Protein(5) 2007B.pdf

蛋 白 質
● 蛋 白 質 構 造
● 蛋 白 質 性 質 :
變 性 及 復 性
蛋 白 質 構 形 是 活 動 的
蛋 白 質 的 專 一 性 結 合
● 蛋 白 質 研 究 技 術 :
蛋 白 質 純 化 技 術
蛋 白 質 性 質 與 構 造 檢 定
胺 基 酸 序 列 決 定 法
蛋 白 質 的 大 部 分 性 質 , 都 與 其 分 子 構 形 有 關 。
當 蛋 白 質 維 持 正 確 構 形 時 , 即 為 其 原 態 分 子 , 就 可 進 行 種 種 活 動 ; 當 構 形 瓦 解 時 即 為 變 性 ,
大 部 份 都 喪 失 活 性 。 我 們 將 探 討 如 何 維 持 蛋 白 質 的 正 確 構 形 , 如 何 使 蛋 白 質 變 性 ; 同 時 將 討
論 蛋 白 質 的 構 形 , 事 實 上 也 非 固 定 不 動 的 , 而 是 經 常 在 活 動 著 。
兩 個 蛋 白 質 分 子 之 間 , 可 能 會 有 特 殊 的 專 一 性 結 合 力 , 以 便 進 行 很 多 細 胞 生 理 反 應 , 這 也 跟
其 分 子 間 構 形 的 互 補 有 極 大 的 關 係 ; 同 時 分 子 間 的 微 弱 吸 引 力 ( 二 級 鍵 ), 也 是 這 種 專 一 性 的 主
要 構 成 力 量 。
生 物 化 學 的 實 驗 技 術 中 , 蛋 白 質 純 化 是 很 重 要 且 基 本 的 工 具 , 上 課 部 份 只 列 出 講 義 , 但 沒 有
在 課 堂 講 述 。 若 有 興 趣 或 研 究 上 之 需 要 , 請 上 網 頁 『 酵 素 純 化 與 分 析 』 載 有 各 種 蛋 白 質 的 純
化 與 分 析 方 法 (http://juang.bst.ntu.edu.tw/M1230/index.htm)。
P5-1

蛋 白 質 構 形 之 變 性 與 復 性
原 態 蛋 白 質
Native protein
變 性 denaturation
各 級 構 造 解 構
復 性 renaturation
變 性 蛋 白 質
Denatured protein
Juang RH (2007) BCbasics
雖 然 部 份 蛋 白 質 經 變 性 後 可 以 在 變 性 條 件 去 除 後 , 回 復 原 態 蛋 白 質 , 但 並 非 所 有 蛋 白 質 均 可
如 此 。 請 如 下 表 整 理 出 組 成 蛋 白 質 各 級 構 造 的 鍵 結 力 量 , 然 後 看 那 些 因 素 可 以 破 壞 這 些 力
量 , 就 是 使 蛋 白 質 變 性 的 方 法 。
構 成 力 量 共 價 鍵 非 共 價 鍵 破 壞 方 式
一 級 構 造
二 級 構 造
三 級 構 造
四 級 構 造
P5-2

變
性
後
不
一
定
能
夠
復
性
用 高 濃 度 尿 素 及
還 原 劑 可 使
蛋 白 質 變 性
而 失 去 活 性
去 除 上 述 變 性 劑
可 使 蛋 白 質 回 復
原 態 而 恢 復 活 性
是 為 復 性
並 非 所 有 蛋 白 質
均 可 順 利 復 性
恢 復 原 來 活 性
Darnell et al (1999) Molecular Cell Biology (2e) p.55
RNase 可 以 用 尿 素 與 mercaptoethanol 造 成 變 性 , 暫 時 失 去 活 性 ; 但 是 當 變 性 劑 去 出 之 後 ,
RNase 會 記 得 原 來 的 構 形 , 恢 復 原 來 的 活 性 。 當 然 , 有 部 份 RNase 分 子 可 能 會 摺 疊 錯 誤 , 因
此 無 法 回 復 原 態 。
P5-3

常 見 的 蛋 白 質 變 性 劑
Urea
Guanidine HCl
O
=
NH 2
-C-NH 2
NH 2
+
=
NH 2
-C-NH 2
Cl -
Mercaptoethanol
HOCH 2
CH 2
SH
SDS SO 4-
-(CH 2
) 11
CH 3
Juang RH (2007) BCbasics
常 見 的 幾 種 變 性 劑 , 各 有 其 變 性 機 制 , 都 是 因 於 其 分 子 構 造 的 特 點 所 致 , 說 明 於 後 。
P5-4

蛋
白
質
二
級
構
造
受
到
尿
素
破
壞
α helix
=
O
NH 2
-C-NH 2
O
NH2 -C-NH 2
=
β sheet
兩 者 都 由
氫 鍵 組 成
Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.164
蛋 白 質 的 二 級 構 造 純 由 氫 鍵 所 組 成 , 是 利 用 蛋 白 質 骨 架 上 的 -C-CO-N- 與 另 一 個 氮 原 子 所 夾
成 的 , 而 且 數 目 極 多 , 因 此 可 穩 定 蛋 白 質 的 結 構 。 尿 素 或 guanidine HCl 的 分 子 構 造 模 擬 上 述 -
C-CO-N- 並 取 代 之 , 因 此 可 破 壞 二 級 構 造 ; 又 因 二 級 構 造 上 的 氫 鍵 數 目 極 大 , 因 此 要 使 用 相
當 高 濃 度 的 尿 素 (2 M~8 M)。
P5-5

SDS 是 一 種 介 面 活 性 劑
極 性 頭 部
非 極 性 尾 巴
sodium dodecyl sulfate
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.275
SDS (sodium dodecyl sulfate) 是 一 種 界 面 活 性 劑 , 其 分 子 同 時 含 有 極 性 的 硫 酸 基 團 , 以 及 非 極
性 的 十 二 碳 飽 和 碳 氫 兩 個 部 份 。
P5-6

SDS 在 蛋 白 質 表 面 均 勻 敷 上 一 層 負 電 荷
SDS
原 態 蛋 白 質
boiling
變 性 蛋 白 質 成 一 線 狀 分 子
並 且 均 勻 帶 上 一 層 負 電 荷
Juang RH (2007) BCbasics
SDS 是 強 力 的 分 子 變 性 劑 , 其 非 極 性 部 份 可 進 入 蛋 白 質 的 疏 水 性 核 心 , 與 其 疏 水 性 胺 基 酸 基
團 結 合 ; 同 時 極 性 部 份 露 出 蛋 白 質 外 , 與 環 境 的 水 分 子 結 合 。 如 此 , 就 會 把 蛋 白 質 的 內 部 翻
出 來 , 使 蛋 白 質 分 子 變 性 , 成 為 一 條 沒 有 構 形 的 長 條 分 子 , 並 且 分 子 表 面 均 勻 地 塗 佈 上 一 層
SDS 的 負 電 荷 。 蛋 白 質 經 SDS 處 理 後 , 可 以 在 膠 體 電 泳 中 依 其 分 子 量 大 小 泳 動 , 是 極 為 有 用
的 分 析 工 具 。
P5-7

Beta-mercaptoethanol
HOCH 2
CH 2
SH
α
β
HOCH 2
CH 3
HOCH 2
CH 2
SH
HOCH 2
CH 2
SH
HOCH 2
CH 2
S
+
+ 1 2
o 2
H 2
O
HOCH 2
CH 2
S
Oxidized form
酵 素
S
S
HOCH 2
CH 2
SH
酵 素
SH
SH
雙
硫
鍵
斷
裂
構
形
會
改
變
Juang RH (2007) BCbasics
β-Mercaptoethanol 構 造 很 像 乙 醇 , 但 多 了 一 個 -SH 基 。 此 -SH 基 可 以 吸 收 氧 分 子 , 以 防
止 氧 化 反 應 破 壞 蛋 白 質 構 形 , 可 說 是 犧 牲 了 自 己 來 拯 救 蛋 白 質 。 但 mercaptoethanol 也 會 對 蛋
白 質 上 的 雙 硫 鍵 -S-S- 進 行 還 原 動 作 , 成 為 兩 個 -SH 基 團 , 同 時 瓦 解 部 份 的 三 級 構 造 , 使 蛋 白
質 構 形 改 變 而 致 變 性 。
在 早 期 的 女 子 美 容 院 裡 , 經 常 聞 到 mercaptoethanol 的 獨 特 含 硫 味 道 。 因 為 燙 髮 過 程 中 , 先 要
用 mercaptoethanol 把 頭 髮 蛋 白 質 上 的 雙 硫 鍵 打 斷 , 把 頭 髮 重 新 捲 好 之 後 , 再 加 熱 並 氧 化 產 生
新 的 雙 硫 鍵 , 如 此 固 定 了 頭 髮 蛋 白 質 後 , 頭 髮 就 會 永 遠 捲 曲 。
P5-8

蛋
白
質
的
構
形
不
是
固
定
的
Hexokinase
看 漫 畫 學 遺 傳 (1987) p.112
蛋 白 質 或 酵 素 並 非 死 板 板 的 分 子 , 而 是 有 相 當 大 的 彈 性 。 上 面 是 『 看 漫 畫 學 遺 傳 』 一 書 中 ,
說 明 酵 素 作 用 的 卡 通 圖 , 書 中 的 酵 素 還 畫 得 相 當 誇 張 , 像 一 隻 會 動 的 大 嘴 巴 。 以 後 當 你 仔 細
學 了 酵 素 的 作 用 機 制 後 , 會 瞭 解 其 實 這 些 卡 通 還 蠻 傳 真 的 , 有 些 酵 素 真 的 會 有 像 圖 中 一 樣 的
動 作 。
P5-9

Carboxypeptidase A
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.220
以 蛋 白 脢 carboxypeptidase A 的 X-ray 繞 射 圖 為 例 , 來 檢 視 蛋 白 質 的 動 作 情 形 。 分 子 中 央 有
一 個 鋅 , 其 右 側 隱 約 可 以 看 到 一 個 凹 陷 的 洞 口 , 周 圍 還 有 三 個 胺 基 酸 的 基 團 , 一 起 等 個 獵 物
上 門 。
P5-10

加 入 基 質 後 活 性 區 關 閉 開 始 催 化 反 應
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.220
當 基 質 進 入 活 性 區 的 凹 陷 口 袋 後 , 整 個 分 子 把 基 質 吞 入 , 洞 口 的 幾 個 胺 基 酸 基 團 收 緊 , 然 後
在 分 子 內 部 進 行 水 解 反 應 。 其 中 以 右 側 的 Tyr 基 團 動 作 最 大 , 其 移 動 的 距 離 幾 乎 達 到 20 埃 。
P5-11

以 核 磁 共 振 解 析 蛋 白 質 構 造
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.181
Hemoglobin
粗 細 線 條 代 表
蛋 白 質 骨 架
的 可 能 位 置
核 磁 共 振 同 時 可 以 想 像 蛋 白 質
分 子 的 振 動 情 形 ( 並 非 固 定 )
Bovine trypsin inhibitor
Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.208
核 磁 共 振 NMR 是 偵 測 某 個 原 子 與 周 圍 其 它 原 子 間 的 共 振 情 形 , 則 可 計 算 得 兩 原 子 間 的 相 對
位 置 ; 若 一 個 蛋 白 質 分 子 上 的 每 個 原 子 都 能 如 此 一 一 偵 測 , 整 體 計 算 起 來 , 便 可 推 得 整 個 蛋
白 質 構 造 的 形 狀 。
因 核 磁 共 振 是 在 水 溶 液 中 進 行 , 蛋 白 質 並 非 固 定 在 結 晶 中 , 因 此 所 『 看 到 』 的 蛋 白 質 構 造 , 就 不 像 以 X-ray 繞 射
法 所 得 『 照 片 』 般 的 固 定 影 像 。 所 有 可 能 出 現 的 位 置 , 都 會 被 計 算 出 來 , 因 此 所 得 到 的 『 影 像 』 有 點 像 漫 畫 中 的
『 發 抖 』 圖 形 , 看 起 來 蛋 白 質 分 子 好 像 在 抖 動 , 可 能 也 真 是 如 此 。
看 左 邊 的 Hb 分 子 , 周 邊 的 蛋 白 質 片 段 抖 動 得 較 厲 害 , 另 有 些 地 方 則 較 不 易 抖 動 , 正 是 夾 著
heme 的 部 份 。
P5-12

分
子
間
的
專
一
性
結
合
力
量
抑 制 劑
胰 蛋 白 脢
Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.199
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.252
蛋 白 質 與 另 一 不 相 干 的 蛋 白 質 之 間 , 有 時 會 產 生 相 當 專 一 性 的 吸 引 力 , 而 兩 者 可 能 來 自 不 同
細 胞 、 不 同 生 物 , 完 全 沒 有 關 係 。 像 胰 臟 中 的 胰 蛋 白 脢 trypsin, 是 動 物 專 門 用 來 消 化 食 物 蛋
白 質 的 酵 素 , 在 自 然 界 中 居 然 產 生 有 許 多 種 抑 制 劑 , 這 些 抑 制 劑 都 與 trypsin 有 專 一 性 的 親 和
力 , 與 trypsin 結 合 後 抑 制 了 其 活 性 , 好 像 是 自 然 界 的 生 化 武 器 。
抑 制 劑 的 分 子 構 造 中 , 通 常 都 會 有 一 部 份 長 得 很 像 trypsin 的 基 質 , 讓 trypsin 誤 以 為 是 獵 物 而
捕 捉 , 雖 然 trypsin 的 確 將 抑 制 劑 水 解 了 ( 只 切 一 刀 ), 但 在 水 解 後 卻 發 現 ,trypsin 無 法 掙 脫 抑
制 劑 的 結 合 , 因 此 不 能 再 進 行 下 一 個 催 化 動 作 , 活 性 因 此 被 卡 住 。
抑 制 劑 為 何 與 trypsin 有 如 此 巨 大 的 親 和 力 ? 因 為 抑 制 劑 與 trypsin 的 活 性 區 之 間 , 兩 個 分 子 接
面 的 形 狀 互 補 , 並 產 生 相 當 強 大 的 吸 引 力 。
P5-13

具 有 親 和 力 的 兩 種 蛋 白 質
卵 白
胰 臟
CHOM
雞 蛋 粘 多 醣 蛋 白
Trypsin
胰 蛋 白 脢
當 代 國 語 大 辭 典 (1984) p.199
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.250
另 一 抑 制 劑 實 例 , 就 是 卵 白 中 的 trypsin 抑 制 劑 CHOM, 是 卵 白 中 的 重 要 成 份 之 一 , 卻 與 胰
臟 中 的 trypsin 有 極 強 的 親 和 力 。 我 們 可 以 拿 容 易 純 化 的 CHOM 為 釣 餌 , 結 合 到 親 和 吸 著 劑 上
面 , 用 來 釣 取 胰 臟 中 的 trypsin, 就 是 一 種 親 和 層 析 法 。
■ 請 參 考 生 物 化 學 實 驗 http://juang.bst.ntu.edu.tw/BCX/Protein.htm#P2。
P5-14

專 一 性 結 合 力 量 的 構 成 因 素
I. Conformational Match:
Van der Waals interaction
兩 分 子 間 因 構 形 互 補 所 造 成 的
吸 引 力 是 由 凡 得 瓦 爾 力 所 貢 獻
II. Interaction Forces:
(1) Hydrogen bond
(2) Hydrophobic interaction
(3) Electrostatic interaction
(4) Van der Waals interaction
+
Kd
=O…H-N-
+ -
Juang RH (2007) BCbasics
兩 個 分 子 之 間 的 親 和 力 是 如 何 產 生 的 ?
首 先 , 此 二 分 子 的 接 合 面 , 在 分 子 構 形 上 , 一 定 要 成 為 互 補 。 其 次 , 兩 個 互 補 的 接 面 結 合
後 , 可 以 再 利 用 其 間 所 生 成 的 一 些 二 級 鍵 , 加 強 兩 者 的 吸 引 力 。
尤 其 , 接 面 構 形 互 補 的 條 件 甚 是 重 要 , 若 能 有 互 補 形 狀 , 而 兩 者 間 並 無 其 它 顯 著 的 二 級 鍵 吸
引 力 , 一 樣 也 可 以 有 相 當 強 的 親 和 力 , 原 因 請 見 後 述 。
P5-15

抗 體 與 其 抗 原 間 的 專 一 性 吸 引 力
都 還 是 由 二 級 鍵 所 貢 獻
Roitt et al (2001) Immunology (6e) p.71
自 然 界 中 的 親 和 配 對 很 多 , 最 常 見 的 就 是 抗 體 與 抗 原 ; 而 抗 體 的 製 備 方 法 , 是 目 前 極 少 數 的
生 化 操 作 , 可 以 對 特 別 指 定 的 物 質 , 得 到 其 專 一 性 的 結 合 分 子 。 例 如 , 我 們 可 以 用 SARS 病
毒 外 殼 蛋 白 質 為 抗 原 , 對 小 白 鼠 進 行 免 疫 , 則 小 白 數 的 血 清 中 , 將 可 能 產 生 有 抗 SARS 病 毒
的 抗 體 , 純 化 分 離 此 種 抗 體 , 將 極 為 有 用 。
問 題 : 除 了 抗 體 與 抗 原 的 例 子 , 能 否 再 舉 出 若 干 個 具 有 專 一 性 的 分 子 配 對 ?
P5-16

兩
原
子
間
形
成
短
暫
凡
得
瓦
爾
力
排
斥
力
吸
引
力
最 大 凡 得 瓦 爾 力
兩 原 子 核 之 間 的 距 離
Darnell et al (1999) Molecular Cell Biology (2e) p.25
凡 得 瓦 爾 力 是 分 子 間 微 弱 且 短 暫 的 吸 引 力 , 多 發 生 在 非 極 性 的 分 子 間 ; 雖 然 極 性 分 子 之 間
也 可 能 有 凡 得 瓦 爾 吸 引 力 , 但 其 重 要 性 不 若 其 它 二 級 鍵 。
繞 在 原 子 最 外 圍 的 電 子 依 固 定 軌 道 運 轉 , 而 此 電 子 在 軌 道 球 體 上 的 分 佈 通 常 是 均 勻 的 。 當 兩
個 原 子 漸 漸 接 近 時 , 這 兩 個 原 子 上 的 電 子 會 相 互 影 響 其 分 佈 情 形 ; 若 其 中 一 個 原 子 的 電 子 分
佈 非 常 短 暫 地 發 生 不 均 勻 現 象 , 則 會 導 致 短 暫 的 偶 極 性 產 生 (δ + .δ - ), 而 這 短 暫 的 偶 極 性 會 馬
上 誘 導 另 一 個 原 子 上 的 電 子 , 也 產 生 電 子 分 佈 不 均 的 現 象 , 但 接 觸 面 的 偶 極 剛 好 相 反 (δ + .δ -
) a ...(δ + .δ - ) b 。 這 兩 個 相 反 的 偶 極 , 便 可 以 產 生 極 微 弱 且 短 暫 的 吸 引 力 , 即 稱 為 凡 得 瓦 爾 力 。
凡 得 瓦 爾 力 的 存 在 太 短 暫 , 因 此 很 容 易 就 散 掉 ; 為 了 達 致 最 大 的 凡 得 瓦 爾 力 , 兩 個 原 子 核 之
間 , 要 保 持 在 一 最 適 距 離 ; 太 近 則 因 電 子 相 斥 而 減 弱 , 太 遠 則 電 子 間 的 吸 引 力 又 不 夠 。 這 個
最 適 距 離 , 即 為 該 原 子 的 凡 得 瓦 爾 半 徑 。
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構
形
互
補
所
造
成
的
吸
引
力
凡
得
瓦
爾
鍵
數
目
夠
多
即
足
以
造
就
親
和
力
Van der Waal interactions
A
vdw
vdw
B
between non-polar surfaces
Juang RH (2007) BCbasics
因 為 凡 得 瓦 爾 力 實 在 很 弱 , 因 此 要 集 合 數 十 個 凡 得 瓦 爾 力 才 能 發 揮 作 用 。 兩 個 巨 分 子 間 的 接
面 , 若 其 間 相 互 對 應 的 每 一 對 原 子 , 都 能 保 持 其 凡 得 瓦 爾 半 徑 , 則 此 二 巨 分 子 便 可 產 生 相 當
強 的 親 和 力 量 ; 這 只 有 當 兩 個 巨 分 子 間 的 接 觸 面 , 剛 好 成 為 積 木 般 的 互 補 形 狀 時 , 才 能 達
成 。 這 種 巨 分 子 間 的 親 和 力 , 造 就 了 很 多 細 胞 的 生 理 特 性 與 功 能 。
你 相 信 嗎 ? 壁 虎 可 以 飛 簷 走 壁 就 是 靠 凡 得 瓦 爾 力 。 它 的 腳 掌 上 有 很 多 凸 出 條 紋 , 上 面 佈 滿 奈
米 級 的 細 毛 , 與 牆 面 密 切 接 觸 , 產 生 很 多 的 凡 得 瓦 爾 吸 引 力 。
■ 請 參 考 新 聞 Nature (2007) 447: 1035。
P5-18

蛋
白
質
間
的
專
一
性
交
互
作
用
Scientific American (2002) cover page
基 因 體 開 拓 了 科 學 家 的 視 野 , 以 更 寬 廣 的 角 度 去 看 原 先 的 問 題 。 同 樣 的 , 也 影 響 我 們 對 蛋 白
質 的 看 法 ; 蛋 白 質 體 學 就 是 針 對 生 物 的 某 一 器 官 、 生 長 時 期 或 生 理 反 應 , 對 整 體 蛋 白 質 的 消
長 , 進 行 全 面 性 的 探 索 。 除 了 瞭 解 所 增 減 的 蛋 白 質 種 類 或 身 份 之 外 , 檢 查 整 個 蛋 白 質 體 內 ,
各 種 蛋 白 質 之 間 的 專 一 性 交 互 作 用 , 也 是 重 要 課 題 。
因 為 , 細 胞 內 各 種 蛋 白 質 並 非 單 獨 作 業 , 而 是 相 互 間 有 密 切 且 頻 繁 的 聯 繫 與 關 係 , 可 說 是 互
相 有 對 談 (cross talk), 以 便 合 力 把 一 件 生 理 任 務 執 行 好 。 然 而 , 此 種 對 談 並 非 隨 意 , 否 則 細 胞
內 的 生 理 機 能 可 能 大 亂 ; 分 子 與 分 子 間 的 對 談 有 其 專 一 性 對 象 , 因 此 分 子 間 的 專 一 性 交 互 作
用 , 便 是 執 行 細 胞 任 務 的 最 基 本 條 件 。
你 無 法 在 細 胞 裡 面 , 找 到 任 何 一 個 蛋 白 質 , 不 需 與 其 它 分 子 交 談 , 而 能 進 行 其 生 理 機 能 者 ;
而 這 種 交 談 , 必 須 是 專 一 性 的 。 也 就 是 說 , 細 胞 內 每 一 個 蛋 白 質 , 都 至 少 有 一 個 專 一 性 的 結
合 對 象 。 因 此 , 若 把 這 種 結 合 關 係 一 一 連 線 起 來 , 將 會 有 一 張 很 複 雜 的 關 係 圖 , 從 這 張 圖 中
可 推 知 細 胞 的 種 種 生 理 途 徑 。
■ 請 參 考 Ezzell C (2002 六 月 ) 蛋 白 質 當 家 。 科 學 人 4: 46~54。
P5-19

P5-20