 45 

I.2.5.Effets sur les végétaux.......................................................................................... 45 

Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif de graines..................................... 45 

Effets de l’extrait brut sur la croissance des jeunes plantules...................................47 

Effets des extraits sur la croissance des bourgeons axillaires...................................53 

I.2.6.Effets sur les microorganismes.............................................................................53 

Identification des germes-tests..................................................................................53 

Sensibilité des microorganismes aux extraits........................................................... 54 

I.2.6.1.1.Activité antibactérienne des extraits.................................................................. 54 

I.2.6.1.2.Détermination de la CMI.................................................................................. 56 

DISCUSSION ET CONCLUSIONS........................................................................................... 58 

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES.............................................. 61 

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBBOGRAPHIQUES................ 62 

ANNEXES.................................................................................................................. 68

ix 

LISTE DES FIGURES 

Page 

Figure 1 : Pied de Xylopia humblotiana..................................................................... 7 

Figure 2 : Feuilles de Xylopia humblotiana............................................................... 7 

Figure 3 : Répartition géographique de Xylopia humblotiana................................. 8 

Figure 4 : Schéma récapitulatif des étapes d'extraction et de purification des 

principes toxiques de Xylopia humblotiana............................................................. 23 

Figure 5 : Chromatogramme récapitulatif montrant l'évolution de l'homogénéité 

des différents extraits................................................................................................. 24 

Figure 6 : Courbes de détermination graphique de la DL50 (REED et MUENCH, 

1938)............................................................................................................................ 42 

Figure 7 : Résultats du test hémolytique.................................................................. 43 

Figure 8 : Schéma récapitulatif de l’expérience sur la croissance des jeunes 

plantules...................................................................................................................... 47 

Figure 9 : Croissance des épicotyles de haricot en fonction du trempage............. 48 

Figure 10 : Croissance des hypocotyles de haricot en fonction du trempage........ 49 

Figure 11 : Croissance des épicotyles de riz en fonction du trempage................... 49 

Figure 12 : Croissance des hypocotyles de riz en fonction du trempage................50 

Figure 13 : Effets de l’extrait brut à différentes concentrations sur la croissance 

des épicotyles de haricot............................................................................................ 50 


des hypocotyles de haricot......................................................................................... 51 


des épicotyles de riz.................................................................................................... 51

x 


des hypocotyles de riz................................................................................................ 52 

Figure 17 : Effets des différentes substances sur la croissance des bourgeons 

axillaires...................................................................................................................... 53 

Figure 18 : Résultat du test d’activité des extraits sur Klebsiella pneumoniae..... 54 

Figure 19 : Résultat du test d’activité des extraits sur Staphylococcus aureus..... 55 

Figure 20 : Résultat de la détermination de la CMI de l’extrait brut pour 

Klebsiella pneumoniae............................................................................................... 56 

Figure 21 : Résultat de la détermination de la CMI de l’extrait E3 pour Klebsiella 

pneumoniae................................................................................................................ 57

xi 

LISTE DES TABLEAUX 

Page 

Tableau 1 : Caractéristiques des extraits bruts obtenus par les différentes 

méthodes d'extraction................................................................................................ 20 

Tableau 2 : Résultats du criblage phytochimique de l'extrait brut et de l'extrait 

E3................................................................................................................................ 26 

Tableau 3 : Végétaux utilisés pour l’étude toxicologique des extraits....................30 

Tableau 4 : Composition du milieu pour le test hémolytique................................. 33 

Tableau 5 : Références normatives des diamètres d’inhibition.............................. 39 

Tableau 6 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24h) sur 

souris de l’extrait E3.................................................................................................. 41 

Tableau 7 : Totaux cumulatifs des souris survivantes et des souris mortes en 

fonction de la dose...................................................................................................... 42 

Tableau 8 : Résultats expérimentaux de la détermination de la CL50 sur les 

têtards de grenouille.................................................................................................. 44 

Tableau 9 : Résultats expérimentaux de la détermination de la CL50 sur les 

alevins de carpe.......................................................................................................... 45 

Tableau 10 : Effets de l’extrait brut à 1mg/ml sur le pouvoir germinatif de 

graines......................................................................................................................... 46 

Tableau 11 : Croissance des jeunes plantules en présence de EB à différentes 

concentrations : pourcentage d’inhibition au 14ème jour...................................... 52 

Tableau 12 : Caractéristiques des germes-tests....................................................... 54 

Tableau 13 : Résultats des tests d’activité par la méthode des disques en milieu 

solide........................................................................................................................... 55

xii 

Tableau 14 : Résultats de la mesure de la CMI par la méthode des disques en 

milieu solide ............................................................................................................... 57

INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale 

1 

Un poison ou toxique peut être défini comme étant une substance qui, une fois 

introduite dans un organisme vivant, est capable de perturber son fonctionnement normal ou 

de le tuer. Il peut être naturel, auquel cas il s’agit d’une toxine d’origine animale, végétale ou 

microbienne, ou artificiel. 

Depuis des millénaires, une longue expérience a été accumulée par des générations 

d’hommes et de femmes vivant en contact étroit avec la nature. Ils ont su tirer profit des 

propriétés toxiques de certains organismes et les utiliser à diverses fins. Ainsi, les poisons 

sont employés : 

• pour la pêche : les principes actifs d’Euphorbia laro sont très toxiques pour les 

poissons (RAHERINIAINA, 2004) ; 

• pour la chasse : certains indiens d’Amérique confectionnent des flèches 

empoisonnées grâce aux plantes à curare comme Chondrodendron tomentosum 

(BRUNETON, 1987) ; 

• pour la lutte contre les animaux nuisibles comme les chiens errants, les rats, etc… 

• pour le traitement de certaines maladies comme le cancer, le paludisme ; 

• pour nuire à autrui : les tentatives de suicide, les empoisonnements criminels et les 

pratiques de sorcellerie sont le plus souvent rencontrés. 

L’essor d’autres disciplines scientifiques comme la chimie, la biochimie, la 

physiologie, la pharmacologie ainsi que la médecine, a permis à la toxicologie, reconnue 

comme étant la science des poisons, de se développer et d’approfondir les connaissances sur 

plusieurs toxines d’origines diverses. Leur nature chimique et leurs propriétés (ou 

mécanismes d’action) sont bien connues. Ainsi : 

• l’ochratoxine A, une mycotoxine néphrotoxique (toxique au niveau du rein) produite 

par plusieurs espèces de champignons, a un pouvoir cancérigène au niveau des reins 

des animaux et est potentiellement cancérigène pour l’homme (FAUCET- 

MARQUIS, 2005) ; 

• les neurotoxines des cobras agissent au niveau de la plaque motrice et bloquent la 

conduction neuromusculaire (BELLEFLEUR et DANTEC, 2005) ; 

• la toxine botulinique produite par Clostridium botulinum agit sur un récepteur de la 

membrane des vésicules présynaptiques pour les stabiliser et les empêcher de libérer 

l’acétylcholine dans la fente synaptique, produisant ainsi la faiblesse et la paralysie 

musculaire (FEISS, 2003) ; 

Par ailleurs, la connaissance des propriétés des toxines a permis d’une part de


2 

comprendre les nombreux phénomènes biologiques, et d’autre part d’élucider certaines voies 

métaboliques. Mais elles sont surtout utilisées à des fins thérapeutiques. A titre d’illustration, 

on peut énumérer quelques substances telles que : 

• la morphine extraite de la plante Papaver somniferum, qui est utilisée comme 

analgésique et constitue donc un outil biomédical important (BRUNETON, 1993) ; 

• la thuringiolysine extraite de Bacillus thuringiensis, qui exerce ses effets sur un 

composant membranaire qu’est le cholestérol, ce qui provoque la désorganisation de 

la structure membranaire. Elle constitue donc une sonde moléculaire pour l’étude de 

l’organisation des membranes biologiques (RAKOTOBE, 1985) ; 

• la colchicine, alcaloïde aux propriétés antimitotiques, qui empêche la division 

cellulaire par inhibition de la polymérisation des constituants des microtubules. 

Cette inhibition ralentit le chimiotactisme des leucocytes pour les dépôts synoviaux 

et articulaires des cristaux d’urate monosodique, lors de la crise aiguë de la goutte. 

Elle est ainsi utilisée dans le traitement de cette crise (SCHORDERET et DAYER, 

1998) ; 

• la toxine tétanique (neurotoxine clostridiale), qui grâce à l’expression de sa chaîne 

légère dans les cellules épithéliales, a permis de mettre en évidence que la 

cellubrévine, une protéine transmembranaire, joue un rôle important dans la 

migration cellulaire (GALLI et PROUX-GILLARDEAUX, 2005) ; 

• la ciguatoxine produite par les Dinoflagellés de genre Gambierdiscus, qui entraîne 

une dépolarisation de la membrane dans les tissus nerveux. Son utilisation a permis 

d’élucider certaines voies métaboliques au niveau du système nerveux (CHATEAU- 

DEGAT, 2003) ; 

• les cardénolides contenus dans les graines de Thevetia neriifolia, qui ont été utilisés 

en thérapeutique (BRUNETON, 1993). 

D’après la littérature, de nombreuses plantes malgaches sont réputées toxiques 

(PERNET et MEYER, 1957 ; DEBRAY et coll., 1971 ; BOITEAU, 1979 ; RAKOTO- 

RATSIMAMANGA, 1998). Pourtant, la plupart d’entre elles n’ont pas encore fait l’objet 

d’études approfondies. C’est la raison pour laquelle l’unité de toxicologie du Département de 

Biochimie Fondamentale et Appliquée a orienté ses travaux de recherche vers l’étude 

chimique et biologique des principes toxiques de plantes. Nombreuses sont les plantes 

prospectées dans ces travaux de recherche, entre autres :


3 

• des Connaracées, Rourea orientalis (RAKOTO-RANOROMALALA, 1984) ainsi 

que Cnestis polyphylla et C. glabra (JEANNODA, 1986) ; 

• des Cucurbitacées, Xerosicyos danguyi (RAKOTONDRAZANAKA, 1999), 

Xerosicyos perrieri (RANDRIAMIHARISOA, 2000) ; 

• des Euphorbiacées, Euphorbia laro (RAHERINIAINA, 2004) et Uapaca thouarsii 

(RANDRIANANDRASANA, 2004) ; 

• une Gentianacée, Tachiadenus longiflorus (RAKOTO-RANOROMALALA, 1989) ; 

• des Fabacées, Albizia sp. (RAMAMONJISON, 1998), Albizia bernieri 

(RAHARISOA, 1999), Albizia odorata (RAJEMIARIMOELISOA- 

RAKOTOMIRAHO, 2000), Albizia polyphylla (RAKOTONDRASOA, 2000), 

Albizia tulearensis (RAONIHARISOA, 2003) et Albizia arenicola 

(RANDRIANARIVO, 1996 et 2003) ; 

• des Sapotacées, Mimusops commersonii (RAKOTOARIVELO, 2004) et Gambeya 

boiviniana (RASOATAHINA, 2005). 

Pour notre part, notre choix s’est fixé sur une plante malgache, Xylopia humblotiana 

appartenant à la famille des Annonacées pour les raisons suivantes : 

• le genre Xylopia s’avère être le plus important parmi les Annonacées puisqu’il est 

répandu dans la zone tropicale d’Amérique, d’Afrique, d’Asie et d’Océanie et 

regroupe près de 100 espèces (RAHARISOLOLALAO et coll., 2004) ; 

• l’espèce Xylopia humblotiana est une plante endémique à grande disponibilité sur la 

côte Est de Madagascar ; 

• d’après les enquêtes ethnobotaniques, le décocté du mélange de feuilles et de graines 

de la plante est préconisé pour atténuer la fatigue ; 

• à notre connaissance, aucune étude scientifique approfondie n’a été entreprise sur 

cette espèce. Seuls quelques tests chimiques préliminaires ont été effectués 

(DEBRAY et JACQUEMIN, 1971) ; 

• la toxicité des feuilles a été mise en évidence lors des essais préliminaires. Aucune 

étude toxicologique n’a encore été réalisée. 

L’objectif de ce travail est donc d’obtenir des préparations toxiques suffisamment 

purifiées qui permettront de caractériser les principes toxiques sur les plans chimique et 

toxicologique.


4 

Ce travail est présenté en deux parties : la première partie comprend l’étude des 

principes toxiques sur le plan chimique et la deuxième partie l’étude de leurs activités 

toxicologiques. Il est à préciser que les matériels et méthodes sont mentionnés dans chaque 

partie et qu’une introduction générale précède les deux parties et une conclusion générale 

termine le travail, avec les perspectives.

Première partie : 

ETUDE CHIMIQUE

Etude chimique 

4 

INTRODUCTION 

Outre l’étude botanique (CAVACO et KERAUDREN, 1958), des expériences 

préliminaires de criblage des familles chimiques éventuellement présentes dans les feuilles et 

les tiges de Xylopia humblotiana ont déjà été réalisées. DEBRAY et JACQUEMIN (1971) ont 

ainsi trouvé des leucoanthocyanes, des tanins ainsi que des flavonoïdes dans les feuilles de X. 

humblotiana. Mais cette étude chimique est loin d’être complète. Ainsi, après avoir mis en 

évidence une activité toxique sur souris des extraits de feuilles, nous avons établi un protocole 

de recherche axé sur les points suivants : 

• tests de différentes techniques d’extraction du (des) principe(s) toxique(s) à partir de 

la poudre de feuilles sèches ; 

• mise au point d’un procédé de purification en vue d’obtenir un extrait suffisamment 

purifié ; 

• étude des caractéristiques physico-chimiques du ou des principe(s) toxique(s) ; 

• détermination de sa (leur) nature chimique. 

MATÉRIELS ET MÉTHODES 

I.1. MATÉRIELS 

I.1.1.MATÉRIEL VÉGÉTAL 

I.1.1.1.Position systématique 

(MABBERLEY, 1987 ; WALTER et coll., 1999) 

La classification de la plante est la suivante : 

Règne 

: VEGETAL 

Embranchement : SPERMAPHYTES 

Sous-embranchement : ANGIOSPERMES 

Classe 

: MAGNOLIOPSIDA (DICOTYLEDONES) 

Sous-classe 

: MAGNOLIIDAE 

Ordre 

: MAGNOLIALES 

Famille 

: ANNONACEAE 

Genre 

: Xylopia 

Espèce 

: humblotiana 

Noms vernaculaires : Hazoambo, Fotsivavo, Morangalahy, Fotsivary, Moranga


5 

La plante a été identifiée au laboratoire de Botanique du Parc Botanique et Zoologique 

de Tsimbazaza, sous la référence en herbier N°AP Davis 1121. 

I.1.1.2.Description botanique 

I.1.1.2.1.Description du genre Xylopia 

(CAVACO et KERAUDREN, 1958 ; SCHATZ, 2001) 

Xylopia est un genre intertropical représenté par environ 100 espèces, dont 23 sont 

endémiques de Madagascar. 

Ce sont des buissons à grands arbres hermaphrodites, au tronc parfois soyeux ou 

portant une pubescence dense de couleur rousse. 

Les fleurs sont axillaires, solitaires ou en fascicules, grandes, distinctement 3-angulées 

et coniques dans le bouton. Les sépales sont au nombre de 3, valvaires soudés à la base, tandis 

que les pétales au nombre de 6 sont en deux verticilles généralement inégaux, valvaires. 

Le fruit apocarpe est constitué d’un groupe de monocarpes plus ou moins sessiles, 

grands, quelque peu ligneux, déhiscents, se fendant en révélant des graines blanches ou noires 

portant un arille de couleur blanche à vert-jaune. 

I.1.1.2.2.Description de l’espèce Xylopia humblotiana 

(CAVACO et KERAUDREN, 1958) 

Il s’agit d’un arbre de 6-20m de haut, aromatique, à feuilles persistantes et à rameaux 

gris foncé. 

Les feuilles sont alternes, simples et ne présentent pas de stipules. Elles sont 

constituées de pétioles de 3-5mm de long, d’un limbe de 4-7cm de long et de 2-3,5cm de 

large, coriace, glabre, glauque au-dessus et d’un vert plus pâle en-dessous. La nervure 

médiane est peu proéminente, les nervures secondaires de couleur violet foncé peu saillantes 

et le réseau de nervures tertiaires saillant. 

Les fleurs sont jaunâtres et odorantes, axillaires, solitaires ou plus rarement géminées 

sur un pédicelle de 8-10mm de long. 

Les fruits sont constitués de méricarpes au nombre de 7-10, irrégulièrement déhiscents 

et oblongs, atteignant 5cm de long et 1,5cm de large. Ils sont de couleur rouge vif. 

Les graines sont au nombre de 1-5, noires et ont un arille blanc. 

Le matériel végétal est présenté sur les figures 1 et 2 (p. 7).


6 

I.1.1.3.Distribution géographique 

(CAVACO et KERAUDREN, 1958) 

Xylopia humblotiana est endémique de Madagascar et pousse dans les forêts littorales. 

C’est une plante largement distribuée sur la côte Est de Madagascar, comme indiqué sur la 

figure 3 (p. 8). 

La plante se rencontre à Marambo (Masoala), dans la baie d’Antongil, à Mananara, 

Soanierana-Ivongo, dans la Réserve naturelle I d’Anjiro, au lac Nossy Ve, dans la forêt 

littorale Tampina, à Ambila Lemaitso, Brickaville, dans la forêt littorale près de Mahanoro, à 

Mananjary, à Matsinjoriaka (district de Farafangana), à Manombo, à Mandena, Fort-Dauphin 

et à Antananala. 

I.1.1.4.Date et lieu de récolte 

L’échantillon étudié a été récolté dans la forêt littorale d’Amparafana, région de 

Mahanoro (sur la RN11A, environ au PK 75) au mois d’Avril 2006, période durant laquelle 

elle est à son stade végétatif. 

I.1.1.5.Préparation et conservation du matériel végétal 

Les feuilles fraîchement récoltées sont séchées au soleil pendant environ une semaine. 

Elles sont ensuite broyées au moyen d’un mixer (BLENDER, GT 550) jusqu’à pulvérisation. 

La poudre fine ainsi obtenue est conservée à la température ambiante dans un bocal 

hermétiquement fermé. Elle constitue le matériel d’étude. 

I.1.2.LES PRODUITS CHIMIQUES 

Les réactifs et les solvants utilisés dans cette étude sont en général de qualité pour 

analyse et de marque MERCK et PROLABO. 

Les supports chromatographiques utilisés sont des plaques de gel de silice 

immédiatement utilisables (SCHLEICHER et SCHUELL F 1500/LS254 ), de dimensions 20x20cm. 

La couche, d’épaisseur égale à 0,20mm, est étalée sur un support en plastique se prêtant à un 

découpage aisé.


7 

Figure 1 : Pied de Xylopia humblotiana 

Figure 2 : Feuilles de Xylopia humblotiana


8 

Figure 3 : Répartition géographique de Xylopia humblotiana


9 

I.2. METHODES 

I.2.1.MÉTHODES D’EXTRACTION DES PRINCIPES TOXIQUES 

I.2.1.1.Extraction à froid 

La poudre végétale est délayée dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange 

hydroalcoolique 75%) suivant le rapport 1/10 (p/v) c’est-à-dire 10ml de solvant pour 1g de 

poudre. Le mélange est soumis à une agitation magnétique pendant 3h à la température 

ambiante, puis il est laissé macérer une nuit à +4°C. 

Le macérat est de nouveau agité pendant 1h avant d’être filtré sur quatre épaisseurs de 

gaze pour éliminer le marc. Le filtrat est ensuite centrifugé à 10 000trs/min pendant 15min, au 

moyen d’une centrifugeuse de paillasse (BREMSE, T52). 

Qu’il s’agisse d’extraction aqueuse ou d’extraction hydroalcoolique, le volume final 

du surnageant est ramené à 1ml pour chaque gramme de poudre de départ, c’est-à-dire suivant 

un rapport 1/1 (p/v). Cependant, pour l’extraction aqueuse, le surnageant qui constituera 

ultérieurement l’extrait brut est concentré (voir paragraphe II.2.3 p. 14), alors que pour 

l’extraction hydroalcoolique, il est débarrassé du solvant d’extraction par évaporation sous 

pression réduite au moyen d’un évaporateur rotatif (voir également paragraphe II.2.3 p. 14). 

Le précipité pouvant éventuellement apparaître est éliminé par centrifugation à 

12 000trs/min à l’aide d’une centrifugeuse (JOUAN, TH12). 

I.2.1.2.Extraction à chaud 

L’extraction à chaud est réalisée par chauffage à reflux. Dans ce cas, la poudre 

végétale est mise en suspension dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange 

hydroalcoolique 75%) dans un rapport 1/10 (p/v). L’extraction dure 3h à partir de l’apparition 

de la première goutte de condensation. Elle est effectuée sur une plaque chauffante et sous 

agitation magnétique, à la température d’ébullition du solvant d’extraction, notamment 100°C 

pour l’eau et +65°C pour l’éthanol (GAUTIER et MIOCQUE, 1968). 

Le décocté est enlevé du dispositif d’extraction et laissé refroidir à la température 

ambiante. Il est ensuite laissé macérer pendant une nuit à 4°C. La suite des manipulations est 

la même que pour l’extraction à froid.


10 

I.2.2.MÉTHODES DE PURIFICATION 

I.2.2.1.Précipitation par l’éthanol 50% 

I.2.2.1.1.Principe 

La méthode repose sur la diminution du pouvoir dissolvant de l’eau par addition d’un 

solvant organique miscible tel que l’éthanol, mais qui est moins polaire. Il en résulte une 

précipitation de certaines substances initialement solubles en milieu aqueux (MAHUZIER et 

HAMON, 1986). 

I.2.2.1.2.Mode opératoire 

De l’éthanol absolu de volume déterminé est ajouté goutte à goutte à l’extrait à traiter 

de même volume, sous agitation magnétique continue. Le mélange est ensuite laissé macérer 

pendant 15min à +4°C, le précipité formé est alors éliminé par centrifugation à 12 000trs/min 

pendant 15min à l’aide d’une centrifugeuse JOUAN (modèle TH12). Le surnageant est 

récupéré, débarrassé du solvant par évaporation au moyen de l’évaporateur rotatif et concentré 

jusqu’au volume initial de l’extrait à traiter. 

I.2.2.2.Fractionnement par l’acétate d’éthyle 


La méthode permet d’extraire une substance en solution aqueuse par transfert de celleci 

dans une phase organique non miscible (MAHUZIER et HAMON, 1986 ; KAMOUN, 

1987). 


Dans une ampoule à décanter sont introduits un volume d’extrait à traiter et le même 

volume d’acétate d’éthyle. Après agitation énergique du mélange, ce dernier est laissé au 

repos jusqu’à décantation totale des deux liquides, donnant deux phases bien distinctes : d’une 

part, la phase supérieure organique et d’autre part, la phase inférieure aqueuse. Les deux 

phases sont ensuite séparées et l’opération est répétée deux fois en renouvelant chaque fois la 

phase organique. 

Les trois phases organiques sont alors réunies puis débarrassées du solvant et 

concentrées pour obtenir le rapport 1/1 (p/v). 

La phase aqueuse est débarrassée de l’acétate d’éthyle résiduel par évaporation.


11 

I.2.2.3.Fractionnement par le n-butanol 


La technique est fondée sur la distribution d’un soluté entre deux solvants non 

miscibles, l’eau et le butanol, en fonction de sa solubilité dans chacun des deux (MAHUZIER 

et HAMON, 1986 ; KAMOUN, 1987). 


L’opération est la même que pour le fractionnement par l’acétate d’éthyle, en 

remplaçant l’acétate d’éthyle par le n-butanol. 

Les phases organiques sont rassemblées puis débarrassées du solvant et concentrées 

pour obtenir un rapport 1/1 (p/v). 

La phase aqueuse est soumise au même traitement. 

I.2.2.4.Précipitation par l’acétone 50% 


La technique est basée sur le même principe que la précipitation par l’éthanol 50% 

(MAHUZIER et HAMON, 1986). 


La précipitation est réalisée en ajoutant goutte à goutte de l’acétone à l’extrait à tester 

dans un rapport 1/1 (v/v) sous agitation magnétique. Le tout est laissé reposer à +4°C pendant 

15 min. Le précipité éventuellement présent est éliminé par centrifugation à 12 000trs/min 

pendant 15min au moyen d’une centrifugeuse (JOUAN, TH12). Le surnageant est recueilli et 

évaporé jusqu’à disparition de toute trace de solvant, puis ramené au volume initial de 

l’extrait. 

I.2.2.5.Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP) 


L’ANP, comme la plupart des sels de métaux lourds, est connu pour sa capacité à 

précipiter sous forme de sels insolubles de nombreux composés tels que les protéines, les 

polysaccharides, les acides nucléiques et les acides organiques.


12 


Une solution aqueuse d’ANP à 20% (p/v), de volume déterminé, est ajoutée 

progressivement à l’extrait à traiter, sous agitation magnétique. Le mélange ayant un aspect 

trouble est ensuite centrifugé à 12 000trs/min pendant 5min à l’aide d’une centrifugeuse 

JOUAN (TH12). Le surnageant est recueilli alors que le culot est éliminé. L’opération est 

répétée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation de précipité dans le surnageant. 

Le surnageant issu du dernier traitement par la solution d’ANP est additionné d’une 

solution de phosphate disodique afin d’éliminer l’excès de plomb. Le mélange est de nouveau 

centrifugé. Le surnageant recueilli est concentré jusqu’au volume de l’extrait de départ, par 

évaporation. 

I.2.2.6.Dialyse 


(AUDIGIE et coll., 1982 ; MAHUZIER et HAMON, 1986 ; KAMOUN, 1987) 

La technique permet de séparer des substances en fonction de leur taille, en utilisant 

leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane jouant le rôle de tamis 

moléculaire. 

Deux phénomènes interviennent au cours de la dialyse : 

• la diffusion : les solutés traversent la membrane en diffusant vers le liquide de 

contre-dialyse ; l’effet tamis explique la perméabilité à certaines substances et 

l’imperméabilité à d’autres en fonction de leur taille. Ainsi, la diffusion des grosses 

molécules est lente, voire nulle tandis que les ions et les petites molécules passent à 

travers la membrane. 

• l’osmose : c’est un phénomène qui intervient lorsqu’on met en présence deux 

solutions de concentrations différentes séparées par une membrane hémiperméable. 

L’eau diffuse de la solution la plus diluée vers la solution la plus concentrée. 


La membrane de dialyse ou boudin à dialyse est constituée de cellophane de forme 

cylindrique (référence 27/32), de 3,3cm de large (à plat). Celle utilisée dans ce travail laisse 

passer toutes substances ayant un poids moléculaire inférieur à 15 000Da.


13 

I.2.2.6.2.1.Préparation de la membrane de dialyse 

La membrane de dialyse est bouillie 3 fois pendant 15min dans de l’eau distillée en 

renouvelant à chaque fois l’eau distillée. Ceci est nécessaire afin d’éliminer la glycérine, les 

composés sulfurés et les métaux lourds contenus dans le boudin. La membrane ainsi préparée 

est laissée refroidir à la température ambiante et conservée à +4°C dans la dernière eau 

bouillie pendant quelques jours. Avant utilisation, la membrane est rincée à l’eau distillée. 

I.2.2.6.2.2.Mise en route de la dialyse 

Le boudin à dialyse rempli au 1/3 de son volume d’extrait à traiter est fermé à ses deux 

extrémités par un nœud simple. Il est ensuite immergé complètement dans le liquide de 

contre-dialyse dont le volume est 100 fois celui de l’extrait à traiter. Le tout est soumis à une 

agitation magnétique afin d’éviter la formation d’un gradient de concentration des substances 

diffusibles dans le liquide de contre-dialyse. Ce liquide est renouvelé 4 fois. L’opération est 

conduite pendant 24h. 

A la fin de ces opérations, tous les dialysats (liquides à l’extérieur du boudin) sont 

rassemblés. Le dialysat et l’adialysat (liquide à l’intérieur du boudin) sont concentrés jusqu’au 

volume de l’extrait de départ. 

I.2.2.7.Filtration sur charbon actif 


Le charbon actif est un support de chromatographie d’adsorption qui fixe diverses 

molécules, en particulier celles qui présentent des noyaux aromatiques dans leur structure. En 

effet, il retient les pigments et est donc utilisé en général pour décolorer les extraits. 


La technique utilisée a été mise au point par JEANNODA (1986). 

Une couche de charbon actif de quantité déterminée est tassée dans un entonnoir 

bouché par des fibres de verre et adapté à une fiole à vide, laquelle est reliée à une pompe à 

vide. L’extrait à traiter est versé goutte à goutte et avec précaution au-dessus du charbon 

préalablement imprégné d’eau distillée, puis filtré sous pression réduite. Le filtrat ainsi obtenu 

est de nouveau filtré sur papier filtre afin d’éliminer les fines particules de charbon.


14 

I.2.3.MÉTHODE DE CONCENTRATION 

Toutes les opérations de réduction de volume d’extrait ou d’évaporation de solvant 

s’effectuent au moyen d’un évaporateur rotatif (HEIDOLPH) à 60°C. La pression est réduite à 

l’aide d’une pompe à vide. 

I.2.4.CALCUL DU RENDEMENT 

L’extrait obtenu à chaque étape de purification ou d’extraction est évaporé à sec. Le 

résidu obtenu est pesé. Le rendement est donné par le rapport entre le poids de ce résidu et 

celui du matériel de départ. 

I.2.5.MÉTHODES D’ANALYSE 

I.2.5.1.Chromatographie sur couche mince 

(RANDERATH, 1962 ; VERNIN, 1970 ; AUDIGIE et coll., 1982 ; MAHUZIER et 

HAMON, 1986 ; BOREL et RANDOUX, 1987) 


Il s’agit d’une méthode d’analyse immédiate basée sur deux mécanismes 

fondamentaux : l’adsorption et le partage. Elle utilise un support ou adsorbant qui d’une part, 

fixe les molécules à analyser par des liaisons non covalentes, et d’autre part, retient un 

premier solvant tel que l’eau, non miscible à un second solvant. Les substances à séparer vont 

alors se partager entre les deux solvants. 


I.2.5.1.2.1.Dépôt des échantillons 

La plaque de chromatographie est préparée en déposant à l’aide d’un capillaire les 

extraits à analyser, sous forme de tirets de 7mm disposés sur une ligne horizontale à 1,5cm du 

bord inférieur. Les tirets sont espacés de 6mm. Les deux tirets qui se trouvent aux deux 

extrémités de la ligne sont placés à 1,3cm des bords latéraux de la plaque. Les dépôts sont 

séchés à l’aide d’un séchoir à main.


15 

I.2.5.1.2.2.Développement du chromatogramme 

La plaque préparée est introduite dans une cuve chromatographique (DESAGA) au 

fond de laquelle se trouve le solvant de migration et dont l’atmosphère a été préalablement 

saturée par les vapeurs dudit solvant. Il s’agit d’un mélange constitué par 60 parties de n- 

butanol, 20 parties d’acide acétique et 20 parties d’eau distillée : B/A/E (60/20/20), (p/p/p). 

Le développement est assuré par migration du solvant par capillarité. La migration est 

arrêtée lorsque le front du solvant se trouve à 0,5cm du bord supérieur de la plaque. Cette 

dernière est ensuite retirée de la cuve et le solvant est aussitôt évaporé par un courant d’air 

chaud. 

I.2.5.1.2.3.Révélation du chromatogramme 

Les substances incolores exigent des méthodes particulières de détection : 

I.2.5.1.2.3.1.Examen sous lampe ultra-violette (UV) 

De nombreux produits deviennent visibles grâce à l’absorption de la lumière UV. A 

des longueurs d’onde caractéristiques 254nm et 366nm, certaines substances apparaissent 

sous forme de taches sombres où la fluorescence est éteinte. 

I.2.5.1.2.3.2.Formation de réactions colorées 

Certains composés peuvent être révélés au moyen de réactifs très généraux dont le 

réactif à la vanilline-sulfurique (voir composition en annexe I). Celui-ci est pulvérisé sur la 

surface du chromatogramme ; les substances apparaissent ainsi sous forme de taches colorées 

pouvant être très faibles, d’où la nécessité de chauffer la plaque à 100°C. On obtient des 

taches noires. 

I.2.5.2.Criblage phytochimique 

I.2.5.2.1.Préparation des extraits à tester 

I.2.5.2.1.1.Extrait aqueux 

Une quantité égale à 2g de la poudre de feuilles, ou de résidu d’évaporation à sec de 

l’extrait à étudier est dissoute dans 40ml d’eau distillée. Le mélange est chauffé jusqu’à 

ébullition et laissé macérer pendant son refroidissement. Le décocté est ensuite filtré et le 

filtrat constitue l’extrait aqueux.


16 

I.2.5.2.1.2.Extrait hydroalcoolique 

Un poids de 1g de poudre de feuilles ou de résidu sec de l’extrait à tester est repris 

dans 10ml d’éthanol 80%. Après macération pendant une nuit, le mélange est filtré donnant 

l’extrait hydroalcoolique. 

I.2.5.2.1.3.Extrait acide 

La poudre ou le résidu d’évaporation à sec de l’extrait à tester pesant 1g est laissé 

macérer pendant 30min dans 10ml d’acide chlorhydrique (HCl) 2N. Le macérat est ensuite 

filtré pour obtenir l’extrait acide. 

I.2.5.2.1.4.Extrait chloroformique 

Une suspension chloroformique, dans le rapport 1/10 (p/v), est réalisée à partir de 1g 

de poudre ou de résidu d’évaporation à sec de l’extrait à étudier. La suspension est laissée 

macérer une nuit puis filtrée après agitation. Le filtrat constitue l’extrait chloroformique. 

I.2.5.2.2.Principes et méthodes 

I.2.5.2.2.1.Alcaloïdes 

La méthode de détection des alcaloïdes consiste en leur précipitation par des réactifs 

d’une assez grande spécificité. Ces réactions de précipitation sont fondées sur la capacité 

qu’ont les alcaloïdes à se combiner avec des métaux et des métalloïdes : bismuth, mercure, 

tungstène, iode… (BRUNETON, 1993). 

La manipulation nécessite quatre tubes à essai contenant chacun 1ml d’extrait acide. 

Le premier tube sert de témoin tandis que les trois autres sont utilisés pour les tests à l’aide 

des réactifs de MAYER, de DRAGENDORFF et de WAGNER. 

La composition de ces réactifs est donnée en annexe II. 

I.2.5.2.2.1.1.Test de MAYER 

Le second tube contenant l’extrait acide est additionné de 4 à 5 gouttes de réactif de 

MAYER. L’apparition d’un précipité ou d’une floculation indique la présence d’alcaloïdes. 

I.2.5.2.2.1.2.Test de DRAGENDORFF 

Dans le troisième tube, sont ajoutées 4 à 5 gouttes de réactif de DRAGENDORFF. Si 

des alcaloïdes sont présents dans l’extrait, une floculation apparaît.


17 

I.2.5.2.2.1.3.Test de WAGNER 

La formation d’un précipité dans le dernier tube, après ajout de 4 à 5 gouttes de réactif 

de WAGNER, confirme la présence d’alcaloïdes. 

Les réactions de détection des alcaloïdes sont dites positives si et seulement si le 

précipité formé dans chaque tube est soluble dans l’éthanol 80% de volume 0,5ml. 

L’obtention de réaction positive pour chaque test est la condition sine qua non pour 

pouvoir énoncer la présence d’alcaloïdes dans l’extrait à traiter. 

I.2.5.2.2.2.Flavonoïdes et leucoanthocyanes 

L’extrait hydroalcoolique est utilisé pour leur détection. 

I.2.5.2.2.2.1.Flavonoïdes (Test de WILSTATER) 

La réaction colorée, dite de la cyanidine, met en évidence les flavones, flavonols et 

flavanones par traitement avec du magnésium en milieu chlorhydrique (BRUNETON, 1987). 

Deux tests sont effectués : 

• pour le premier test, 3ml de l’extrait sont additionnés de 0,5ml de HCl 12,07N et de 

deux tournures de magnésium. Le changement de coloration est noté après 10min. 

Le virage au rouge indique la présence de flavones, au rouge-pourpre celle des 

flavonols et au rouge-violacé celle des flavonones et des flavanols ; 

• la même opération est répétée pour le second test, mais le mélange est additionné de 

1ml d’eau distillée et de 1ml d’alcool isoamylique. 

I.2.5.2.2.2.2.Leucoanthocyanes (Test de BATE-SMITH) 

En milieu très acide, la forme cationique des anthocyanes colorée en rouge est stable 

(BRUNETON, 1993). 

A 3ml d’extrait sont ajoutés 0,5ml de HCl 12,07N. La solution acide est chauffée au 

bain-marie bouillant pendant 30min. Après refroidissement, l’apparition d’une coloration 

rouge-violet suggère la présence de leucoanthocyanes. 

I.2.5.2.2.3.Stéroïdes et triterpènes 

Les stéroïdes et triterpènes constituent généralement les génines des saponosides 

(BRUNETON, 1987). 

L’extrait chloroformique est utilisé pour les tests :


18 

I.2.5.2.2.3.1.Test de LIEBERMANN-BURCHARD 

Un volume de 1ml de l’extrait à étudier est additionné de 3 gouttes d’anhydride 

acétique. Après une légère agitation, deux gouttes d’acide sulfurique (H 2 SO 4 ) 36,76N est 

versée le long de la paroi du tube incliné contenant le mélange. L’observation du changement 

de coloration est effectuée pendant 1h. L’apparition d’une coloration bleu-vert indique la 

présence de stéroïdes tandis qu’une coloration rouge, violette ou rose confirme celle des 

terpènes. 

I.2.5.2.2.3.2.Test de SALKOWSKI 

A 1ml de l’extrait est ajouté 1ml de H 2 SO 4 36,76N le long de la paroi du tube à essai 

incliné. Si les stérols saturés sont présents dans le milieu, un anneau rouge apparaît à 

l’interface du mélange. 

I.2.5.2.2.4.Saponines 

Les saponosides se dissolvent dans l’eau en formant des solutions moussantes par 

agitation (BALANSARD et BERNARD, 1950 ; BRUNETON, 1987 et 1993). 

Un volume de 1ml d’extrait aqueux est utilisé. Après une agitation énergique pendant 

30s, la formation de mousse alvéolée est observée : si celle-ci atteint une hauteur de 3cm et 

persiste pendant au moins 30min, l’extrait contient des saponines. 

I.2.5.2.2.5.Tanins 

Les tanins réagissent avec le chlorure ferrique et sont précipités de leurs solutions 

aqueuses par la gélatine (BALANSARD et BERNARD, 1950 ; BRUNETON, 1987 et 1993). 

L’extrait aqueux est utilisé pour les trois tests suivants : 

I.2.5.2.2.5.1.Test à la gélatine 

A 0,5ml d’extrait aqueux sont ajoutées 4 à 5 gouttes de gélatine 1%. La formation 

d’un précipité blanc indique la présence de tanins. 

I.2.5.2.2.5.2.Test à la gélatine salée 

A 0,5ml d’extrait à tester sont ajoutées 4 à 5 gouttes de gélatine salée (gélatine 1% 

mélangée à une solution de NaCl 10%). La présence de tanins est vérifiée par l’apparition de 

précipité.


19 

I.2.5.2.2.5.3.Test au chlorure ferrique 

Après addition de 4 à 5 gouttes de chlorure ferrique en solution méthanolique dans 

0,5ml de l’extrait à étudier, les tanins catéchiques sont mis en évidence par la formation d’une 

coloration bleu-vert ou vert-noir alors que des tanins galliques sont présents s’il apparaît une 

coloration bleu-noir. 

I.2.5.2.2.6.Anthraquinones (Test de BORNTRÄGER) 

Le test de Bornträger met en jeu une réaction colorée mettant les quinones en 

évidence, par solubilisation en milieu alcalin (BRUNETON, 1987). 

Un volume de 0,5ml d’extrait aqueux est mélangé avec 1ml de benzène dans une 

ampoule à décanter. Après décantation, la phase organique est recueillie dans un tube à essai 

et additionnée de 5 gouttes d’ammoniaque 25%. Après agitation, un virage au rouge de la 

phase alcaline (phase inférieure) indique la présence d’anthraquinones. 

I.2.5.2.2.7.Désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI) 

A 0,5ml d’extrait aqueux sont ajoutés successivement 0,5ml de chlorure ferrique 10% 

et 0,5ml d’acide acétique glacial. Le tout est agité. 0,3ml de H 2 SO 4 36,76N est versé le long 

de la paroi du tube incliné de 45°. La formation d’un anneau pourpre suggère la présence des 

désoxyoses. 

I.2.5.2.2.8.Iridoïdes 

En milieu acide, les iridoïdes donnent des colorations caractéristiques servant à leur 

identification. 

Une quantité d’extrait aqueux de volume égal à 0,5ml est ajouté de HCl 12,07N. 

L’apparition d’une coloration bleue après ébullition pendant 30min témoigne de la présence 

d’iridoïdes. 

RÉSULTATS 

Au cours des manipulations, il a été observé que les principes actifs des feuilles de 

Xylopia humblotiana résistent au chauffage et à des opérations de congélation et de 

décongélation répétées. De ce fait, les expériences sont effectuées à la température ambiante, 

sauf autres indications. Les extraits sont conservés à - 20°C.


20 

I.3. PRÉPARATION DES EXTRAITS TOXIQUES 

I.3.1.EXTRACTION 

Plusieurs techniques d’extraction ont été testées dans le but d’extraire le maximum de 

principes toxiques à partir de la poudre de feuilles et d’obtenir un extrait brut facile à 

manipuler. La toxicité de chaque extrait est appréciée grâce à des tests sur souris. 

L’extraction a été faite à partir de 40g de poudre. Pour cela, différentes méthodes ont 

été appliquées : 

• extraction à froid, avec comme solvant d’extraction l’eau distillée d’une part et le 

mélange hydroalcoolique 75% d’autre part (voir paragraphe II.2.1.1, p. 9). 

• extraction à chaud et à reflux utilisant les mêmes solvants d’extraction que 

précédemment. L’extraction se déroule selon la méthode décrite au paragraphe 

II.2.1.2, p. 9. 

Dans tous les cas, l’extraction a été réalisée avec 400ml de solvant (rapport 1/10, p/v). 

Le volume final de l’extrait brut obtenu, est ajusté à 40ml, ce qui correspond à un rapport final 

de 1/1 (p/v). 

1. 

Les caractéristiques des différents extraits bruts obtenus sont résumées dans le tableau 

Tableau 1 : Caractéristiques des extraits bruts obtenus par les différentes 

méthodes d'extraction 

Techniques 

Aqueuse à Hydroalcoolique Aqueuse à Hydroalcoolique 

d’extraction 

froid 75% à froid chaud 75% à chaud 

Caractéristiques 

Couleur rouge brun marron clair marron foncé marron 

Aspect trouble ± trouble ± trouble ± trouble 

Consistance visqueuse ± visqueuse visqueuse visqueuse 

pH 5,68 5,44 5,61 5,29 

Goût amer amer amer amer 

Toxicité (temps de 

survie des souris 

6h15 à 6h30 4h à 6h30 4h50 à 6h30 moins de 20h 

testées) 

Rendement 15,48% 13,54% 20,92% 10,50%


21 

Ces différents extraits bruts sont tous toxiques pour la souris. Cependant, l’extraction 

aqueuse à chaud donne le meilleur rendement et l’extrait brut correspondant est l’un des plus 

toxiques. 

L’extraction aqueuse à chaud fournit en outre des principes actifs supportant une 

température élevée. Elle a donc été retenue pour la suite de notre travail. 

I.3.2.PURIFICATION 

Plusieurs méthodes de purification basées sur différentes propriétés telles que la 

solubilité et le poids moléculaire, ont été testées en vue d’établir un procédé de purification 

adéquat pour les principes actifs. 

Trois d’entre les méthodes de purification testées ont été adoptées dans le protocole de 

purification des principes actifs car elles se sont avérées les plus efficaces. Les autres 

techniques non retenues seront également décrites car elles informent sur les propriétés 

physico-chimiques des principes toxiques. 

Ces étapes de purification ont été guidées par des tests de toxicité sur souris (voir 

paragraphe II.2.1.1.1 p. 31) et l’homogénéité des extraits obtenus après chaque étape est 

appréciée par CCM. 

I.3.2.1.Méthodes adoptées dans le protocole de purification 

I.3.2.1.1.Précipitation par l’éthanol 50% 

La précipitation de l’extrait brut par l’éthanol selon la méthode décrite au paragraphe 

II.2.2.1 (p. 10) a permis d’obtenir un extrait limpide, de couleur marron et présentant un goût 

amer. Cet extrait tue les souris. L’analyse par CCM montre cinq bandes distinctes. L’extrait 

est nommé extrait E 1 . 

I.3.2.1.2.Fractionnement par l’acétate d’éthyle 

Deux extraits, aqueux et organique, ont été obtenus par fractionnement par l’acétate 

d’éthyle de l’extrait E 1 (voir paragraphe II.2.2.2 p. 10). Une injection par voie intrapéritonéale 

(i.p.) de l’extrait aqueux de couleur marron est létale pour les souris, contrairement à l’extrait 

organique limpide et de couleur marron clair. 

La solution toxique ainsi obtenue montre quatre bandes après analyse par CCM. Elle 

est désignée extrait E 2 .


22 

I.3.2.1.3.Fractionnement par le n-butanol 

Le fractionnement de l’extrait E 2 par le n-butanol (suivant la méthode citée dans le 

paragraphe II.2.2.3, p. 11) a abouti à l’obtention de deux extraits : un extrait aqueux de 

couleur marron et de goût amer, qui, injecté par voie i.p. a entrainé la mort de 50% des souris 

testées, et un extrait organique de couleur marron clair ne provoquant la mort d’aucune souris. 

Certaines bandes révélées lors de l’analyse par CCM de l’extrait E 2 disparaissent après 

utilisation de cette méthode de purification. Elle constitue la troisième étape de purification 

aboutissant à l’obtention d’un extrait E 3 . 

I.3.2.2.Méthodes non adoptées dans le protocole de purification 

I.3.2.2.1.Précipitation par l’acétone 50% 

La précipitation de l’extrait E 1 par l’acétone 50% (voir paragraphe II.2.2.4 p. 11) 

aboutit à un extrait de couleur marron provoquant la mort des souris avant 24h. Cependant, 

l’analyse par CCM de cet extrait révèle qu’il n’y a pas de contaminants éliminés à partir de 

E 1 . 

I.3.2.2.2.Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP) 

L’extrait incolore obtenu par précipitation par l’acétate neutre de plomb de l’extrait 

brut (voir paragraphe II.2.2.5, p. 11) ne provoque pas la mort des souris. 

I.3.2.2.3.Dialyse 

L’extrait brut d’un volume égal à 2ml est dialysé contre 600ml d’eau distillée pendant 

24h (voir paragraphe II.2.2.6, p. 12). Après avoir été concentré jusqu’à un rapport 1/1, le 

dialysat ou liquide à l’extérieur du boudin n’est pas toxique. L’adialysat ou dialysant (liquide 

à l’intérieur du boudin) s’est avéré toxique sur 50% des souris éprouvées. Les 50% restants 

meurent, mais ce, au-delà des temps estimés pour l’épreuve de toxicité (qui est fixé 

arbitrairement à 24h). Cette méthode, peu performante, n’a donc pas été adoptée. 

I.3.2.2.4.Traitement par le charbon actif 

Par traitement par le charbon actif de l’extrait brut (paragraphe II.2.2.7, p. 13), le filtrat 

limpide et incolore obtenu n’est pas toxique sur souris. 24h après l’injection par voie i.p. du 

filtrat, les souris se rétablissent.


23 

Un protocole de purification comprenant une étape de précipitation par l’éthanol 50% 

et deux étapes successives de fractionnement, la première par l’acétate d’éthyle et la seconde 

par le n-butanol, a ainsi été adopté pour purifier l’extrait brut aqueux à chaud. Ce qui a permis 

l’obtention d’un extrait purifié E 3 . 

L’ensemble des étapes d’extraction et de purification est résumé sur la figure 4. 

40g de poudre de feuilles 

Extraction aqueuse à chaud 

Extrait brut 

8,36g 

Précipitation par l’éthanol 50% 

Culot éliminé 

Surnageant = extrait E 1 

6,02g 

Fractionnement par l’acétate 

d’éthyle 

Phase organique 

écartée 

Phase aqueuse = extrait E 2 

5,34g 

Fractionnement par le n-butanol 

Phase organique 

écartée 

Phase aqueuse = extrait E 3 

2,58g 

Figure 4 : Schéma récapitulatif des étapes d'extraction et de purification des principes 

toxiques de Xylopia humblotiana 

Les chiffres représentent les poids des résidus d’évaporation à sec des extraits.


24 

I.4. ANALYSE DES EXTRAITS PAR CHROMATOGRAPHIE SUR 

COUCHE MINCE 

L’évolution de l’homogénéité des extraits obtenus lors des différentes étapes de 

purification a été appréciée par chromatographie sur couche mince, utilisant le système de 

solvants B/A/E (60/20/20) (p/p/p) (voir méthode paragraphe II.2.5.1, p. 14). 

L’extrait brut présente huit bandes majeures révélables sous lumière ultra-violette à 

254nm. Le traitement par l’éthanol 50% permet d’éliminer trois bandes et suite au 

fractionnement par l’acétate d’éthyle, il ne reste plus que quatre bandes majeures. Le dernier 

extrait obtenu par fractionnement par le n-butanol montre trois bandes. La purification a donc 

permis d’éliminer cinq bandes contaminantes. 

Le chromatogramme révélé par pulvérisation du réactif à la vanilline sulfurique est 

montré sur la figure 5. 

Figure 5 : Chromatogramme récapitulatif montrant l'évolution de 

l'homogénéité des différents extraits 

EB : extrait brut 

E 1 : extrait obtenu par précipitation par l’éthanol 50% 

E 2 : extrait obtenu par fractionnement par l’acétate d’éthyle 

E 3 : extrait obtenu par fractionnement par le n-butanol


25 

I.5. RENDEMENT DE PURIFICATION 

A partir de 40g de poudre de feuilles, les résidus d’évaporation à sec de l’extrait brut 

et de l’extrait E 3 pèsent respectivement 8,36g et 2,58g. Le rendement de purification par 

rapport à l’extrait brut, déterminé selon la formule donnée au paragraphe II.2.4 p. 14, est donc 

de l’ordre de 30,89%. Le rendement en toxines, calculé par rapport à la poudre de départ est 

alors de 6,46%. 

I.6. CARACTERISATION CHIMIQUE 

I.6.1.PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES 

Les techniques d’extraction et de purification, retenues ou non dans le protocole 

définitif d’isolement des principes actifs, ont permis d’obtenir des informations sur leurs 

propriétés physico-chimiques. Ainsi, 

• ils sont solubles dans l’eau, l’éthanol et l’acétone et insolubles dans les solvants 

organiques peu polaires tels que le butanol et l’acétate d’éthyle ; 

• ils résistent à des températures élevées et à des opérations de congélation et de 

décongélation répétées ; 

• ils sont précipitables par l’acétate neutre de plomb ; 

• ils ne traversent pas la membrane de dialyse ; 

• ils sont fortement adsorbés sur le charbon actif ; 

• ils ont un goût amer. 

I.6.2.NATURE CHIMIQUE 

Un criblage phytochimique (paragraphe II.2.5.2 p. 15) dont les résultats sont consignés 

dans le tableau 2, a été réalisé sur l’extrait brut et l’extrait E 3 , afin de déterminer la nature 

chimique des principes toxiques.


26 

Tableau 2 : Résultats du criblage phytochimique de l'extrait brut et de l'extrait E 3 

Nature de 

l’extrait 

Acide 

Hydroalcooliqu 

e 

Chloroformique 

Aqueux 

Familles 

chimiques 

Alcaloïdes 

Flavonoïdes et 

Réactions 

Résultats 

EB E 3 

MAYER − − 

DRAGENDORFF − − 

WAGNER − − 

WILSTATER − − 

leucoanthocyanes BATE-SMITH + + 

Stéroïdes et LIEBERMANNtriterpènes 

BURCHARD 

− 

− 

Stérols insaturés SALKOWSKI − − 

Saponines Test de mousse − − 

Chlorure ferrique + + 

Tanins 

Gélatine + − 

Gélatine salée + + 

Anthraquinones BORNTRÄGER − − 

Désoxyoses KELLER-KILIANI − − 

Iridoïdes HCl à chaud − − 

+ test positif 

− test négatif 

D’après ces résultats, des tanins ainsi que des leucoanthocyanes sont présents aussi 

bien dans l’extrait brut que dans l’extrait E 3 .


27 

DISCUSSION ET CONCLUSIONS 

L’étude chimique réalisée sur Xylopia humblotiana a permis de mettre en évidence 

une activité toxique dans les feuilles. 

Différentes techniques d’extraction ont été testées. Une méthode d’extraction aqueuse 

à chaud a été adoptée car elle présente de nombreux avantages. Elle offre un meilleur 

rendement. D’autre part, considérant le temps de survie des souris après injection par voie i.p. 

des différents extraits bruts, l’extrait aqueux à chaud s’avère être le plus toxique. 

Un procédé de purification comprenant un traitement par l’éthanol, des 

fractionnements par l’acétate d’éthyle et par le n-butanol, a abouti à l’obtention d’un extrait 

hautement purifié à partir de l’extrait brut aqueux à chaud. Le rendement en toxines est de 

6,46%. 

Ces principes toxiques sont solubles dans les solvants polaires tels que l’eau, l’éthanol, 

l’acétone. Ils sont précipitables par l’ANP, ce qui suggère qu’ils renferment dans leur 

structure un groupement acide ou qu’ils possèdent un poids moléculaire élevé. Ils sont 

adsorbés par le charbon actif, ce qui suppose la présence de noyaux aromatiques dans leur 

structure. Ils sont incapables de traverser la membrane de dialyse : il pourrait y avoir 

interférence avec ladite membrane à cause de la structure probablement polycyclique (voir 

aussi plus bas) des principes. Ils sont stables à haute température et résistent à des opérations 

de congélation et de décongélation répétées. 

Le criblage phytochimique a permis de révéler des tanins, ainsi que des 

leucoanthocyanes dans les extraits de feuilles de Xylopia humblotiana. Ces résultats 

coïncident avec ceux trouvés par DEBRAY et JACQUEMIN (1971), sauf que ces derniers ont 

trouvé en plus de ces composés, des flavonoïdes. 

Xylopia humblotiana ne renferme pas de composé alcaloïdique contrairement aux 

autres espèces du même genre, entre autres X. buxifolia, X. danguyella, X. lemurica 

(RAHARISOLOLALAO et coll. 2004) et X. aethiopica (SULEIMAN et coll., 2005). 

L’extrait brut contient des tanins qui réagissent avec la gélatine. Pour l’extrait E 3 ce 

test est négatif. Ces composés auraient donc été éliminés lors des étapes de purification.


28 

Notons que la toxicité sur souris diminue au fur et à mesure que l’extrait est purifié. 

Ceci pourrait être dû à une déperdition de substances toxiques au cours de la purification. 

En conclusion, les résultats de cette étude révèlent la présence dans les feuilles de 

Xylopia humblotiana, de principes toxiques qui pourraient appartenir au groupe des 

leucoanthocyanes et/ou à celui des tanins.

Deuxième partie : 

ETUDE TOXICOLOGIQUE

Etude toxicologique 

29 

INTRODUCTION 

La purification de l’extrait brut aqueux à chaud a permis l’obtention d’un extrait 

purifié E 3 . 

L’analyse chimique a permis également de donner d’amples renseignements 

concernant les caractéristiques physico-chimiques et la nature des principes actifs contenus 

dans ces extraits. 

Cette deuxième partie est consacrée à l’évaluation de la toxicité des extraits brut et/ou 

purifié sur différents systèmes biologiques. Ainsi, les extraits sont testés sur : 

• des animaux : à sang chaud et à sang froid ; 

• des végétaux ; 

• des microorganismes. 

MATÉRIELS ET MÉTHODES 

I.1. MATÉRIELS 

I.1.1.LES ANIMAUX D’EXPÉRIMENTATION 

Les animaux à sang chaud : les souris 

Les souris utilisées sont des souris d’élevage (Mus musculus, var. albinos) de race 

Swiss. Ces souris sont stabilisées à l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM) depuis plusieurs 

années. Elles proviennent de l’animalerie du Département de Biochimie Fondamentale et 

Appliquée. 

Les animaux à sang froid 

I.1.1.1.1.Les têtards 

Des têtards de grenouille sans patte appartenant à l’espèce Ptychadena mascareniensis 

ont été capturés dans les rizières des alentours du Campus Universitaire d’Antananarivo et ont 

été testés le jour même de la capture.


30 

I.1.1.1.2.Les poissons 

Des alevins de poisson d’une taille de 2cm, appartenant à l’espèce Cyprinus carpio ou 

carpe ont été utilisés pour le test. Ces alevins ont été adaptés quelques jours avant leur 

utilisation dans un aquarium bien aéré contenant de l’eau de pluie. 

I.1.1.1.3.Les larves de moustique 

Les moustiques appartenant à l’espèce Culex quinquefasciatus peuvent se reproduire 

dans presque n’importe quelle collection d’eau. Ainsi, les larves sont sélectionnées et 

recueillies le jour du test dans des eaux stagnantes, de façon à avoir des larves entre le 

troisième et le début du quatrième stade de développement. 

Les hématies de mouton 

Pour les tests hémolytiques, une suspension d’hématies de mouton est préparée à partir 

d’une quantité définie de sang de mouton défibriné provenant du laboratoire de Virologie de 

l’IMVAVET (Institut Malgache des Vaccins Vétérinaires). 

I.1.2.LES PLANTES D’EXPÉRIMENTATION 

Des graines sèches de plantes potagères Dicotylédones et Monocotylédones ont été 

utilisées pour l’étude des effets sur les végétaux. Ces graines, dont la liste est donnée dans le 

tableau 3, proviennent de la collection du FOibem-pirenena momba ny FIkarohana 

ampiharina ho amin’ny Fampandrosoana ny eny Ambanivohitra (FOFIFA), sis à Ambatobe. 

Tableau 3 : Végétaux utilisés pour l’étude toxicologique des extraits 

GROUPE FAMILLES NOM SCIENTIFIQUE NOMS USUELS 

CUCURBITACEAE 

Cucumis sp. Concombre 

Cucurbita pepo 

Courgette 

SOLANACEAE Lycopersicum esculentum Tomate 

ASTERACEAE Lactuca sativa Laitue 

Daucus carotta 

Carotte 

APIACEAE 

DICOTYLEDONES 

Petroselinum crispum Persil 

FABACEAE 

Phaseolus vulgaris Haricot rouge 

Pisum sativum 

Petit pois 

Brassica oleracae Anantsonga 

BRASSICACEAE Brassica chinensis Chou de Chine 

Brassica sp. 

Tissam white 

MONOCOTYLEDONES POACEAE 

Oryza sativa 

Riz 

Zea maÿs 

Maïs


31 

I.1.3.LES MICROORGANISMES 

Les souches 

Des souches pures pré-identifiées et fournies par le Centre National d’Application des 

Recherches Pharmaceutiques (CNARP) ont été utilisées pour les expériences sur les 

microorganismes. 

Les milieux de culture 

(DUMAS, 1951 ; LARPENT et LARPENT-GOURGAUD, 1990) 

Les précultures bactériennes ont été préparées dans du bouillon nutritif. 

Le milieu solide de MUELLER-HINTON a été utilisé pour l’étude de l’activité sur les 

microorganismes. 

La composition de ces milieux est donnée en annexe III. 

I.2. MÉTHODES 

I.2.1.MÉTHODES D’ÉTUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX 

Etude des effets sur les animaux à sang chaud 

I.2.1.1.1.Etude de la toxicité sur souris 

(BRUN, 1963 ; FABRE et TRUHAUT, 1965 ; COLOT, 1972 ; CHAN et coll., 1984) 

I.2.1.1.1.1.Estimation de la toxicité 

La toxicité aiguë est estimée par injection par voie i.p. d’un volume de 0,3ml d’extrait 

par 25g de souris. Un lot de 3 souris pesant 20±2g est utilisé. Un autre lot de 3 souris servant 

de témoin reçoit du sérum physiologique par la même voie d’injection. Chaque symptôme qui 

pourrait apparaître suite à l’injection, est tout de suite noté. 

I.2.1.1.1.2.Détermination de la DL 50 

La toxicité aiguë est généralement exprimée, outre les données qualitatives, par la dose 

(exprimée en mg ou en g d’extrait par kilo d’animal testé) nécessaire pour tuer au bout de 

24h, 50% des animaux mis en expérience dans des conditions d’expérimentation précises. 

Elle est également appelée dose létale 50% (DL 50 ).


32 

La DL 50 est comprise entre la dose maximale tolérée et la dose sûrement mortelle, 

lesquelles sont préalablement déterminées au cours d’essais préliminaires de toxicité sur 

souris. Connaissant les valeurs de ces deux doses limites, la valeur de la DL 50 peut être 

déterminée en administrant par voie i.p. à des souris homogènes réparties en plusieurs 

groupes, de six doses croissantes en progression géométrique de raison déterminée. 

Deux méthodes établies par REED et MUENCH (1938) ont été adoptées pour la 

détermination de la DL 50 : 

• la méthode graphique utilisant une courbe des totaux cumulatifs des animaux ayant 

succombé et celle des totaux cumulatifs des animaux ayant survécu. La valeur de la 

DL 50 correspond au point d’intersection de ces deux courbes. 

• la méthode algébrique donnée par la relation : 

log DL50 = log B + 

(0,5 - N) 

(M - N) 

log r 

Avec B : dose immédiatement inférieure à la DL 50 

N : mortalité provoquée par la dose B (exprimée en fraction décimale) 

M : mortalité provoquée par la dose immédiatement supérieure à la DL 50 (toujours 

en fraction décimale) 

r : raison de la progression géométrique 

I.2.1.1.2.Etude du pouvoir hémolytique des extraits 

I.2.1.1.2.1.Principe 

Au cours de l’incubation de la suspension d’hématies en présence d’une substance 

hémolytique, les érythrocytes libèrent le pigment sanguin ou hémoglobine hors du stroma 

globulaire. Ce pouvoir hémolytique est apprécié par la présence de halo rouge dans certaines 

cupules. Des pastilles rouges formées d’hématies intactes sont visibles au fond des cupules 

qui ne présentent pas d’hémolyse. Un halo rouge et des pastilles sont présents s’il apparaît une 

hémolyse partielle.


33 

I.2.1.1.2.2.Mode opératoire 

Le sang de mouton défibriné est recueilli dans un flacon stérile. Trois lavages 

successifs de celui-ci sont effectués par centrifugation pendant 5min à 3 000trs/min au moyen 

d’une centrifugeuse (BREMSE, T52) en ajoutant à chaque lavage une solution tampon 

Phosphate Buffered Saline ou PBS (voir composition en annexe IV). Après élimination de la 

dernière eau de lavage, le culot constitue la suspension d’hématies à 100%. Une dilution avec 

le tampon PBS est réalisée pour obtenir une suspension d’hématies à 2% qui va être utilisée 

pour le test proprement dit. Elle est répartie dans les cupules d’une microplaque de titration à 

raison de 50µl par cupule. 

Le test se fait selon une dilution en cascade avec du PBS, de l’extrait à analyser, avec 

un coefficient de dilution égal à 0,5. 

L’eau distillée et le PBS constituent respectivement le témoin positif et le témoin 

négatif. 

Le tableau 4 ci-après montre cette distribution. Les volumes et concentrations dans 

chaque cupule sont également détaillés dans le tableau 4. 

Tableau 4 : Composition du milieu pour le test hémolytique 

Puits n° T+ T- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 

PBS (µl) 50 25 

Extrait (µl) 50 25 

Eau distillée 

(µl) 

Suspension 

d’hématies 

2% (µl) 

Concentratio 

n de l’extrait 

(mg/ml) 

Volume total 

(µl) 

50 

37,5 

0 

12,5 

0 

43,7 

5 

46,8 

8 

48,4 

4 

49,2 

2 

49,6 

1 

49,80 

6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 

50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 

10 

0 

10 

0 

2 1 0,5 0,25 0,13 0,06 0,3 0,16 0,08 

10 

0 

10 

0 

100 100 100 100 100 100 100


34 

Etude des effets sur les animaux à sang froid 

I.2.1.1.3.Effets sur les têtards et les alevins 

Des lots d’animaux de même taille sont sélectionnés, puis répartis dans des 

cristallisoirs contenant 200ml d’eau de pluie. L’extrait à étudier est ajouté au milieu de 

manière à obtenir différentes concentrations. Celles-ci s’échelonnent entre la concentration la 

plus élevée donnant 0% de mortalité et la concentration la plus basse donnant 100% de 

mortalité. 

I.2.1.1.3.1.Expérience sur les têtards de grenouille 

Sept lots de cinq têtards sont testés avec sept concentrations en progression 

géométrique de raison déterminée. 

I.2.1.1.3.2.Expérience sur les alevins de carpe 

Cinq lots de cinq alevins sont utilisés pour l’expérience. Les concentrations testées 

sont en progression géométrique de raison déterminée. 

I.2.1.1.3.3.Détermination de la CL 50 

La CL 50 (24h) ou concentration létale du toxique, qui cause la mort de 50% des 

animaux testés au bout de 24h est déterminée par la méthode graphique de régression linéaire 

de la relation : 

Mortalité (%) = f (logC) 

Où C : concentration en µg/ml 

L’équation de la droite de régression linéaire est donnée par la formule : 

Y = aX + 

b 

Avec Y : pourcentage de mortalité 

X : logarithme décimal de la concentration ou log C 

a : constante 

b : coefficient de régression


35 

I.2.1.1.4.Méthode d’étude des effets sur les larves de moustique 

(OMS, 1970) 

Les larves sont réparties dans des cristallisoirs contenant 200ml d’eau de pluie. La 

solution à étudier est additionnée au milieu de manière à avoir différentes concentrations. 

Le calcul du pourcentage de mortalité est réalisé en tenant compte du nombre des 

larves moribondes et des larves mortes au bout de 24h. 

Sont considérées comme mortes, les larves qui ne bougent pas quand on les touche 

avec une aiguille dans le siphon ou la région cervicale, et sont considérées comme 

moribondes, les larves incapables d’atteindre la surface de l’eau ou de manifester la réaction 

de plongée caractéristique quand on agite l’eau. 

I.2.2.MÉTHODES D’ÉTUDE DES EFFETS SUR LES VÉGÉTAUX 

Effets sur le pouvoir germinatif des graines 

Les graines de différentes espèces (voir paragraphe II.1.2, p. 30) sont désinfectées 

dans de l’eau de javel 10%. 

Deux lots de dix graines de chaque espèce sont mis à germer dans deux boîtes de Petri 

contenant chacune une couche de coton humidifié avec de l’eau distillée. Un des lots est 

arrosé d’extrait à étudier de volume et de concentration déterminés. L’autre lot (témoin) est 

arrosé d’eau de robinet. 

L’expérience s’effectue à l’obscurité à 30°C. Le dénombrement des graines ayant 

germé est effectué au bout de 72h d’incubation. 

Effets sur la croissance des jeunes plantules 

Les expériences portent sur des graines de deux plantes appartenant l’une au groupe 

des Monocotylédones et l’autre à celui des Dicotylédones. 

I.2.2.1.1.Trempage 

Deux lots de dix graines sont trempés dans l’extrait à tester de concentration 

déterminée pendant 24h et/ou 48h et sept lots de dix graines sont trempés dans de l’eau de 

robinet, à 30°C, à l’obscurité.


36 

I.2.2.1.2.Germination 

Après trempage, les graines de chaque lot sont lavées à l’eau de robinet puis réparties 

comme suit : 

• pour les deux lots trempés dans l’extrait à étudier, le premier est arrosé avec le 

même extrait et le deuxième lot arrosé, avec l’eau de robinet (témoin) ; 

• pour les sept lots trempés dans l’eau de robinet, six lots sont arrosés avec différentes 

concentrations de l’extrait à tester et un lot servant de témoin est arrosé avec de 

l’eau de robinet. 

La germination se fait à la lumière. Les épicotyles et les hypocotyles des graines des 

deux espèces sont mesurés tous les deux jours, pendant 14jours. 

Effets sur la levée de la dominance apicale des bourgeons axillaires 

Il s’agit de comparer les effets des extraits à tester avec ceux de deux hormones 

végétales, notamment l’auxine et la gibbérelline qui sont connues respectivement pour leur 

capacité à inhiber et à stimuler la croissance des bourgeons axillaires. 

Des graines de petit pois (Pisum sativum) sont imbibées d’eau de robinet pendant 48h, 

à l’obscurité et à 30°C. Elles sont ensuite transférées dans des boîtes de Petri contenant du 

coton imbibé d’eau de robinet, à raison de 10 graines par boîte. 

Les graines sont laissées se développer à la lumière en arrosant de temps en temps. Les 

plantules obtenues au 9 ème jour sont sélectionnées et seules celles qui présentent au moins 

deux bourgeons axillaires sont retenues. Elles sont décapitées au niveau de la tige, juste audessus 

du deuxième bourgeon axillaire. 

De la lanoline enrichie d’une goutte de substance à étudier (à raison de 1µl par 

application), notamment des extraits à tester, de l’auxine, la gibbérelline et de l’eau distillée 

servant de témoin, est appliquée sur la surface sectionnée de la tige. 

L’observation se porte sur la mesure de la longueur des plantules tous les deux jours 

pendant 14jours. 

I.2.3.ETUDE DES EFFETS SUR LES MICROORGANISMES 

Stérilisation 

La verrerie ainsi que les milieux de culture sont stérilisés selon deux méthodes :


37 

• par la chaleur sèche : procédé réservé aux vases de culture, ballons, tubes à essai, 

boîtes de Petri préalablement nettoyés, nécessitant une étuve à température élevée. 

• par la chaleur humide : les liquides, notamment les milieux de culture sont stérilisés 

par la vapeur sous pression au moyen d’un autoclave (WEBECO). 

Les pipettes graduées sont enveloppées dans du papier kraft avant d’être autoclavées, 

pour éviter l’usure des graduations par l’exposition directe à la chaleur sèche de l’étuve. 

Coloration GRAM 

(MARCHAL, 1992 ; FERRON, 1994) 

L’objectif de cette coloration est de vérifier, dans le cadre de cette manipulation, la 

pureté des souches et de donner une information rapide sur les bactéries, concernant non 

seulement leur forme, mais également leur affinité pour les colorants, affinité liée à la 

structure générale de leur paroi. 


La coloration de Gram est une coloration différentielle basée sur la perméabilité plus 

grande de la paroi des bactéries Gram négatif (Gram-) à l’alcool. Elle consiste à réaliser un 

complexe colorant soluble dans l’alcool (Cristal violet-lugol) qui colore en violet le 

cytoplasme de toutes les bactéries. Chez ces bactéries Gram négatif, la paroi laisse passer le 

mélange alcool-acétone qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries Gram positif 

(Gram+), la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure 

coloré en violet. Le cytoplasme des bactéries Gram négatif est alors coloré en rouge après 

recoloration à la Safranine alors que celui des Gram positif reste bleu. 


Comme les bactéries Gram + peuvent réagir comme des bactéries Gram – pour 

diverses raisons (déchirure mécanique de la paroi cellulaire par ultrason ou friction, fixation à 

la chaleur sur une préparation encore mouillée, vieillissement des bactéries), la coloration 

Gram doit être effectuée selon une méthodologie bien précise et sur des cultures bactériennes 

jeunes de moins de 24 h (EIG, 2005). 

Ainsi, avant de procéder à la coloration proprement dite, il est nécessaire 

d’ensemencer sur gélose-pente les souches issues de la préculture ou des cultures existantes.


38 

I.2.3.1.2.1.Préparation et fixation 

Un frottis obtenu à partir de la culture préparée au préalable est réalisé en utilisant des 

lames propres. Il est laissé se sécher à l’air et fixé à la chaleur par des passages rapides sur la 

flamme d’un bec Bunsen, tout en évitant un excès de chaleur. 

I.2.3.1.2.2.Coloration 

Les solutions utilisées lors de cette coloration sont offertes en kit (« Gram color kit »). 

La composition de ces solutions est donnée en annexe V. 

Les différentes étapes de cette coloration sont : 

• coloration par la solution Cristal violet pendant 30s à 1 minute. La lame est rincée 

délicatement à l'eau ; 

• mordançage au lugol : la solution Lugol-Polyvinylpyrrolidone (PVP) est étalée sur 

le frottis pendant 20s puis la lame est lavée avec de l’eau ; 

• décoloration (rapide) avec la solution Décolorante : le mélange alcool-acétone est 

versé goutte à goutte sur la lame inclinée obliquement, et la décoloration est 

surveillée (5 à 10s). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. La lame est 

rincée sous un filet d'eau ; 

• recoloration à la solution Safranine pendant 30 à 60s. La lame est lavée doucement à 

l'eau.et laissée séchée sur une plaque chauffante à 40°C, 10 à 15min ; 

• la préparation est, à la fin des étapes, observée au microscope avec une goutte 

d'huile à immersion (grossissement x100). 

Tests de sensibilité des microorganismes aux extraits 

I.2.3.1.3.Antibiogramme ou test de diffusion sur gélose 

(LECLERC, 1983 ; SIMONET, 1991 ; BILLE, 1998) 

I.2.3.1.3.1.Principe 

Cette méthode appelée aussi méthode des disques consiste à mesurer la zone 

d’inhibition de la croissance microbienne autour du disque imprégné de l’extrait à tester 

déposé à la surface du milieu de culture gélosé. 

Dans une boite de Petri, le disque est placé sur la surface d’une gélose de Mueller- 

Hinton qui a été préalablement ensemencée avec une culture pure de la souche à étudier.


39 

L’extrait commence à diffuser radialement dans l’agar, réalisant un gradient de concentration 

décroissante autour de ce disque. Les bactéries ensemencées croissent jusqu’à la limite où la 

concentration de l’extrait est suffisante pour inhiber leur croissance. Le diamètre de la zone 

d’inhibition peut alors être mesuré pour évaluer la sensibilité des bactéries. 

Les diamètres des zones ou halos d’inhibition sont interprétés par référence aux 

normes utilisées par l’IPM consignées dans le tableau 5. 

Tableau 5 : Références normatives des diamètres d’inhibition 

Diamètre du halo (x) Résultat Sensibilité du germe 

x


40 

La détermination de la CMI est effectuée toujours selon la technique de diffusion en 

milieu solide. Une dilution en cascade des extraits à étudier est réalisée. Les différentes 

solutions sont déposées sur les disques de papier. La suite des manipulations est identique à 

celle décrite au paragraphe II.2.3.3.1 p. 38. 

La valeur de la CMI de la substance à étudier correspond à la concentration de celle-ci 

donnant un diamètre de halo d’inhibition de 7mm. 

RÉSULTATS 

La toxicité des deux extraits, notamment l’extrait brut aqueux à chaud (EB) obtenu à 

partir de la poudre de feuilles de Xylopia humblotiana et l’extrait purifié E 3 (voir première 

partie) a été estimée en étudiant leur action sur différents systèmes biologiques. 

I.2.4.EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX 

Effets des extraits sur les animaux à sang chaud 

I.2.4.1.1.Toxicité sur souris 

L’extrait E 3 a été testé sur souris par une injection i.p. (suivant la méthode décrite au 

paragraphe II.2.1.1.1 p. 31) pour évaluer sa toxicité aiguë vis-à-vis de cette espèce. 

I.2.4.1.1.1.Description des symptômes d’intoxication 

La dose létale 1,59g/kg a été administrée chez les souris. Les symptômes 

d’intoxication sont observés. Ainsi : 

• immédiatement après l’injection, une hyperactivité et des contorsions abdominales 

des animaux sont notées ; 

• au bout de 10min, les souris traînent leurs pattes postérieures tout en se calmant, une 

piloérection apparaît ; 

• 20min après, les souris deviennent hypoactives : elles se pelotonnent dans un coin 

de la cage, puis une enophtalmie est observée ; 

• une hyperhémie des oreilles apparaît après environ 3h30 et le rythme respiratoire 

ralentit ; 

• après 6h, les souris présentent des convulsions plus ou moins intenses ; 

• la mort survient aux alentours de 6 à 7h après l’injection.


41 

Les souris injectées de la dose sublétale 1,06g/kg présentent quelques-uns des 

symptômes observés chez les souris ayant reçu la dose létale, à savoir une hypoactivité, une 

piloérection et une hyperhémie des oreilles. En revanche, au bout de 24h, les souris se 

rétablissent petit à petit. 

I.2.4.1.1.2.Détermination de la DL 50 (24h) 

En se basant sur les résultats obtenus au cours d’essais préliminaires, six doses ont été 

choisies de façon à ce qu’elles entraînent des taux de mortalité allant de 0 à 100% (voir 

méthode paragraphe II.2.1.1.1.2, p. 31) chez des souris pesant 20±2g. Les doses sont en 

progression géométrique de raison 1,084. Le premier terme est de 1,06g/kg. Les résultats de 

ces tests sont présentés dans le tableau 6. 

Tableau 6 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL 50 (24h) sur 

souris de l’extrait E 3 

Dose en 

g/kg de 

souris 

6h 

7h 

Nombre de décès après 

8h 

10h 

12h 

14h 

16h 

18h 

20h 

22h 

24h 

Nombre de souris 

mortes 

vivantes 

Décès 

(%) 

1,06 0 5 0 

1,15 1 1 4 20 

1,25 1 1 4 20 

1,36 1 1 1 3 2 60 

1,47 1 1 1 1 4 1 80 

1,59 2 1 1 1 5 0 100 

D’après les données du tableau, l’équation de REED et MUENCH (1938) s’écrit : 

log DL50 = log1,25 + 

(0,5 - 0,2) 

(0,6 - 0,2) 

log1,084 

La DL 50 (24h) déduite de cette équation est de l’ordre de 1,327g/kg. 

Les données numériques ayant permis de tracer la courbe des totaux cumulatifs des 

morts et celle des survivants (figure 6) sont résumées dans le tableau 7.


42 

Dose en 

g/kg de 

souris 

Tableau 7 : Totaux cumulatifs des souris survivantes et des souris mortes en 

fonction de la dose 

Nombre de 

souris 

éprouvées 

Nombre de 

souris 

mortes 

Nombre de 

souris 

vivantes 

Totaux 

cumulatifs 

des mortes 

Totaux 

cumulatifs des 

survivantes 

1,06 5 0 5 0 16 

1,15 5 1 4 1 11 

1,25 5 1 4 2 7 

1,36 5 3 2 5 3 

1,47 5 4 1 9 1 

1,59 5 5 0 14 0 

La figure 6 représente les courbes des totaux cumulatifs des mortes et des vivantes. La 

valeur de la DL 50 obtenue par projection à partir de l’intersection des deux courbes est de 

1,325g/kg. 

Nombre de 

souris 

20 

16 

12 

8 

4 

0 

1,06 1,15 1,25 1,36 1,47 1,59 

DL 50 =1,325 

mortes 

survivantes 

Dose en g/kg 

Figure 6 : Courbes de détermination graphique de la DL 50 (REED et MUENCH, 

1938) 

I.2.4.1.2.Pouvoir hémolytique des extraits 

Les effets de l’extrait brut et de l’extrait E 3 ont été étudiés sur une suspension 

d’hématies de mouton, suivant le procédé défini dans le paragraphe II.2.1.1.2 (p. 32). 

La figure 7 montre que les deux extraits provoquent une hémolyse totale à des 

concentrations comprises entre 1 et 2mg/ml. Une hémolyse partielle est observée aux


43 

concentrations allant de 0,25 à 0,5mg/ml et de 0,125 à 0,5mg/ml respectivement pour EB et 

E3. En revanche, à des concentrations inférieures ou égales à 0,125mg/ml pour EB et 

0,062mg/ml pour E3, aucune hémolyse n’est constatée. 

Figure 7 : Résultats du test hémolytique 

T+ : témoin positif 

T- : témoin négatif 

HT : hémolyse totale 

HP : hémolyse partielle 

HN : test hémolytique négatif 

EB : extrait brut 

E3 : extrait purifié 

C : concentration de l’extrait brut ou de l’extrait E 3 

Effets sur les animaux à sang froid 

L’extrait brut a été testé sur des animaux à sang froid selon la méthode décrite dans le 

paragraphe II.2.1.2 (p. 33). 

I.2.4.1.3.Effets de l’extrait brut sur les têtards et les alevins 

I.2.4.1.3.1.Effets sur les têtards de grenouille 

Sept concentrations de l’extrait brut en progression géométrique allant de 51,07 mg/ml 

(CL 0 ) et 204,35 mg/ml (CL 100 ) (raison : 1,26) ont été éprouvées sur sept lots de cinq têtards 

(voir paragraphe II.2.1.2.1.1 p. 34). 

Le tableau 8 affiche les résultats obtenus.


44 

N° lot 

Tableau 8 : Résultats expérimentaux de la détermination de la CL 50 sur les 

têtards de grenouille 

Concentration 

de EB (µg/ml) 

logC 

Nombre de 

morts 

Nombre de 

survivants 

% de décès 

1 51,07 1,71 0 5 0 

2 64,35 1,81 1 4 20 

3 81,08 1,91 1 4 20 

4 102,16 2,01 1 4 20 

5 128,72 2,11 3 2 60 

6 162,18 2,21 4 1 80 

7 204,35 2,31 5 0 100 

L’extrait brut est toxique sur les têtards. Il existe une proportionnalité entre la toxicité 

de l’extrait et sa concentration. 

L’équation de la droite de régression linéaire obtenue d’après le tableau est : 

% Mortalité = 163,75 logC 

- 286,07 

Le coefficient de corrélation correspondant est de 0,95. 

La valeur de logCL 50 déduite de cette formule est égale à 2,052 d’où la CL 50 est 

estimée à 112,72µg/ml. 

I.2.4.1.3.2.Effets sur les alevins de carpe 

Cinq concentrations de l’extrait brut, en progression géométrique de raison 1,189, 

allant de 51,09 et 102,10µg/ml ont été éprouvées sur cinq lots de cinq alevins (voir méthode 

paragraphe II.2.1.2.1.2 p. 34). 

Le tableau 9 récapitule les résultats des tests.


45 

Tableau 9 : Résultats expérimentaux de la détermination de la CL 50 sur les 

alevins de carpe 

N° lot 

Concentration 

de EB (µg/ml) 

logC 

Nombre 

de morts 

Nombre de 

survivants 

Pourcentage 

de décès (%) 

1 51,09 1,71 0 5 0 

2 60,74 1,78 5 0 100 

3 72,22 1,86 5 0 100 

4 85,87 1,93 5 0 100 

5 102,10 2,01 5 0 100 

D’après les données du tableau, l’extrait brut est toxique sur les poissons. 

Aucune valeur intermédiaire entre 0 et 100% de mortalité n’a pu être obtenue. En 

effet, l’intervalle entre la concentration maximale tolérée et la concentration sûrement 

mortelle est très étroit, ce qui rend impossible la détermination de la CL 50 . La toxicité sur les 

poissons obéit à la loi du tout ou rien. 

I.2.4.1.4.Effets de l’extrait brut sur les larves de moustique 

Le test a été effectué selon la méthode décrite au paragraphe II.2.1.2.2 (p. 34). 

Les concentrations limites de l’extrait brut ont été recherchées, mais n’ont pu être 

déterminées parce qu’à des concentrations dépassant largement 3mg/ml, les individus ont tous 

survécu aux tests de toxicité. 

I.2.5.EFFETS SUR LES VÉGÉTAUX 

Les actions de l’extrait brut et de l’extrait E 3 sur la germination, la croissance des 

jeunes plantules et le développement des bourgeons axillaires chez les végétaux ont été 

étudiés. 

Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif de graines 

Les graines des différentes espèces citées dans le paragraphe II.1.2 (p. 30) ont été 

traitées avec l’extrait brut à une concentration unique de 1mg/ml, selon la méthode décrite au 

paragraphe II.2.2.1 (p. 35). 

L’effet de EB sur le pouvoir germinatif des graines est présenté dans le tableau 10.


46 

Tableau 10 : Effets de l’extrait brut à 1mg/ml sur le pouvoir germinatif de 

graines 

FAMILLE 

CUCURBITACEAE 

NOM 

GERMINATION INHIBITION 

NOM USUEL 

SCIENTIFIQUE 

(%) 

(%) 

Cucumis sp. Concombre 100 0 

Cucurbita pepo Courgette 90 10 

SOLANACEAE 

Lycopersicum 

esculentum 

Tomate 80 20 

ASTERACEAE Lactuca sativa Laitue 100 0 

APIACEAE 

FABACEAE 

BRASSICACEAE 

POACEAE 

Daucus carotta Carotte 80 20 

Petroselinum 

crispum 

Persil 70 30 

Phaseolus 

vulgaris 

Haricot rouge 100 0 

Pisum sativum Petit pois 40 60 

Brassica 

oleracae 

Anantsonga 100 0 

Brassica 

chinensis 

Chou de Chine 70 30 

Brassica sp. Tissam white 40 60 

Oryza sativa Riz 100 0 

Zea maÿs Maïs 70 30 

La sensibilité des graines vis-à-vis de EB à la concentration de 1mg/ml n’est pas très 

marquée vu qu’elles germent toutes. En effet, les graines de concombre, de laitue, de haricot 

rouge, d’anantsonga et de riz germent à un taux de 100%. Pour les autres graines, il y a 

inhibition de la germination bien que faible : à des taux allant de 10% pour la courgette à 30% 

pour le persil, le chou de Chine et le maïs. Toutefois, l’inhibition de la germination est plus 

poussée pour les graines de petit pois et de tissam white, étant donné leur capacité à germer 

qui ne dépasse plus 40%.


47 

Effets de l’extrait brut sur la croissance des jeunes plantules 

Différentes concentrations de EB ont été testées sur les graines de riz 

(Monocotylédones) et de haricot rouge (Dicotylédones) qui ont germé en présence d’une 

concentration de 1mg/ml de EB. Il s’agit de vérifier si cette concentration n’a pas suffi à 

inhiber la germination. La méthode adoptée est celle décrite au paragraphe II.2.2.2 (p. 35). 

La figure 8 synthétise les différentes étapes effectuées dans des conditions 

expérimentales précises. 

9 lots de 10 

graines 

2 lots de 10 graines trempés 

dans EB 15,5mg/ml 

Trempage : 

Haricot = 24h 

Riz = 48h 

7 lots de 10 graines trempés 

dans de l'eau 

1 lot arrosé avec 



6 lots arrosés 

EB 15,5mg/ml 

de l'eau 

de l'eau 

avec différentes 

concentrations 

de EB 

1 lot arrosé 

1 lot arrosé 

1 lot arrosé 

1 lot arrosé 

1 lot arrosé 

1 lot arrosé 

avec EB 

avec EB 

avec EB 

avec EB 

avec EB 

avec EB 

0,48mg/ml 

0,97mg/ml 

1,93mg/ml 

3,88mg/ml 

7,75mg/ml 

15,5mg/ml 

Figure 8 : Schéma récapitulatif de l’expérience sur la croissance des jeunes 

plantules 

Les épicotyles et les hypocotyles des graines des deux espèces ont été mesurés tous les 

deux jours pendant toute la durée de l’expérience. 

Les résultats sont montrés sur les figures 9 à 16 (p. 48 à 52).


48 

Pour le haricot, les graines du lot trempé dans EB à la concentration de 15,5 mg/ml, 

puis arrosé avec ce même extrait, poussent en général même si la longueur de leurs épicotyles 

et hypocotyles n’atteint pas celle du témoin. Toutefois, un retard dans la croissance est noté 

tout au début des expériences. 

Par contre, pour le lot trempé dans l’eau mais arrosé avec EB à 15,5mg/ml, une 

inhibition de la croissance des graines est observée. En effet, les pousses n’apparaissent qu’au 

bout de 8 jours et 12 jours après le semis, respectivement pour les épicotyles et les 

hypocotyles (figures 9 et 10). 

En revanche chez le riz, le trempage n’engendre aucune différence notable lorsque les 

graines sont arrosées avec EB à 15,5mg/ml. En effet, les épicotyles et les hypocotyles ne 

croissent pratiquement pas (figures 11 et 12). 

La croissance des graines trempées dans EB et arrosées avec de l’eau est inhibée par 

rapport au témoin. 

Longueur 

(mm) 

250 

200 

150 

100 

50 

E/EB 

EB/EB 

EB/E 

0 

2 4 6 8 10 12 14 

Durée de l'observation (nombre de jours) 

E/E 

Figure 9 : Croissance des épicotyles de haricot en fonction du trempage 

E/EB : lot trempé dans l’eau mais arrosé avec EB à 15,5mg/ml 

EB/EB : lot trempé dans EB à 15,5 mg/ml puis arrosé avec ce même extrait 

EB/E : lot trempé dans EB à 15,5mg/ml mais arrosé avec de l’eau 

E/E: lot trempé dans l’eau puis arrosé avec de l’eau (témoin)


49 

Longueur 

(mm) 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

2 4 6 8 10 12 14 


E/EB 

EB/EB 

EB/E 

E/E 

Figure 10 : Croissance des hypocotyles de haricot en fonction du trempage 




E/E : lot trempé dans l’eau puis arrosé avec de l’eau : lot témoin 

Longueur 

(mm) 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

2 4 6 8 10 12 14 


E/EB 

EB/EB 

EB/E 

E/E 

Figure 11 : Croissance des épicotyles de riz en fonction du trempage 




E/E : lot trempé dans l’eau puis arrosé avec de l’eau : lot témoin


50 

Longueur 

(mm) 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

2 4 6 8 10 12 14 


E/EB 

EB/EB 

EB/E 

E/E 

Figure 12 : Croissance des hypocotyles de riz en fonction du trempage 




E/E : lot trempé dans l’eau puis arrosé avec de l’eau : lot témoin 

Concernant les lots mis à germer dans l’eau mais arrosés avec différentes 

concentrations de EB, une inhibition avec relation dose-effet est notée. En effet, l’inhibition 

de la croissance des épicotyles et des hypocotyles est d’autant plus poussée pour les deux 

graines lorsqu’elles sont traitées avec de fortes concentrations de EB (figures 13 à 16). 

Cependant, les jeunes plantules de riz sont plus sensibles à EB que celles de haricot. 

Longueur 

(mm) 

250 

200 

150 

100 

50 

0 

Epicotyle de haricot 

2 4 6 8 10 12 14 


15,5mg/ml 

7,75mg/ml 

3,88mg/ml 

1,93mg/ml 

0,97mg/ml 

0,48mg/ml 

0mg/ml 


des épicotyles de haricot


51 

Longueur 

(mm) 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

Hypocotyle de haricot 

2 4 6 8 10 12 14 

Duré e de l'obse rvation (nombre de jours) 

15,5mg/ml 

7,75mg/ml 

3,88mg/ml 

1,93mg/ml 

0,97mg/ml 

0,48mg/ml 

0mg/ml 


des hypocotyles de haricot 

Longueur 

(mm) 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

Epicotyle de riz 

2 4 6 8 10 12 14 


15,5mg/ml 

7,75mg/ml 

3,88mg/ml 

1,93mg/ml 

0,97mg/ml 

0,48mg/ml 

0mg/ml 


des épicotyles de riz


52 

Longueur 

(mm) 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

Hypocotyle de riz 

2 4 6 8 10 12 14 


15,5mg/ml 

7,75mg/ml 

3,88mg/ml 

1,93mg/ml 

0,97mg/ml 

0,48mg/ml 

0mg/ml 


des hypocotyles de riz 

Le tableau 11 résume les pourcentages d’inhibition de la croissance des épicotyles et 

hypocotyles des deux espèces étudiées (le riz et le haricot) au 14 ème jour de l’expérience. Ces 

pourcentages sont calculés par rapport à la croissance des lots témoins de chaque espèce. 

Tableau 11 : Croissance des jeunes plantules en présence de EB à différentes 

concentrations : pourcentage d’inhibition au 14 ème jour 

Concentration 

de EB (mg/ml) 

POURCENTAGE D’INHIBITION (%) 

HARICOT 

RIZ 

hypocotyle épicotyle hypocotyle épicotyle 

0 0 0 0 0 

0,48 7 19,23 59,83 27,46 

0,97 11,20 44,71 72,65 43,4 

1,93 13 49,33 87,18 51,15 

3,88 16 56,73 89,23 52,83 

7,75 24 66,35 93,85 57,44 

15,5 60 93,27 94,44 58,07


53 

Effets des extraits sur la croissance des bourgeons axillaires 

Les plantules de petit pois ont été traitées avec les hormones végétales : auxine et 

gibbérelline, avec l’extrait brut et l’extrait, et l’eau distillée comme témoin (méthode décrite 

au paragraphe II.2.2.3, p. 36). 

D’après la figure 17, la croissance des bourgeons axillaires est stimulée sous l’effet de 

l’extrait brut. En effet, durant toute la durée de l’observation, la longueur de ces bourgeons est 

supérieure à la normale (témoin). Quant à l’extrait, il n’a pas d’effet notable sur la croissance 

des bourgeons axillaires. 

Longueur 

(mm) 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

Croissance des bourgeons axillaires 

2 4 6 8 10 12 14 


auxine 

eau distillée 

gibbérelline 

extrait brut 

extrait E3 

Figure 17 : Effets des différentes substances sur la croissance des bourgeons 

axillaires 

I.2.6.EFFETS SUR LES MICROORGANISMES 

Identification des germes-tests 

Quatre bactéries ont été utilisées comme germes-tests. Leurs caractéristiques, 

déterminées par la coloration Gram (voir méthode paragraphe II.2.3.2, p. 37), sont présentées 

dans le tableau 12.


54 

Tableau 12 : Caractéristiques des germes-tests 

GERMES FORME COLORATION TYPE 

Klebsiella pneumoniae bacille rouge Gram- 

Salmonella typhi bacille rouge Gram- 

Escherichia coli bacille rouge Gram- 

Staphylococcus aureus coque bleu Gram+ 

Sensibilité des microorganismes aux extraits 

La sensibilité des microorganismes à EB et E 3 a été évaluée. 

I.2.6.1.1.Activité antibactérienne des extraits 

Deux concentrations de EB égales à 209,22 mg/ml (concentration initiale de EB) et 

104,61 mg/ml (moitié de la concentration initiale de EB), et de E3 qui sont de 132,82 mg/ml 

(concentration correspondante à la DL 100 sur souris) et 88,58 mg/ml (concentration 

correspondante à la DL 0 ) ont été utilisées pour établir leur spectre d’activité antibactérienne 

au niveau de ces quatre souches (voir méthode paragraphe II.2.3.3.1, p. 38). 

Seules les souches Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus présentent des 

zones d’inhibition de croissance autour des disques. 

1 : EB à 209,22 mg/ml 

2 : EB à 104,61 mg/ml 

1’ : E 3 à 132,82 mg/ml 

2’ : E 3 à 88,58 mg/ml 

Figure 18 : Résultat du test d’activité des extraits sur Klebsiella pneumoniae


55 

1 : EB à 209,22 mg/ml 

2 : EB à 104,61 mg/ml 

3 : E 3 à 88,58 mg/ml 

Figure 19 : Résultat du test d’activité des extraits sur Staphylococcus aureus 

Les résultats sont résumés dans le tableau 13. 

D’après ce tableau, seule la souche Klebsiella pneumoniae est très sensible aux deux 

extraits aux concentrations testées. Staphylococcus aureus est assez sensible uniquement à 

l’extrait brut. 

Tableau 13 : Résultats des tests d’activité par la méthode des disques en milieu 

solide 

Nom des 

souches 

Escherichia 

coli 

Klebsiella 

pneumoniae 

Salmonella 

typhi 

Staphylococcu 

s aureus 

Concentrations des 

extraits (mg/ml) 

EB 

E3 

EB 

E3 

EB 

E3 

EB 

E3 

Diamètres des halos 

d’inhibition (mm) 

104,61 6 - 

Sensibilité des 

souches 

209,22 6 - 

88,58 6 - 

132,82 6 - 

104,61 10 +++ 

209,22 11 +++ 

88,58 9 ++ 

132,82 10 +++ 

104,61 6 - 

209,22 6 - 

88,58 6 - 

132,82 6 - 

104,61 6 - 

209,22 8 + 

88,58 6 - 

132,82 6 -


56 

I.2.6.1.2.Détermination de la CMI 

L’activité des extraits sur la souche la plus sensible Klebsiella pneumoniae est 

appréciée par mesure de leur CMI sur cette souche (voir méthode paragraphe II.2.3.3.2, p. 

39). Différentes concentrations des extraits ont été préparés par dilution en cascade à partir 

des concentrations 209,22 mg/ml pour EB et à partir de 88,58 mg /ml pour E 3 . 

Selon les résultats obtenus, qui sont illustrés sur les figures 20 et 21 et présentés dans 

le tableau 14, les CMI pour la souche étudiée sont respectivement de 26,15 mg/ml pour EB et 

44,29 mg/ml pour E 3 . L’extrait brut est plus actif sur la souche Klebsiella pneumoniae que 

l’extrait E 3 . 

1 : extrait brut à 209,22 mg/ml 






T : eau distillée (témoin) 

Figure 20 : Résultat de la détermination de la CMI de l’extrait brut pour 

Klebsiella pneumoniae


57 

1 : E 3 à 88,58 mg/ml 

2 : E 3 à 44,29 mg/ml 

3 : E 3 à 22,15 mg/ml 

4 : E 3 à 11,07 mg/ml 

5 : E 3 à 5,54 mg/ml 

6 : E 3 à 2,77 mg/ml 

T : eau distillée (témoin) 

Figure 21 : Résultat de la détermination de la CMI de l’extrait E 3 pour Klebsiella 

pneumoniae 

Tableau 14 : Résultats de la mesure de la CMI par la méthode des 

disques en milieu solide 

Souche 

Klebsiella 

pneumoniae 

Concentration des 

extraits (mg/ml) 

Diamètres des 

halos d’inhibition 

0 6 

6,54 6 

13,08 6 

EB 

26,15 7,5 

53,05 7,5 

104,61 9 

209,22 11 

E 3 11,07 6 

0 6 

2,77 6 

5,54 6 

22,15 6 

44,29 7 

88,58 9


58 

DISCUSSION ET CONCLUSIONS 

Les extraits de feuilles de Xylopia humblotiana sont toxiques sur des organismes 

animaux, végétaux et microbiens. 

L’extrait purifié E 3 exerce une activité toxique sur souris. 

Plusieurs symptômes, dont des contorsions abdominales, une piloérection, une 

hypoactivité, une enophtalmie, une hyperhémie et des convulsions ont été remarqués chez des 

souris après administration par voie i.p. de cet extrait E 3 . L’apparition des signes de 

piloérection et l’enophtalmie suggère une atteinte au niveau du système nerveux autonome. 

Celle de l’hypoactivité et des convulsions témoigne que le système nerveux central pourrait 

être affecté. Une atteinte au niveau du système cardiovasculaire et du système respiratoire 

pourrait être à l’origine de l’hyperhémie (CHAN, 1984). 

La DL 50 (24h) sur souris est estimée entre 1,325 et 1,327g/kg de souris pour l’extrait 

purifié. 20% des souris testées sont tuées par l’injection d’une dose de 1,15g/kg. L’extrait E 3 

est moins toxique que l’extrait de feuilles de Pittosporum verticillatum (DL 50 comprise entre 

43,65mg/kg et 49,15mg/kg) (ARIJAONA, 2005), mais il est plus toxique comparé à l’extrait 

de tubercules de Dioscorea antaly (DL 50 comprise entre 2,88g/kg et 2,93g/kg) 

(RANDRIAMAMONJY, 2005). Par ailleurs, l’extrait de graines de Albizia tulearensis 

(RAONIHARISOA, 2003) s’avère être très toxique puisque sa DL 50 est comprise entre 2,9 à 

3,6mg/kg de souris. Une valeur de la DL 50 de 1,3g/kg de souris permet donc de classer 

l’extrait de Xylopia humblotiana parmi les substances légèrement toxiques (BRUN, 1963). 

L’extrait brut et l’extrait purifié E 3 sont hémolytiques. 

A la lumière des résultats du test sur les hématies de mouton, l’extrait E 3 exerce un 

pouvoir hémolytique à une concentration plus faible que celle de l’extrait brut ; la purification 

de l’extrait a donc permis d’accentuer son action hémolytique. Ceci pourrait être dû à 

l’élimination de certains contaminants. 

L’extrait brut est toxique sur les têtards à la concentration de 64,35µg/ml. Sa 

concentration létale 50 (CL 50 ) est estimée à 112,72µg/ml.


59 

Il est également très toxique sur les alevins de carpe avec une CL 100 de 60,74µg/ml. La 

valeur de la CL 50 n’a pu être déterminée parce que la toxicité de l’extrait de X. humblotiana 

vis-à-vis de ces poissons obéit à la loi du tout ou rien. 

L’extrait brut de X. humblotiana tue 100% des poissons à des concentrations 

supérieures ou égales à 60,74µg/ml. Cette sensibilité des poissons à l’extrait pourrait être due 

à l’exposition directe de leurs branchies richement vascularisées aux toxines présentes dans 

les solutions. 

Les larves de Culex quinquefasciatus montrent une forte résistance à l’extrait brut 

même à une concentration de 3,68mg/ml. Une éventuelle utilisation de l’extrait de Xylopia 

humblotiana en tant que larvicide serait donc inadaptée puisque, non seulement elle exige une 

forte concentration de l’extrait mais présente des conséquences néfastes vis-à-vis d’autres 

organismes vivants de l’écosystème (têtards de grenouille, poissons…). 

L’extrait brut de X. humblotiana exerce une action inhibitrice au niveau de la 

germination des végétaux. Cette inhibition diffère selon l’espèce végétale et même selon la 

famille. Cette différence d’inhibition pourrait donc être attribuée à une différence 

physiologique au niveau des plantes étudiées plutôt qu’aux seuls effets de l’extrait. 

L’extrait brut inhibe la croissance des jeunes plantules. En effet, pour les graines 

trempées dans l’eau et arrosées avec des concentrations croissantes de l’extrait brut, 

l’inhibition de la croissance est proportionnelle à la concentration, un effet-dose est noté. 

L’extrait brut exerce un effet stimulateur sur la croissance des bourgeons axillaires. 

Cela pourrait être dû à la présence de substances de croissance dans cet extrait brut ou à un 

effet de synergie entre les principes actifs et d’autres substances (MAYER and POLJAKOFF- 

MAYBER, 1963). En revanche, la diminution de cet effet stimulateur pour l’extrait E 3 

pourrait être due à la disparition de certaines substances actives, suite à la purification 

partielle. 

Les extraits brut et E 3 sont actifs sur quelques-uns des microorganismes étudiés. 

Ainsi, Klebsiella pneumoniae s’avère être le plus sensible au pouvoir d’inhibition des 

extraits de X. humblotiana avec des CMI respectives de 26,15 mg/ml et 44,29 mg/ml pour EB 

et E 3 . Staphylococcus aureus montre une résistance aux extraits brut et E 3 à de faibles


60 

concentrations, mais son développement est affecté à une dose plus élevée de l’extrait brut. 

Quant aux deux autres souches, Escherichia coli et Salmonella typhi, aucune activité des deux 

extraits n’a pu être relevée aux concentrations testées. 

Klebsiella pneumoniae est à l'origine de certaines infections des voies respiratoires 

comme celles des poumons et des bronches ainsi que des angines, plus spécifiquement chez 

les sujets fragilisés comme les diabétiques, les personnes âgées ou encore les alcooliques, 

l’activité des extraits sur Klebsiella pneumoniae devrait faire l’objet d’études plus 

approfondies, en vue d’une utilisation dans la thérapeutique des maladies respiratoires 

infectieuses. 

De tout cela ressort le fait que les extraits de feuilles de Xylopia humblotiana sont 

faiblement toxiques pour les animaux à sang chaud mais très toxiques pour les animaux à 

sang froid. Ils exercent un effet inhibiteur sur les végétaux et une activité antimicrobienne.

CONCLUSION GENERALE ET 

PERSPECTIVES

Conclusion et perspectives 

61 

Au terme du présent travail, nous avons pu : 

• acquérir de nombreuses techniques biochimiques, chimiques, toxicologiques et 

microbiologiques couramment utilisées en sciences médicales ; 

• fournir des données sur les propriétés chimique et toxicologique des extraits de 

feuilles de Xylopia humblotiana ; 

• établir une base référentielle utilisable pour orienter des recherches futures sur la 

plante. 

L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce travail a permis de justifier l’intérêt porté 

à l’égard de Xylopia humblotiana. En effet, bien que pauvres en familles chimiques, les extraits de 

cette plante présentent des propriétés qui pourraient être exploitées à des fins utiles. Ce qui ouvre 

de nombreuses perspectives de recherche. 

Ainsi, dans l’avenir, nous nous proposons de : 

• rechercher des améliorations sur les méthodes d’extraction et de purification afin 

d’obtenir des principes toxiques totalement purifiés ; 

• identifier les molécules responsables des activités biologiques et les exploiter pour 

d’éventuelles applications ; 

• procéder à une étude visant à établir une relation structure-activité ; 

• déterminer les raisons, génétiques ou autres, expliquant l’absence de composés 

alcaloïdiques dans les extraits de feuilles de la plante ; 

• prospecter des composés actifs éventuellement présents au niveau des autres 

organes.

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ANNEXES

ANNEXE I : Composition du réactif utilisé pour la révélation des 

chromatogrammes 

Réactif à la vanilline sulfurique 

Vanilline 0,5g 

H 2 SO 4 concentré 

100ml 

ANNEXE II : Composition des réactifs utilisés pour la détection des alcaloïdes 

1) Réactif de Mayer 

Chlorure de mercure 1,36g 

Iodure de potassium 

5g 

Eau distillée qsp 

100ml 

2) Réactif de Dragendorff 

Le réactif de Dragendorff est composé d’un mélange de deux solutions A et B : 

• Solution A 

Nitrate de Bismuth 1,7g 

Acide tartrique concentré 20g 


30ml 

• Solution B 



10g 

40ml 

3) Réactif de Wagner 


2g 

Iode 1,27g 


100ml

ANNEXE III : Tampon Phosphate Buffered Saline (PBS) composé de : 

KH 2 PO 4 0,210g 

Na 2 HPO 4 0,724g 

NaCl 7,65g 


10l 

ANNEXE IV : A- Composition générale des milieux de culture 

1) Milieu de MUELLER-HINTON 

Formule-type (g/l) 

Extrait de viande 2,0 

Peptone trypsique de caséine 17,5 

Amidon 1,5 

Agar 15,0 

pH=7,3±0,1 à 25°C 

2) BOUILLON NUTRITIF 

Formule-type (g/l) 

Extrait de viande 1,0 

Extrait de levure 2 

Peptone 5,0 

Chlorure de sodium 5,0 

pH=6,8±0,2 à 25°C 

ANNEXE IV : B- Préparation à partir des milieux déshydratés 

Préparation du milieu de Mueller-Hinton (Agar) : 

• dissoudre 36g de milieu déshydraté dans de l’eau distillée en agitant 

continuellement puis ajuster à 1L; 

• chauffer le milieu jusqu’à dissolution totale sur une plaque chauffante toujours en 

remuant avec un agitateur magnétique ; 

• répartir en tubes de façon à obtenir un volume de 15ml environ par tube après 

stérilisation ; 

• autoclaver à 121°C à 2bars pendant 15min. 

Préparation du bouillon nutritif : 

• peser 13g de milieu déshydraté et suspendre dans 1L d’eau distillée 

• porter le mélange à ébullition jusqu’à dissolution totale en agitant régulièrement ;

• répartir la quantité appropriée en tubes de telle sorte qu’après stérilisation le volume 

obtenu soit égal à 4,5ml environ dans chaque tube ; 

• stériliser pendant 15min à 121°C et à 2bars au moyen de l’autoclave. 

ANNEXE V : Composition du GRAM COLOR KIT 

Les solutions qui composent le GRAM COLOR KIT sont toutes des solutions 

aqueuses, excepté la Solution Décolorante. 

Solution Cristal Violet 

Solution Lugol-PVP 

Solution Décolorante 

Solution Safranine 

Cristal Violet 2% 

Alcool éthylique 20% 

Oxalate d’ammonium 0,8% 

Iode 1,3% 

Iodure de potassium 2% 

PVP (Polyvinylpyrrolidone) 7% 

Alcool 95°C 50% 

Acétone 50% 

Safranine 0,25% 

Alcool éthylique 10%

Name: RASOLONDRAIBE Onjasoa Nambinina 

Subject: Chemical and toxicological study of the toxic leave extracts of Xylopia humblotiana 

(ANNONACEAE) 

ABSTRACT 

A toxic activity was found in the leaves of Xylopia humblotiana, an endemic species 

of Madagascar belonging to the Annonaceae family. 

A crude extract of bitter taste, obtained through hot aqueous extraction, was purified 

according to a procedure including a precipitation by ethanol and two successive steps of 

fractionation, one by ethyl acetate and the other by n-butanol in order to obtain an extract 

partially purified E 3 of which the yield in toxins is equivalent to 6.46%. 

The toxic principles of the extracts are thermostable, soluble in water, acetone 50% 

and ethanol 50% and belong to the chemical families of tannins and/or leucoanthocyans. 

E 3 injected in mouse by intraperitoneal route causes symptoms suggesting a probable 

attack to the central and autonomous nervous systems and to the respiratory and 

cardiovascular systems. The LD 50 (24h) on mouse is estimated between 1.325 and 1.327g/kg. 

The crude extract is toxic on frog tadpoles with a LC 50 of 112.72µg/ml. The activity of 

this crude extract on carp alevins obeys to the law of the “all or nothing”, acting with a LC 100 

of 60.74µg/ml. The larvae of mosquitoes show resistance to this extract to the concentration at 

3mg/ml. 

The crude extract inhibits the germination of Monocotyledon and Dicotyledon seeds. 

It also causes a delay of the growth of young kidney bean and rice seedlings to a dose at 

15.5mg/ml. The growth of the axillary buds of green pea is strongly stimulated by this crude 

extract and to a less extent by E 3 . 

The leave extracts present an antimicrobial activity. Klebsiella pneumoniae is the most 

sensitive to the crude and E 3 extracts. These extracts have respective values of CMI of 

26.15mg/ml and 44.29mg/ml for this germ. 

Key words: Xylopia humblotiana, Annonaceae, toxic, LD 50 , LC 50 , antimicrobial activity. 

Supervisors: Doctor RAKOTO-RANOROMALALA D. A. Doll 

Professor JEANNODA Victor

Nom : RASOLONDRAIBE Onjasoa Nambinina 

Sujet : Etude chimique et toxicologique des extraits toxiques de feuilles de Xylopia 

humblotiana (ANNONACEAE) 

RESUME 

Une activité toxique a été mise en évidence dans les feuilles de Xylopia humblotiana, 

plante endémique de Madagascar appartenant à la famille des Annonaceae. 

Un extrait brut de goût amer, obtenu par extraction aqueuse à chaud, a été purifié selon 

un protocole comportant une étape de précipitation à l’éthanol et deux étapes successives de 

fractionnement, l’une par l’acétate d’éthyle et l’autre par le n-butanol. Un extrait purifié E 3 a 

été obtenu avec un rendement en toxines de 6,46%. 

Les principes toxiques contenus dans les extraits sont thermostables, solubles dans 

l’eau, l’acétone 50% et l’éthanol 50% et appartiennent aux familles chimiques des tanins et/ou 

leucoanthocyanes. 

Chez la souris, l’extrait E 3 injecté par voie intrapéritonéale entraine des symptômes 

suggérant une atteinte probable du système nerveux central et autonome et du système 

respiratoire et cardiovasculaire. La DL 50 (24h) sur souris se situe entre 1,325 et 1,327g/kg. 

L’extrait brut est toxique sur les têtards de grenouille avec une CL 50 de 112,72µg/ml. 

L’activité de cet extrait brut sur les alevins de carpe obéit à la loi du tout ou rien : la CL 100 est 

de 60,74µg/ml. Les larves de moustique montrent une résistance à l’extrait brut à la 

concentration de 3mg/ml. 

L’extrait brut inhibe la germination de graines de Monocotylédones et de 

Dicotylédones. Il provoque également un retard de croissance des jeunes plantules de haricot 

rouge et de riz à une dose de 15,5mg/ml. La croissance des bourgeons axillaires de petits pois 

est fortement stimulée par cet extrait brut et dans une moindre mesure par E 3 . 

Les extraits de feuilles présentent une propriété antimicrobienne. Klebsiella 

pneumoniae est la plus sensible aux extraits brut et E 3 . Ces extraits ont des CMI respectives 

de 26,15mg/ml et de 44,29mg/ml, vis-à-vis de ce germe. 

Mots clés : Xylopia humblotiana, Annonaceae, toxique, DL 50 , CL 50 , propriété 

antimicrobienne. 

Encadreurs : Docteur RAKOTO-RANOROMALALA D. A. Doll 

Professeur JEANNODA Victor

Etude chimique et toxicologique des principes toxiques des extr

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