IMAGEN™ Adenovirus - Oxoid
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TECHNICAL ADVICE AND CUSTOMER SERVICE<br />
CONSEIL TECHNIQUE ET SERVICE CLIENTELE<br />
TECHNISCHE BERATUNG UND KUNDENDIENST<br />
For all enquiries please contact your local DakoCytomation<br />
subsidiary or distributor.<br />
Pour toute information, veuillez contacter votre filiale ou votre<br />
distributeur local(e) DakoCytomation.<br />
Anfragen jeder Art richten Sie bitte an die für Sie zuständige<br />
DakoCytomation-Niederlassung oder an Ihren Händler.<br />
Manufactured by/Fabriqué par/Hersteller:<br />
DakoCytomation Ltd<br />
Denmark House<br />
Angel Drove<br />
Ely<br />
Cambridgeshire, CB7 4ET<br />
United Kingdom/Royaume Uni/Großbritannien<br />
Telephone: +44 1353 669911<br />
Fax: +44 1353 668989 IMAGEN<br />
(105585-001)<br />
<strong>Adenovirus</strong><br />
July 2003 9607044EFG<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong><br />
50<br />
K6100<br />
A direct immunofluorescence test for the detection of<br />
<strong>Adenovirus</strong>.<br />
Test pour la détection de l’<strong>Adenovirus</strong> par<br />
Immunofluorescence directe.<br />
Direkter Immunfluoreszentest zum Nachweis von<br />
<strong>Adenovirus</strong>.
1 INTENDED USE<br />
The IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test is a qualitative direct immunofluorescence test for the detection of<br />
adenovirus antigen in clinical specimens and the confirmation of adenovirus in cell cultures.<br />
2 SUMMARY<br />
<strong>Adenovirus</strong>es are non-enveloped DNA viruses of icosahedral symmetry. The family Adenoviridae comprise<br />
2 genera, mammalian adenoviruses (Mastadenoviruses) and avian adenoviruses (Aviadenoviruses). 1 At<br />
least 47 known serotypes of human adenovirus have been identified and characterised by<br />
haemagglutination, neutralisation, DNA-hybridization and restriction endonuclease analysis of adenoviral<br />
DNA. 1,2,3,4<br />
Human adenoviruses are associated with a wide range of clinical disease in both immunocompetent and<br />
immunocompromised individuals which include infections of the respiratory tract, conjunctiva and gastrointestinal<br />
tract. 3,5 Infections are common in children and can occur sporadically or in outbreaks.<br />
Approximately 5% of acute respiratory disease in children and 10% of febrile illnesses and childhood<br />
pneumonias have been associated with adenovirus infection. 3,6,7<br />
<strong>Adenovirus</strong> infections of the eye may lead to pharyngo-conjunctival fever, follicular conjunctivitis or<br />
epidemic keratoconjunctivitis. 3,8<br />
<strong>Adenovirus</strong> serotypes 40 and 41 are commonly associated with viral gastroenteritis in infants and are<br />
reported to be responsible for 4-15% of nosocomial infections in paediatric wards. 3,9,10 In<br />
immunocompromised patients (eg transplant or AIDS patients) severe systemic infections can occur which<br />
can be life threatening. 3<br />
The laboratory diagnosis of adenovirus infection plays an important role in patient management and<br />
enables effective management and control of outbreaks. Diagnostic methods include direct detection of<br />
virus or viral proteins in clinical specimens (eg nasopharyngeal aspirates), isolation of viable virus in cell<br />
culture monolayers inoculated with respiratory, conjunctival or faecal specimens, and detection of<br />
adenovirus specific immunoglobulins. 3,5<br />
Isolation of adenoviruses from clinical specimens can be accomplished in continuous cell lines of mainly<br />
epithelial origin including HeLa, HEp-2, KB and 293 cell lines, in which adenoviruses may exhibit<br />
characteristic cytopathic effect. 3,5<br />
A range of techniques have been used to confirm the identification of adenovirus isolates including<br />
neutralisation tests, radioimmunoassay, DNA hybridisation, electron microscopy and DNA<br />
electrophoretyping. 11,12,13,14,15 These techniques can be complex, laborious and often inappropriate for<br />
routine use.<br />
Recently indirect immunofluorescence tests or enzyme-immunoassays (eg IDEIA <strong>Adenovirus</strong>) using<br />
genus specific monoclonal or polyclonal antibodies have been described for the direct detection of<br />
adenovirus in clinical specimens or cell culture monolayers. 15,16,17<br />
Direct immunofluorescence tests utilising specific monoclonal antibodies offer a rapid sensitive and specific<br />
method for the direct detection of adenoviruses in clinical specimens such as nasopharyngeal aspirates and<br />
conjunctival smears or for the confirmation of adenovirus isolates in cell culture monolayers.<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> is a direct immunofluorescence test for the detection and identification of human<br />
adenovirus serotypes in clinical specimens or cell cultures. The test utilises a genus specific monoclonal<br />
antibody to detect an epitope of adenovirus hexon proteins which is expressed in all known human<br />
adenovirus serotypes. 18<br />
1/37 K6100EFG
3 PRINCIPLE OF THE TEST<br />
The IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test contains monoclonal antibody conjugated to fluorescein isothiocyanate<br />
(FITC). The conjugated reagent binds specifically to an epitope common to the hexon protein found in all<br />
serotypes of human adenovirus. The reagent is used in a one-step direct immunofluorescence technique.<br />
Specimens are incubated with the FITC conjugated antibody reagent for 15 minutes, then excess reagent is<br />
washed off with phosphate buffered saline (PBS). The stained areas are mounted and viewed<br />
microscopically using epifluorescent illumination. If adenovirus is present, characteristic bright apple-green<br />
fluorescence is seen within the cytoplasm and/or nucleus of infected cells, contrasting with the red<br />
background staining of uninfected cells.<br />
Acknowledgements<br />
The monoclonal antibody used in this test was originated by the Division of Microbiological Reagents and<br />
Quality Control, Central Public Health Laboratory, Colindale, London, United Kingdom.<br />
4 DEFINITIONS<br />
The following symbols and definitions are in accordance with ISO 15223 and EN 980 and have been used in<br />
the product information.<br />
N<br />
Product code and catalogue number.<br />
Consult the instructions for use.<br />
Contains sufficient for tests.<br />
Manufactured by.<br />
In vitro diagnostic medical device.<br />
Use by.<br />
Batch Code.<br />
Storage temperature limitations.<br />
5 REAGENTS PROVIDED<br />
50 - Each kit contains sufficient materials for 50 direct specimens or cell culture preparations. - The<br />
shelf life of the kit is as indicated on the outer box label.<br />
5.1 IMAGEN ADENOVIRUS REAGENT<br />
One bottle of each of the following:<br />
One Instructions for Use Booklet.<br />
2 x 1 well positive control slide containing acetone-fixed human epithelial cells<br />
(HEp-2) infected with adenovirus.<br />
3mL of mounting fluid. The mounting fluid contains a photobleaching inhibitor in<br />
a glycerol solution (pH 10.0).<br />
1.4mL of IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> reagent. The reagent contains purified murine<br />
monoclonal antibody, specific to a common epitope on the adenovirus hexon<br />
protein, conjugated to FITC. The conjugate is prepared in a protein stabilised<br />
buffer solution (pH 7.5) containing evans blue dye as counterstain and<br />
15mmol/L sodium azide as preservative.<br />
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5.2 PREPARATION, STORAGE AND RE-USE OF KIT COMPONENTS<br />
In order to ensure optimal kit performance it is important that unused kit components are stored according to<br />
the following instructions:<br />
5.3 POSITIVE CONTROL SLIDES -<br />
Positive control slides are provided individually in sealed foil pouches filled with nitrogen. Store unused<br />
slides at 2-8 °C. The slide should be left for 5 minutes at room temperature (15-30 °C) before opening.<br />
Stain the slide immediately after opening.<br />
5.4 MOUNTING FLUID -<br />
Ready to use. Store mounting fluid at 2-8 °C. The mounting fluid should be left at room temperature (15-30<br />
°C) for 5 minutes before use.<br />
5.5 REAGENT -<br />
Ready to use. Store unused reagent 2-8 °C. The reagent should be stored in the dark at 2-8 °C and left at<br />
room temperature (15-30 °C) for 5 minutes before use.<br />
6 ADDITIONAL REAGENTS<br />
6.1 REAGENTS<br />
Fresh acetone (for fixation).<br />
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.5 for washing stained specimens and for specimen preparation.<br />
6.2 ACCESSORIES<br />
The following products are intended for use in conjunction with IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>. Contact your local<br />
DakoCytomation subsidiary or distributor for further information.<br />
Teflon coated glass microscope slides with single 6mm diameter well (100 slides per box) available from<br />
your local DakoCytomation subsidiary or distributor, (Code No. S6114).<br />
Positive Control Slide (Code No. S6125).<br />
7 EQUIPMENT<br />
The following equipment is required:<br />
Precision pipette and disposable tips to deliver 25µL.<br />
Wash bath.<br />
Coverslips suitable to cover 6mm diameter well.<br />
Non-fluorescing immersion oil.<br />
3/37 K6100EFG
Epifluorescence microscope with filter system for FITC (maximum excitation wavelength 490nm, mean<br />
emission wavelength 520nm) and x200-x500 magnification.<br />
Incubator at 37 °C.<br />
Low speed centrifuge.<br />
For Direct Specimens<br />
Sterile swabs.<br />
Mucus extractor (nasopharyngeal specimens only).<br />
For Culture Confirmation<br />
Sterile swabs, viral transport medium (VTM) and container suitable for collection, transportation and culture<br />
of <strong>Adenovirus</strong>es.<br />
Cell lines recommended for culture and isolation of <strong>Adenovirus</strong>es.<br />
8 PRECAUTIONS<br />
- For in vitro diagnostic use. Anyone performing an assay with this product must be trained in its use<br />
and must be experienced in laboratory procedures.<br />
8.1 SAFETY PRECAUTIONS<br />
8.1.1 The IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> reagent contains 15mmol/L sodium azide, which is a poison. Sodium<br />
azide may react with copper and lead plumbing systems to form explosive metal azides. Always dispose of<br />
materials containing azide by flushing with large quantities of water.<br />
8.1.2 <strong>Adenovirus</strong> on the positive control slide has been shown to be non-infectious in cell culture, however,<br />
the slide should be handled and disposed of as though potentially infectious.<br />
8.1.3 Evans blue dye is present in the reagent. This may be carcinogenic and contact with the skin should<br />
be avoided.<br />
8.1.4 Care should be taken when using the mounting fluid as it may cause skin irritation. Skin should be<br />
flushed with water if contact occurs.<br />
8.1.5 Do not eat, drink, smoke, store or prepare foods, or apply cosmetics within the designated work area.<br />
8.1.6 Do not pipette materials by mouth.<br />
8.1.7 Wear disposable gloves while handling clinical specimens and infected cells, always wash hands after<br />
working with infectious materials.<br />
8.1.8 Dispose of all clinical specimens in accordance with local legislation.<br />
8.1.9 Safety data sheet available for professional user on request.<br />
8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS<br />
8.2.1 Components must not be used after the expiry date printed on the labels. Do not mix or interchange<br />
different batches/lots of reagents.<br />
4/37 K6100EFG
8.2.2 The reagents are provided at fixed working concentrations. Test performance will be adversely<br />
affected if the reagents are modified or stored under conditions other than those detailed in Section 5.<br />
8.2.3 Prepare fresh Phosphate Buffered Saline (PBS) as required on the day of use.<br />
8.2.4 Washing in PBS is necessary. Use of other wash solutions such as tap water or distilled water will<br />
compromise test results.<br />
8.2.5 Avoid microbial contamination of reagents.<br />
8.2.6 The reagents must not be frozen.<br />
9 COLLECTION AND PREPARATION OF SPEClMENS 19<br />
The collection and preparation of specimens is of fundamental importance in the diagnosis of adenovirus by<br />
direct immunofluorescence and cell culture methods. Specimens must be collected from the site of infection<br />
during the time of peak viral shedding so that they contain as much infected material as possible and<br />
prepared in such a way as to preserve either intact cells which are free from adherent mucus etc for direct<br />
microscopy of specimens or the viability of viruses in specimens to be cultured.<br />
9.1 CLINICAL SPECIMENS<br />
9.1.1 Ophthalmic Specimens<br />
Collection<br />
Apply local anaesthetic to the eye, then expose upper and lower conjunctiva. Using a cotton or Dacron<br />
tipped swab vigorously wipe both upper and lower conjunctival surfaces, rotating the swab during the<br />
sampling process to ensure that the entire conjunctival surface is sampled.<br />
Preparation of Slides<br />
Roll the specimen swab, using slight pressure, within the 6mm well area on the microscope slide. Ensure<br />
that the whole swab tip is used to prepare the slide. Allow the specimen to air dry thoroughly at room<br />
temperature (15-30 °C) and then fix in fresh acetone for 10 minutes. Allow the slide to air dry. If the<br />
specimen is not stained immediately store at 4 °C overnight.<br />
9.1.2 Nasopharyngeal aspirates/secretions<br />
Collection<br />
Collect specimens from the nasopharyngeal region into a mucus extractor through a size 8 feeding tube.<br />
The mucus extractor and tubing should be maintained at 2-8 °C and sent to the laboratory as soon as<br />
possible for processing.<br />
Cell Separation<br />
If necessary add 2mL phosphate buffered saline (PBS) to the sample prior to centrifugation to reduce the<br />
viscosity and dilute the mucus. Centrifuge the mucus extractor at room temperature (15-30 °C) for 10<br />
minutes at 380g. Remove the supernatant which can be used for cell culture. Resuspend the cell deposit in<br />
2mL PBS and gently pipette the cells up and down with a wide bore pipette, or vortex gently, until the<br />
mucus is broken up and cellular material released. Avoid vigorous pipetting/vortexing to prevent damage to<br />
the cells. When a smooth suspension has been obtained add further PBS as required, pipetting or vortexing<br />
after addition of the extra PBS to wash the cells further. Remove and discard any visible flecks of mucus<br />
remaining at this point. Excess mucus must be removed as it will prevent adequate penetration of the<br />
reagent and may result in non-specific fluorescence.<br />
5/37 K6100EFG
If all secretions remain in the feeding tube and none reach the mucus extractor, wash all secretions out of<br />
the tube into PBS. This is best achieved by inserting a pasteur pipette into the end of the tube which was<br />
attached to the mucus extractor. Suck up the appropriate fluid into the tube and expel it repeatedly until the<br />
secretions adhering to the wall of the tube have been dislodged. Pipette the suspension up and down until<br />
the mucus has been adequately broken up.<br />
Preparation of Slides<br />
After completing the cell separation process, centrifuge the resultant cell suspension at room temperature<br />
(15-30 °C) for 10 minutes at 380g and discard the supernatant. Resuspend the cell deposit in sufficient PBS<br />
to dilute any remaining mucus, while at the same time maintaining a high cell density. Place 25µL of the<br />
resuspended cell deposit into the well area on the slide. Allow the specimen to air dry thoroughly at room<br />
temperature (15-30 °C) and fix in fresh acetone at room temperature (15-30 °C) for 10 minutes. If the<br />
specimen is not stained immediately store at 4 °C overnight or freeze at –20 °C for longer storage periods.<br />
9.2 CELL CULTURE<br />
Inoculation of Cell Cultures<br />
Specimens collected for the diagnosis of adenovirus infections should be inoculated into the cell lines<br />
routinely used in the laboratory according to established laboratory methods. Cell cultures should be<br />
examined regularly for the appearance of cytopathic effect (CPE) and haemadsorption tests carried out at<br />
regular intervals. Any haemadsorption positive cultures or cell cultures showing CPE, can be harvested<br />
and tested for the presence of <strong>Adenovirus</strong>.<br />
Preparation of Slides<br />
If a haemadsorption or CPE consistent with adenovirus infection is observed then the cell culture monolayer<br />
should be harvested when at least 50% of the cells are affected.<br />
Scrape the cell sheet into the liquid culture medium using a sterile pipette. Deposit the cells by Centrifuge at<br />
200g for 10 minutes at room temperature (15-30 °C) and remove the supernatant.<br />
Wash the cells by resuspending the cell deposit in PBS (see Section 8.2) and repeat the centrifugation.<br />
Remove the supernatant and resuspend the cell deposit in a small volume of fresh PBS to maintain a high<br />
cell density.<br />
Place 25µL aliquots of the cell suspension on to individuals wells on the slides. Allow to air dry thoroughly<br />
and fix in fresh acetone at room temperature (15-30 °C) for 10 minutes. If the specimen is not stained<br />
immediately store at 4 °C overnight or freeze at –20 °C for longer storage periods.<br />
10 TEST PROCEDURE<br />
PLEASE REFER TO SECTION 8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS BEFORE PERFORMING TEST<br />
PROCEDURE.<br />
10.1 ADDITION OF REAGENT<br />
Add 25µL of Reagent to each 6mm well. Ensure that the reagent covers the entire well area.<br />
10.2 FIRST INCUBATION<br />
Incubate the slides with reagent in a moist chamber for 15 minutes at 37 °C. Do not allow the reagent to<br />
dry on the specimen, as this will cause the appearance of non-specific staining.<br />
6/37 K6100EFG
10.3 WASHING THE SLIDE<br />
Wash off excess reagent with Phosphate Buffered Saline (PBS) then gently wash the slide in an agitating<br />
bath containing PBS for 5 minutes. Drain off PBS and allow the slide to air dry at room temperature (15-30<br />
°C).<br />
10.4 ADDITION OF MOUNTING FLUID<br />
Add one drop of IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> mounting fluid to the centre of each well and place a coverslip over<br />
the mounting fluid and specimen ensuring that no air bubbles are trapped.<br />
10.5 READING THE SLIDE<br />
Examine the entire well area containing the stained specimen using an epifluorescence microscope.<br />
Fluorescence, as described in Section 11, should be visible at x200-x500 magnification. (For best results<br />
slides should be examined immediately after staining, but may be stored at 2-8 °C, in the dark, for up to 24<br />
hours).<br />
11 INTERPRETATION OF TEST RESULTS<br />
11.1 CONTROLS<br />
11.1.1 Positive Control Slide<br />
When stained and viewed as described in Section 10, the positive control slide should show cells with<br />
intracellular nuclear and/or cytoplasmic apple-green fluorescence contrasting against a background of red<br />
counterstained material. These cells are slightly larger than respiratory or conjunctival epithelial cells but<br />
show similar intracellular, nuclear and/or cytoplasmic fluorescence when infected with adenovirus. Positive<br />
control slides should be used to check that the staining procedure has been satisfactorily performed.<br />
11.1.2 Negative Control<br />
If a negative control is required, uninfected intact cells of the type used for the culture and isolation of<br />
adenovirus are recommended. The cells should be prepared and fixed as described in Section 9.2 and<br />
stained as described in Section 10.<br />
11.2 CLINICAL SPECIMENS<br />
11.2.1 Appearance of <strong>Adenovirus</strong> Infected Cells<br />
Intracellular, nuclear and/or cytoplasmic granular apple-green fluorescence is seen in respiratory or<br />
conjunctival epithelial cells infected with adenovirus.<br />
Uninfected cells stain red with the evans blue counterstain.<br />
11.2.2 Interpretation of Results<br />
A positive diagnosis is made when one or more cells in the fixed, stained specimen show the typical<br />
fluorescence pattern described in Section 11.2.1.<br />
A negative diagnosis is made when fixed, stained specimens do not exhibit fluorescence with the reagent.<br />
For directly stained nasopharyngeal aspirate or ophthalmic specimens, at least 20 uninfected respiratory or<br />
conjunctival epithelial cells must be observed before a negative result is reported. See Section 11.2.3 if<br />
insufficient cells are present.<br />
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11.2.3 Insufficient Cells<br />
If insufficient cells are present on the slide, the remainder of the clinical specimen should be centrifuged at<br />
380g for 10 minutes at room temperature (15-30 °C). Resuspend the cells in a smaller volume of PBS<br />
before re-distribution (25µL) on the well area. Alternatively, a repeat clinical specimen should be requested.<br />
11.3 CELL CULTURE CONFIRMATION<br />
11.3.1 Appearance of <strong>Adenovirus</strong> Infected Cells<br />
Infected cells will demonstrate intracellular, nuclear and/or cytoplasmic apple-green fluorescence and<br />
should be recorded as positive for <strong>Adenovirus</strong>.<br />
Uninfected cells will be counterstained red, with the evans blue counterstain.<br />
11.3.2 Interpretation of Results<br />
A positive diagnosis is made when at least one fixed, stained cell shows the fluorescence pattern described<br />
in Section 11.3.1 after staining.<br />
At least 50 uninfected cells of the cell culture being tested must be observed in the slide well before a<br />
negative result is reported. See Section 11.3.3. if insufficient cells are present.<br />
11.3.3 Insufficient Cells<br />
If insufficient cells are present in the slide preparation, the remainder of the cell culture specimen should be<br />
centrifuged at 200g for 10 minutes at room temperature (15-30 °C). Resuspended in a smaller volume of<br />
PBS before re-distribution (25µL) on the well area.<br />
Alternatively, a repeat specimen should be re-inoculated on to fresh cell monolayers and the cell culture<br />
repeated.<br />
12 PERFORMANCE LIMITATIONS<br />
12.1 Use only the mounting fluid provided with the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test.<br />
12.2 The visual appearance of the fluorescence image obtained may vary due to the type of microscope<br />
and light source used.<br />
12.3 It is recommended that 25µL of reagent is used to cover a 6mm diameter well area. A reduction in this<br />
volume may lead to difficulties in covering the specimen area and may reduce sensitivity.<br />
12.4 All reagents are provided at fixed working concentrations. Test performance may be affected if the<br />
reagents are modified in any way or not stored under recommended conditions as outlined in Section 5.<br />
12.5 Failure to detect adenovirus may be a result of factors such as inappropriate collection, improper<br />
sampling and/or handling of specimen, failure of cell culture etc. A negative result does not exclude the<br />
possibility of adenovirus infection.<br />
12.6 The presence of adenovirus in nasopharyngeal secretions does not necessarily exclude the possibility<br />
of concomitant infection with other pathogens. All positive results must be interpreted with caution since<br />
adenovirus is capable of latency and recrudescence. Asymptomatic shedding may occur up to 18 months<br />
after infection. 20 Test results should be interpreted in conjunction with information available from<br />
epidemiological studies, clinical diagnosis of the patient and other diagnostic procedures.<br />
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12.7 Test results should be interpreted in conjunction with information available from epidemiological studies,<br />
clinical assessment of the patient and other diagnostic procedures.<br />
13 EXPECTED VALUES<br />
Members of different adenovirus subgenera show distinctly different organ tropisms. However, illnesses are<br />
primarily manifested as respiratory, ocular and enteric infections. The positive isolation rate will vary,<br />
depending on the test employed, the adequacy of the specimen collection, age of the population being<br />
tested and whether the populations studied are subject to overcrowding.<br />
Isolation frequency is influenced by the severity of virus-associated diseases and also by the tendency of<br />
virus strains to cause persistent infections with shedding of infectious virus over extended periods.<br />
<strong>Adenovirus</strong>es are responsible for 5% of the acute respiratory infections in children under 4 years of age and<br />
they account for 10% of the hospitalised respiratory infections in this age group. 3,6,7 Acute haemorrhagic<br />
cystitis in children may be caused by adenoviruses. Enteric adenoviruses have been implicated in 4% to<br />
15% of all hospitalised children with viral gastroenteritis and are most prevalent in children under 3 years of<br />
age. 3,11,12<br />
Ocular infections with adenoviruses (epidemic keratoconjunctivitis and swimming pool conjunctivitis) may<br />
occur in any age group as may adenovirus infection in immunosuppressed patients. 3,8<br />
In adults, adenoviruses have been isolated from the cervix and penile lesions and from acute respiratory<br />
infection, especially in military personnel.<br />
14 SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS<br />
14.1 SPECIFICITY OF THE MONOCLONAL ANTIBODY WITH ADENOVIRUS SEROTYPES<br />
The monoclonal antibody utilised in this test has been shown to react with a genus specific epitope of<br />
adenovirus hexon protein which is present in all human serotypes.<br />
14.2 CLINICAL STUDIES<br />
The IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test was evaluated for direct use at two clinical trial centres on nasopharyngeal<br />
secretions collected from children and adults hospitalised with symptoms of respiratory infection. The test<br />
was also evaluated at a leading ophthalmic centre on conjunctival specimens from patients presenting with<br />
conjunctivitis. Three trial centres evaluated the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test for the detection of adenovirus in<br />
cell culture.<br />
The trial centres tested 474 clinical respiratory specimens and 179 conjunctival specimens directly, plus 296<br />
specimens for culture confirmation. The standard tests for direct specimens were cell culture with or<br />
without indirect immunofluorescence and for culture confirmation the standard tests were indirect polyclonal<br />
antibody fluorescence or specific neutralisation.<br />
All calculations assume that the standard tests were 100% sensitive and specific. Sensitivity, specificity and<br />
predictive values were calculated as previously described. 21<br />
9/37 K6100EFG
14.3 CLINICAL PERFORMANCE<br />
14.3.1 Direct Specimens<br />
Nasopharyngeal Secretions<br />
Fresh clinical specimens were tested during the winter of 1988/89 and stored (frozen) specimens which had<br />
been collected between 1978 and 1988 were also tested. The two centres compared IMAGEN<br />
<strong>Adenovirus</strong> test with reference methods. A result by the reference method was considered positive if either<br />
the cell culture or indirect immunofluorescence was positive. This allowed for the presence of non-viable<br />
virus to be detected by fluorescence or cell-free virus to be detected by cell culture. A specimen was scored<br />
positive in the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test when one or more fluorescing epithelial cells were seen (see<br />
Section 11.2).<br />
Table 14.1 shows the results of the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test reagent. The overall incidence of<br />
adenovirus in these populations was 9.1% (43/474). The results correlated with the standard tests in 468<br />
cases (98.7%). The IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test sensitivity was 86.0% (37/43) and specificity was 100%<br />
(431/431). The predictive values for positive and negative results were 100% (37/37) and 98.6% (431/437)<br />
respectively.<br />
Table 14.1 Comparison of test results by the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test and cell culture on<br />
nasopharyngeal specimens at 2 trial centres<br />
TEST RESULT<br />
Reference method<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong><br />
Neg<br />
Neg<br />
No. of Specimens (474) 431 37 6* 0<br />
*1) 4/6 specimens took greater than 10 days to produce CPE in culture. This may indicate a very low<br />
level of virus initially present in the sample.<br />
2) 2/6 specimens were negative by indirect IF.<br />
Ophthalmic Specimens<br />
The IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test was evaluated against an established cell culture system. Conjunctival<br />
swabs were collected from 179 patients with conjunctivitis attending an eye hospital. The incidence of<br />
adenovirus infection in the population group studied was 19.6% (35/179). Smears were prepared from<br />
specimen swabs at the clinic and the swabs were then placed in a transport medium for cell culture<br />
evaluation. A specimen was scored positive in the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test when one or more<br />
fluorescing epithelial cells were observed (see Section 11.2). A specimen was scored positive in the cell<br />
culture test when characteristic cytopathic effect was confirmed by indirect immunofluorescence. The<br />
results from this trial are shown in Table 14.2. Of 179 specimens tested, the same result was obtained by<br />
both methods in 174 specimens after repeat testing, giving a correlation of 97.2%. The sensitivity and<br />
specificity of the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test was 91.4% (32/35) and 98.6% (142/144) respectively. The<br />
predictive values for positive and negative tests were 94.1% (32/34) and 97.9% (142/145) respectively.<br />
Table 14.2 Comparison of test results by the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test and cell culture on<br />
human ophthalmic specimens<br />
TEST RESULT<br />
Reference method<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong><br />
Neg<br />
Neg<br />
No. of Specimens (179) 142 32 3* 2**<br />
* Insufficient material available for retesting of one specimen.<br />
** Both specimens were cultured for only 2 days.<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Neg<br />
Pos<br />
Neg<br />
Neg<br />
Pos<br />
Neg<br />
Pos<br />
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14.3.2 Cell Culture Confirmation<br />
Three trial centres tested the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test on cell cultures from clinical specimens. This was<br />
compared against indirect immunofluorescence and/or neutralisation tests for culture confirmation.<br />
Isolations were made in routine cell lines used for adenovirus culture. Cell cultures were washed in PBS<br />
before being removed and spotted on to slides. The slides were fixed in acetone and then tested using the<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test reagents. Both fresh clinical isolates and previously frozen specimens were<br />
used for this evaluation. A total of 296 cultures were evaluated. Cell culture positive isolates were confirmed<br />
by either immunofluorescence or neutralisation tests.<br />
The results (Table 14.3) indicate that the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test detected all positive adenovirus<br />
isolates giving a sensitivity of 100% (162/162). The specificity of the reagent was 100% (134/134).<br />
Table 14.3 Comparison of test results by the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test and standard methods<br />
for culture confirmation at 3 trial centres<br />
TEST RESULT<br />
Standard confirmation<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong><br />
Neg<br />
Neg<br />
No. of Specimens (296) 134 162 0 0<br />
14.4 CROSS-REACTIVITY<br />
The IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test was performed against preparations of other viruses and organisms likely<br />
to be present in respiratory or ophthalmic specimens or cell cultures. All organisms tested (Table 14.4) were<br />
negative with the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test.<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Neg<br />
Table 14.4 Organisms tested in the IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> test and found to be non-reactive<br />
Acholeplasma laidlawii<br />
Branhamella catarrhalis<br />
Candida albicans<br />
Chlamydia psittaci<br />
Chlamydia trachomatis<br />
Coxsackie virus<br />
Cytomegalovirus<br />
Echovirus<br />
Epstein-Barr virus<br />
Haemophilus influenzae<br />
Herpes simplex virus<br />
Influenza virus A & B<br />
Legionella pneumophila<br />
Measles virus<br />
Mumps virus<br />
Mycobacterium avium<br />
Mycobacterium intracellulare<br />
Mycobacterium tuberculosis<br />
Mycoplasma arginini<br />
Mycoplasma hominis<br />
Mycoplasma hyorhinus<br />
Mycoplasma orale<br />
Mycoplasma pneumoniae<br />
Mycoplasma salivarium<br />
Neisseria cinerea<br />
Neisseria flavescens<br />
Neisseria gonorrhoea<br />
Neisseria lactamica<br />
Neisseria meningitidis A, B, C & D<br />
Neisseria mucosa<br />
Neisseria perflava<br />
Neisseria pharyngis<br />
Parainfluenza virus types 1,2,3 & 4b<br />
Pneumocystis carinii<br />
Polio virus types 1 & 2<br />
Respiratory syncytial virus<br />
Rhinovirus<br />
Staphylococcus aureus<br />
Streptococcus gps A,B,C,D,F,G<br />
Varicella zoster virus<br />
Neg<br />
Pos<br />
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1 INTERET<br />
Le test IMAGEN Adénovirus est un test qualitatif d'immunofluorescence directe pour la détection de<br />
l'antigène des adénovirus dans des échantillons cliniques et la confirmation de la présence d'un adénovirus<br />
dans les cultures cellulaires.<br />
2 RESUME<br />
Les adénovirus sont des virus à ADN dépourvus d'enveloppe et à symétrie cubique. La famille des<br />
Adénovirus se compose de 2 genres, à savoir les adénovirus mammifères (Mastadénovirus) et les<br />
adénovirus aviaires (Aviadénovirus). 1 On a identifié et caractérisé au moins 47 sérotypes connus<br />
d'adénovirus humains par hémagglutination, neutralisation, hybridation d'ADN et par l'utilisation d'enzymes<br />
de restriction. 1,2,3,4<br />
Les adénovirus humains sont responsables d'un certain nombre de maladies, tant chez les sujets<br />
immunocompétents qu'immunodéficients, parmi lesquelles on compte, entre autres, des infections des<br />
voies respiratoires, conjonctives et gastro-intestinales. 3,5 Ces infections sont fréquentes chez les enfants et<br />
se manifestent sporadiquement ou sous forme d'épidémies.<br />
Environ 5 % des maladies respiratoires graves qui affectent les enfants et 10 % des maladies fébriles et<br />
pneumonies infantiles sont liées à des infections 'adénovirales. 3,6,7<br />
Les infections oculaires adénovirales peuvent engendrer une fièvre pharyngo-conjonctivale, une<br />
conjonctivite folliculaire ou encore une kératoconjonctivite épidémique. 3,8<br />
Les sérotypes d'adénovirus 40 et 41 sont généralement responsables de gastro-entérites virales chez les<br />
nouveau-nés et sont également considérés comme responsables de 4 à 15 % des infections nosocomiales<br />
survenant dans les services pédiatriques 3,9,10 Chez les patients immunodéficients (par exemple, les<br />
patients sidéens ou ayant subi une transplantation), des infections systémiques graves peuvent se<br />
manifester et mettre la vie en danger. 3<br />
Le diagnostic d’une infection adénovirale joue un rôle important au niveau du traitement du patient et<br />
permet de combattre et de contrôler efficacement les épidémies. Parmi les méthodes de diagnostic, on<br />
compte la détection directe du virus ou des protéines virales dans des échantillons cliniques (par exemple,<br />
des aspirations nasopharyngiennes), l'isolement du virus viable dans des monocouches de culture cellulaire<br />
inoculées au moyen d'échantillons respiratoires, conjonctifs ou fécaux, ainsi que la détection des<br />
immunoglobulines spécifiques de l'adénovirus. 3,5<br />
L'isolement des adénovirus dans des échantillons cliniques peut se réaliser dans des lignées continues de<br />
cellules, d'origine principalement épithéliale, telles que les lignées de cellules HeLa, HEp-2, KB et 293,<br />
dans lesquelles les adénovirus peuvent développer un effet cytopathogène caractéristique. 3,5<br />
De nombreuses techniques sont utilisées pour confirmer l'identification des adénovirus isolés, et<br />
notamment des tests de neutralisation, dosages radio-immunologiques, hybridation d'ADN, microscopie<br />
électronique et détermination électrophorétique de l'ADN. 11, 12,13,14,15 Ces techniques peuvent être<br />
complexes, laborieuses et souvent impropres à une utilisation quotidienne.<br />
Les tests d'immunofluorescence directe ou tests immunoenzymatiques (ex : IDEIA Adénovirus) utilisant<br />
des anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques du genre ont été récemment décrits pour la<br />
détection directe d'adénovirus dans des échantillons cliniques ou monocouches de culture cellulaire. 15,16,17<br />
Les tests d'immunofluorescence directe utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques constituent une<br />
méthode sensible, spécifique et rapide pour détecter les adénovirus dans des échantillons cliniques, tels<br />
que les aspirations nasopharyngiennes et les frottis conjonctifs, ou pour confirmer la présence d'adénovirus<br />
isolés dans des monocouches de culture cellulaire.<br />
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Le test IMAGEN Adénovirus est un test d'immunofluorescence directe conçu pour détecter et identifier les<br />
sérotypes d'adénovirus humains dans des échantillons cliniques ou cultures cellulaires. Ce test utilise un<br />
anticorps monoclonal spécifique du genre pour détecter un épitope de protéines hexon d'adénovirus<br />
présent sur tous les sérotypes d'adénovirus humains connus. 18<br />
3 PRINCIPE DU TEST<br />
Le test IMAGEN Adénovirus contient un anticorps monoclonal conjugué à l'isothiocyanate de fluorescéine<br />
(FITC). Le réactif conjugué se lie de façon spécifique à un épitope commun à la protéine hexon présente<br />
sur tous les sérotypes d'adénovirus humains. Le réactif est utilisé dans le cadre d'une technique<br />
d'immunofluorescence directe en une étape. Les échantillons sont incubés avec l'anticorps conjugué au<br />
FITC pendant 15 minutes. L'excès de réactif est ensuite éliminé par lavage à l'aide d'une solution saline<br />
tamponnée (PBS). L'observation s'effectue après montage entre lame et lamelle au microscope, sous un<br />
éclairage épifluorescent. Si un 'adénovirus est présent, il est signalé par une fluorescence caractéristique<br />
vert pomme vif, qui apparaît à l'intérieur du cytoplasme et/ou du noyau des cellules contaminées, et qui<br />
contraste avec la coloration rouge des cellules non infectées.<br />
Déclaration<br />
L'anticorps monoclonal utilisé dans ce test a été produit par la Division of Microbiological Reagents and<br />
Quality Control, Central Public Health Laboratory, Colindale, London, Royaume-Uni.<br />
4 DEFINITIONS<br />
Les définitions et symboles suivants sont conformes aux normes ISO 15223 et EN 980 et sont utilisés dans la<br />
notice du produit.<br />
N<br />
Code du produit et référence du catalogue.<br />
Consulter les instructions d’utilisation.<br />
Contenu suffisant pour tests.<br />
Fabricant.<br />
Dispositif médical de diagnostic in vitro.<br />
Utiliser jusque.<br />
Code du lot<br />
Limite de température de stockage.<br />
5 REACTIFS FOURNIS<br />
50 - Chaque kit contient suffisamment de réactifs pour traiter 50 échantillons ou 50 préparations de<br />
culture cellulaire. - La date de péremption du kit est indiquée sur l'étiquette extérieure de la boîte.<br />
5.1 REACTIF IMAGEN ADENOVIRUS<br />
Un flacon de :<br />
Un fascicule d’ Instructions.<br />
2 lames de contrôle positif à 1 puits contenant des cellules épithéliales humaines<br />
(HEp-2), fixées à l'acétone, contaminées par l'adénovirus.<br />
3mL de liquide de montage. Le liquide de montage contient un agent inhibant<br />
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photodécolorant dans une solution de glycérol (pH10.0).<br />
1,4mL de réactif pour test IMAGEN Adénovirus. Le réactif est un anticorps<br />
murin monoclonal purifié, spécifique d'un épitope commun à la protéine hexon<br />
d'adénovirus, conjugué au FITC. Le conjugué est préparé dans une solution<br />
tampon protéinique stabilisée (pH7.5) contenant du colorant bleu d’Evans<br />
comme contre-colorant et 15 mmol/L d’azide de sodium comme conservateur.<br />
5.2 PREPARATION, STOCKAGE ET REUTILISATION DES COMPOSANTS DU KIT<br />
Pour assurer des performances optimales du kit, il est important de stocker les composants non utilisés<br />
conformément aux instructions suivantes :<br />
5.3 LAMES DE CONTROLE POSITIF -<br />
Les lames sont fournies séparément enveloppées dans des pochettes aluminium scellées et remplies<br />
d’azote. Les lames non utilisées doivent être stockées entre 2 et 8 °C. . La pochette contenant la lame à<br />
utiliser doit rester à température ambiante (15 à 30 °C) pendant 5 minutes avant de l’ouvrir.<br />
Colorez la lame immédiatement après ouverture.<br />
5.4 LIQUIDE DE MONTAGE -<br />
Prêt à l’usage. Conserver entre 2 et 8 °C . Le flacon de liquide de montage doit rester à température<br />
ambiante (15-30 °C) pendant 5 minutes avant de l’ouvrir.<br />
5.5 REACTIF -<br />
Prêt à l’usage. Conserver le réactif non utilisé entre 2 et 8 °C. Le réactif doit être conservé à l'abri de la<br />
lumière, entre 2 et 8 °C et le flacon doit rester à température ambiante (15-30 °C) au moins 5 minutes avant<br />
de l’ouvrir.<br />
6 REACTIFS NON FOURNIS<br />
6.1 REACTIFS<br />
Acétone frais (pour la fixation).<br />
Solution saline tamponnée (PBS), pH 7,5, pour le lavage des échantillons marqués et la préparation des<br />
échantillons.<br />
6.2 ACCESSOIRES<br />
Les produits suivants sont destinés à être utilisés conjointement au test IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>. Pour tous<br />
renseignements supplémentaires, veuillez vous adresser à votre filiale distributeur DakoCytomation.<br />
Lames pour microscope recouvertes de téflon avec un seul puits de 6mm de diamètre (100 lames par<br />
boîte), disponibles auprès de votre filiale ou de votre distributeur DakoCytomation, (Code S6114).<br />
Lame de contrôle positif (Code S6125).<br />
7 MATERIEL<br />
Le matériel suivant est nécessaire :<br />
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Pipette de précision et embouts jetables pour des quantités de 25µL.<br />
Bain de lavage.<br />
Lamelles adaptées à un puits de 6mm de diamètre.<br />
Huile d'immersion non fluorescente.<br />
Microscope épifluorescent avec système de filtre pour FITC (longueur d'onde d'excitation maximale 490<br />
nm, longueur d'onde d'émission moyenne 520 nm) et objectif x 200-x500.<br />
Incubateur à 37 °C.<br />
Centrifugeuse à vitesse réduite.<br />
Pour échantillons directs<br />
Ecouvillons stériles.<br />
Extracteur de mucosités (échantillons nasopharyngiens uniquement).<br />
Pour confirmation de culture<br />
Ecouvillons stériles et milieu de transport viral (VTM) et récipient adapté au prélèvement, au transport et à<br />
la culture des adénovirus.<br />
Lignées de cultures cellulaires recommandées pour la culture et l'isolement des adénovirus.<br />
8 PRECAUTIONS<br />
- Pour diagnostic in vitro. L’utilisateur doit maîtriser les procédures générales de laboratoire et être<br />
spécifiquement formé à I’emploi de ce test.<br />
8.1 MESURES DE SECURITE<br />
8.1.1 Le réactif IMAGEN Adénovirus contient 15mmol/L d'azide de sodium, un agent chimique<br />
extrêmement toxique susceptible de réagir avec les parties en cuivre ou en plomb des tuyauteries pour<br />
former des azides métalliques extrêmement explosifs. Au moment de jeter les solutions contenant de<br />
l'azide de sodium, rincer abondamment à l'eau.<br />
8.1.2 L'adénovirus sur la lame de contrôle positif s'est révélé non infectieux lors de la culture cellulaire.<br />
Toutefois, la lame doit être manipulée et mise au rebut comme si elle était potentiellement infectieuse.<br />
8.1.3 Le réactif contient du bleu d’Evans. Cette substance pouvant être cancérigène, éviter tout contact<br />
avec la peau.<br />
8.1.4 Le liquide de montage doit être utilisé avec précautions, car il peut provoquer des irritations<br />
cutanées. En cas de contact avec la peau, rincer abondamment à l'eau.<br />
8.1.5 Ne pas manger, boire, fumer, conserver ou préparer de la nourriture, ni se maquiller sur les lieux<br />
d'utilisation.<br />
8.1.6 Ne pas pipeter les substances à la bouche.<br />
8.1.7 Porter des gants jetables pour manipuler les échantillons cliniques et les cellules infectées et toujours<br />
se laver les mains après avoir travaillé avec des substances infectieuses.<br />
8.1.8 L'élimination de tous les échantillons cliniques doit avoir lieu conformément à la législation en<br />
vigueur.<br />
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8.1.9 Une fiche de sécurité destinée aux professionnels est disponible sur demande.<br />
8.2 PRECAUTIONS TECHNIQUES<br />
8.2.1 Ne pas utiliser les composants après la date de péremption indiquée sur les étiquettes. Ne pas<br />
mélanger ou échanger différents lots de réactifs.<br />
8.2.2 Les réactifs sont fournis prêts à l'emploi, à des concentrations prédéterminées. Les performances<br />
pourraient être affectées en cas modification ou de non respect des conditions de conservation décrites<br />
dans la Section 5.<br />
8.2.3 Préparer le volume de PBS nécessaire le jour le l’utilisation .<br />
8.2.4 Le lavage doit être obligatoirement effectué dans la PBS. L’utilisation de toute autre solution de<br />
lavage telle que de l’eau du robinet ou distillée compromet les résultats du test.<br />
8.2.5 Eviter la contamination microbienne des réactifs.<br />
8.2.6 Les réactifs ne doivent pas être congelés.<br />
9 PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS 19<br />
Le prélèvement et la préparation des échantillons sont prépondérants dans le cadre du diagnostic des<br />
adénovirus selon les méthodes d'immunofluorescence directe et de culture cellulaire. Les échantillons<br />
doivent être collectés sur le site de l'infection, en période d’excrétion virale maximale, de façon à contenir le<br />
plus de matériau infecté possible, et être préparés de manière à garder intactes soit les cellules qui sont<br />
débarrassées de mucosités adhérentes etc… pour observer les échantillons directement au microscope,<br />
out la viabilité des virus dans les échantillons destinés à une culture cellulaire.<br />
9.1 ECHANTILLONS CLINIQUES<br />
9.1.1 Echantillons ophtalmiques<br />
Prélèvement<br />
Effectuer une anesthésie locale de l'oeil, puis dégager les conjonctives supérieures et inférieures. A l'aide<br />
d'une sonde à embout recouvert de coton ou de Dacron, balayer vigoureusement les conjonctives<br />
supérieures et inférieures, en faisant pivoter la sonde au cours du prélèvement, afin de prélever sur toute la<br />
surface de la conjonctive.<br />
Préparation des lames<br />
Déposer l'échantillon prélevé, en appuyant légèrement, à l'intérieur du puits de 6mm de diamètre d'une<br />
lame pour microscope. Faire attention de bien utiliser le bout de la sonde tout entier pour préparer la lame.<br />
Laisser sécher l'échantillon complètement, à l'air libre, à température ambiante (15-30 °C), puis fixer dans<br />
de l'acétone frais pendant 10 minutes. Laissez sécher la lame à l’air libre. S'il l'échantillon n’est pas marqué<br />
immédiatement, le conserver à 4 °C pendant la nuit<br />
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9.1.2 Aspirations/secrétions nasopharyngiennes<br />
Prélèvement<br />
Prélever les secrétions dans la zone nasopharyngienne, dans un extracteur de mucosités, à l'aide d'un tube<br />
d'alimentation de dimension 8. L'extracteur de mucosités et le tube doivent être maintenus entre 2 et 8 °C<br />
et envoyés au laboratoire aussitôt que possible pour traitement.<br />
Séparation des cellules<br />
Le cas échéant, ajouter à l'échantillon 2mL de solution saline tamponnée (PBS) avant la centrifugation, de<br />
manière à réduire la viscosité et à diluer les mucosités. Centrifuger l'extracteur de mucus à température<br />
ambiante (15-30 °C) pendant 10 minutes à 380g. Eliminer le liquide surnageant, qui peut servir pour la<br />
culture cellulaire. Remettre le dépôt cellulaire en suspension dans 2mL de PBS et pipeter doucement les<br />
cellules de haut en bas, à l'aide d'une pipette de large diamètre, ou agiter légèrement à l'aide du vortex,<br />
jusqu'à ce que le mucus se dissolve et libère la substance cellulaire. Eviter de pipéter/agiter au vortex<br />
vigoureusement, afin de ne pas endommager les cellules. Dès qu'une suspension uniforme est obtenue,<br />
ajouter, si nécessaire, un peu de PBS, et pipeter ou agiter au vortex après addition éventuelle de PBS, afin<br />
de laver les cellules. Eliminer et jeter toutes les particules de mucus restantes à ce stade. L'excès de<br />
mucus doit être éliminé car il risque d'empêcher la pénétration adéquate du réactif, produisant ainsi une<br />
fluorescence non-spécifique.<br />
Si toutes les secrétions restent dans le tube d'alimentation et n'atteignent pas l'extracteur de mucosités,<br />
évacuer les secrétions du tube par lavage et les verser dans du PBS. Pour ce faire, insérer une pipette<br />
pasteur dans l'extrémité du tube attachée à l'extracteur de mucus. Aspirer le liquide adéquat dans le tube et<br />
l'expulser plusieurs fois jusqu'à ce que les secrétions adhérant aux parois du tube soient délogées. Pipéter<br />
la suspension qui en résulte de haut en bas jusqu'à dissolution adéquate du mucus.<br />
Préparation des lames<br />
Une fois le processus de séparation des cellules terminé, centrifuger la suspension cellulaire ainsi obtenue<br />
à température ambiante (15-30 °C) pendant 10 minutes à 380g et éliminer le liquide surnageant. Remettre<br />
le dépôt de cellules en suspension dans une quantité suffisante de PBS, afin de diluer le mucus restant,<br />
tout en maintenant une importante densité cellulaire. Mettre 25µL de dépôt cellulaire remis en suspension<br />
dans le puits, sur une lame. Laisser sécher complètement l'échantillon à l'air libre et à température<br />
ambiante (15-30 °C) et le fixer à l'acétone frais, à température ambiante également (15-30 °C), pendant 10<br />
minutes. S'il l'échantillon n’est pas marqué immédiatement, le conserver à 4 °C pendant la nuit ou le<br />
congeler à –20 °C pour des périodes plus longues.<br />
9.2 CULTURE CELLULAIRE<br />
Inoculation des cultures cellulaires<br />
Les échantillons prélevés en vue du diagnostic d'infections adénovirales doivent être inoculés dans les<br />
lignées cellulaires habituellement utilisées par le laboratoire en fonction des méthodes établies. Les<br />
cultures cellulaires doivent être examinées régulièrement pour vérifier l’aspect du CPE et des tests<br />
d’hémadsorption doivent être effectués à intervalles réguliers. Toute culture positive à l’hémadsorption ou<br />
culture cellulaire indiquant un CPE, peut être collectée et testée pour la présence de l’adénovirus.<br />
Préparation des lames<br />
Si une hémadsorption ou un CPE typique d’ une infection adénovirale apparaît, récolter la monocouche de<br />
culture cellulaire lorsqu'au moins 50 % des cellules sont affectées.<br />
Décoller la lignée de cellules et la placer dans le milieu de culture liquide à l'aide d'une pipette stérile.<br />
Former un culot de cellules par centrifugation à 200g, pendant 10 minutes, à température ambiante (15-30<br />
°C) et éliminer le surnageant.<br />
Laver les cellules en remettant le dépôt cellulaire en suspension dans la solution saline tamponnée (PBS -<br />
voir Section 8.2) et répéter la centrifugation. Eliminer le surnageant et remettre le dépôt cellulaire en<br />
suspension dans un petit volume de PBS frais afin de maintenir une densité cellulaire élevée.<br />
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Mettre des aliquotes de 25µL de suspension cellulaire dans les chaque puits des lames. Laisser sécher<br />
complètement à l'air libre et fixer dans de l'acétone frais, à température ambiante (15-30 °C), pendant 10<br />
minutes. S'il l'échantillon n’est pas marqué immédiatement, le conserver à 4 °C pendant la nuit, ou le<br />
congeler à –20 °C pour des périodes plus longues.<br />
10 MODE OPERATOIRE<br />
VEUILLEZ CONSULTER LA SECTION 8.2, PRÉCAUTIONS TECHNIQUES, AVANT DE RÉALISER LE<br />
TEST.<br />
10.1 ADDITION DE REACTIF<br />
Ajouter 25µL de réactif dans chaque puits de 6 mm. . Vérifier si le réactif couvre toute la surface du puits.<br />
10.2 PREMIERE INCUBATION<br />
Incuber les lames avec le réactif pendant 15 minutes à 37 °C, dans une chambre humide. Ne pas laisser<br />
sécher le réactif sur l'échantillon, car cela provoquerait l'apparition d'un marquage non-spécifique.<br />
10.3 LAVAGE DE LA LAME<br />
Eliminer l'excès de réactif par lavage avec la solution saline (PBS), et laver la lame avec précaution dans<br />
un bain à agitation contenant du PBS, pendant 5 minutes. Laisser égoutter le PBS et laisser sécher la lame<br />
à l'air libre et à température ambiante (15-30 °C).<br />
10.4 ADDITION DE LIQUIDE DE MONTAGE<br />
Ajouter une goutte de liquide de montage IMAGEN Adénovirus au centre de chaque puits et placer une<br />
lamelle, en évitant la formation de bulles d'air sous la lamelle.<br />
10.5 LECTURE DE LA LAME<br />
Examiner le puits contenant l'échantillon coloré dans son ensemble, en utilisant un microscope à<br />
épifluorescence. Comme indiqué à la Section 11, une amplification de x200-x500 permet de visualiser la<br />
fluorescence. (Pour obtenir des résultats optimaux, les échantillons doivent en principe être examinés<br />
immédiatement après le marquage, mais ils peuvent être conservés entre 2 et 8 °C, à l'abri de la lumière,<br />
jusqu'à 24 heures).<br />
11 INTERPRETATION DES RESULTATS<br />
11.1 CONTRÔLES<br />
11.1.1 Lames de contrôle positif<br />
Une fois colorée et examinée conformément aux instructions de la Section 10, la lame de contrôle positif<br />
doit présenter des cellules avec une fluorescence nucléaire et/ou cytoplasmique intracellulaire vert-pomme,<br />
contrastant avec la couleur rouge du contre-colorant. Ces cellules sont légèrement plus grandes que les<br />
cellules épithéliales respiratoires ou conjonctives, mais présentent une fluorescence intracellulaire,<br />
cytoplasmique et/ou nucléaire similaire lorsqu'elles sont contaminées par un adénovirus. Les lames de<br />
contrôle positif doivent servir à vérifier si la procédure de marquage a été réalisée correctement.<br />
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11.1.2 Contrôle négatif<br />
Si un contrôle négatif s'avère nécessaire, il est recommandé d'utiliser des cellules intactes non<br />
contaminées, du même type que celles utilisées pour la culture et l'isolement de l'adénovirus. Les cellules<br />
doivent être préparées et fixées conformément aux indications de la Section 9.2 et colorées comme indiqué<br />
à la Section 10.<br />
11.2 ECHANTILLONS CLINIQUES<br />
11.2.1 Aspect des cellules contaminées par l’adénovirus<br />
Une fluorescence granulaire intranucléaire, nucléaire et/ou cytoplasmique vert-pomme apparaît dans les<br />
cellules épithéliales respiratoires ou conjonctives contaminées par l'adénovirus.<br />
Les cellules non contaminées se colorent en rouge au contact du bleu d’Evans, le contre-colorant.<br />
11.2.2 Interprétation des résultats<br />
Le diagnostic est positif lorsqu'une ou plusieurs cellule(s) présente(nt) une fluorescence caractéristique<br />
dans l'échantillon fixé coloré (voir Section 11.2.1).<br />
Le diagnostic est négatif lorsque les échantillons fixés et colorés ne présentent pas de fluorescence après<br />
marquage avec le réactif.<br />
En ce qui concerne les échantillons ophtalmiques ou d'aspirations nasopharyngiennes colorés directement,<br />
un minimum de 20 cellules épithéliales respiratoires ou conjonctives non infectées doit être visible pour<br />
permettre de conclure à un résultat négatif. Voir Section 11.2.3 s'il n'y a pas suffisamment de cellules.<br />
11.2.3 Quantité de cellules insuffisante<br />
S'il n'y a pas suffisamment de cellules sur la lame, centrifuger le reste de l'échantillon clinique à 380g,<br />
pendant 10 minutes, à température ambiante (15-30 °C). Remettre les cellules en suspension dans un plus<br />
petit volume de PBS avant répartition (25µL) sur la lame.<br />
Le cas échéant, il est conseillé de prélever un nouvel échantillon.<br />
11.3 CONFIRMATION DE LA CULTURE CELLULAIRE<br />
11.3.1 Aspect de cellules contaminées par l'adénovirus<br />
Une fluorescence intracellulaire, nucléaire et/ou cytoplasmique, vert-pomme apparaît dans les cellules<br />
infectées qui doivent être notées comme étant contaminées par l’adénovirus.<br />
Les cellules non contaminées se colorent en rouge au contact du, bleu d’Evans, le contre-colorant.<br />
11.3.2 Interprétation des résultats<br />
Le diagnostic est positif lorsqu'au moins une cellule dans l’échantillon fixé et coloré affiche le type de<br />
fluorescence décrit à la Section 11.3.1. après marquage à l'aide du réactif.<br />
Pour pouvoir conclure à un résultat négatif, il est nécessaire de relever un minimum de 50 cellules non<br />
infectées dans le puits de la lame contenant la culture cellulaire testée. Voir Section 11.3.3 s'il n'y a pas<br />
suffisamment de cellules.<br />
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11.3.3 Quantité de cellules insuffisante<br />
S'il n'y a pas suffisamment de cellules sur la lame, centrifuger le reste de l'échantillon clinique à 200g,<br />
pendant 10 minutes, à température ambiante (15-30 °C). Remettre les cellules en suspension dans un plus<br />
petit volume de PBS avant répartition (25µL) sur la lame.<br />
Le cas échéant, il est conseillé d’inoculer un nouvel échantillon sur des monocouches cellulaires fraîches et<br />
de recommencer la culture cellulaire.<br />
12 LIMITES DU TEST<br />
12.1 Utiliser exclusivement le liquide de montage fourni avec le test IMAGEN Adénovirus.<br />
12.2 L’apparence de l’image de fluorescence obtenue peut varier en fonction du type de microscope et de<br />
la source lumineuse utilisés.<br />
12.3 Il est recommandé d'utiliser 25µL de réactif pour couvrir la surface d'un puits de 6mm de diamètre. Si<br />
ce volume est réduit, il peut de s'avérer difficile de couvrir la surface de l'échantillon, au risque de diminuer<br />
la sensibilité.<br />
12.4 Tous les réactifs sont fournis prêts à l'emploi, à des concentrations prédéterminées. Les<br />
performances pourraient être affectées en cas de modification des réactifs par l'utilisateur ou de non<br />
respect des conditions de conservation, comme cela est indiqué dans la Section 5.<br />
12.5 Le prélèvement d'échantillons à un moment inapproprié, l'échantillonnage et/ou la manipulation<br />
incorrect(e/s) des échantillons, l’échec de la culture cellulaire, etc. sont autant de facteurs qui peuvent<br />
empêcher la détection de l’adénovirus. Un résultat négatif n'exclut pas pour autant la possibilité d'une<br />
contamination adénovirale.<br />
12.6 La présence d'adénovirus dans les secrétions nasopharyngiennes n'exclut pas nécessairement la<br />
possibilité d'une infection concomitante avec d'autres agents pathogènes. Tous les résultats positifs doivent<br />
être interprétés avec circonspection lorsqu'on sait que l'adénovirus peut être latent et recrudescent. Une<br />
excrétion asymptomatique peut survenir jusqu'à 18 mois après l'infection. 20 Les résultats du test doivent être<br />
interprétés en tenant compte des informations fournies par les études épidémiologiques, l’évaluation clinique<br />
du patient et autres procédures de diagnostic.<br />
12.7 Les résultats du test doivent être interprétés en tenant compte des informations fournies par les études<br />
épidémiologiques, l’évaluation clinique du patient et autres procédures de diagnostic.<br />
13 VALEURS NORMALES<br />
Les diverses sous-catégories d'adénovirus présentent des tropismes différents. Toutefois, les maladies se<br />
manifestent d'abord sous forme d'infections respiratoires, oculaires et entériques. Le taux d'isolement positif<br />
varie, en fonction du test utilisé, des conditions de prélèvement des échantillons, de l'âge de la population<br />
testée et d'un facteur de surpeuplement éventuel affectant la population concernée.<br />
Le taux d'isolement est influencé par la gravité des maladies associées au virus, de même que par la<br />
tendance qu'ont les souches de virus à provoquer des infections chroniques avec excrétion du virus<br />
pendant de longues périodes.<br />
Les adénovirus sont responsables de 5 % des infections respiratoires graves chez les enfants âgés de<br />
moins de 4 ans et de 10 % des infections respiratoires nécessitant une hospitalisation pour ce même<br />
groupe. 3,6,7 Les cas de cystites hémorragiques aiguës chez les enfants peuvent être dus à des adénovirus.<br />
Les adénovirus entériques sont à l'origine de 4 à 15 % des cas d'hospitalisation d'enfants atteints de gastroentérites<br />
virales et s'attaquent de préférence aux enfants de moins de 3 ans. 3,11,12<br />
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Les infections oculaires dues aux adénovirus (kératoconjonctivite épidémique et conjonctivite des piscines)<br />
touchent toutes les tranches d'âge, de même que les infections adénovirales des patients<br />
immunodéficients. 3,8<br />
Chez les adultes, et plus particulièrement parmi le personnel militaire, les adénovirus sont isolés au niveau<br />
de lésions du col de l'utérus et du pénis, ainsi que dans le cadre d'infections respiratoires graves (ARD).<br />
14 PERFORMANCES SPECIFIQUES CARACTERISTIQUES<br />
14.1 SPECIFICITE DE L'ANTICORPS MONOCLONAL AVEC LES SEROTYPES D'ADENOVIRUS<br />
On a constaté que l'anticorps monoclonal utilisé dans ce test réagissait avec un épitope spécifique du genre<br />
de la protéine hexon d'adénovirus qui est présent dans tous les types sérologiques humains connus.<br />
14.2 ETUDES CLINIQUES<br />
Le test IMAGEN Adénovirus a été évalué par utilisation directe dans deux centres d'études cliniques, sur<br />
des secrétions nasopharygiennes prélevées sur des enfants et des adultes hospitalisés et présentant des<br />
symptômes d'infections respiratoires. Ce test a également été évalué par un centre ophtalmologique sur<br />
des échantillons conjonctifs prélevés sur des patients atteints de conjonctivite. Trois centres d'étude ont<br />
évalué le test IMAGEN Adénovirus pour détecter l'adénovirus dans la culture cellulaire.<br />
Ces centres ont testé directement 474 échantillons cliniques respiratoires et 179 échantillons conjonctifs,<br />
plus 296 échantillons en confirmation de culture. Les tests standard pour les prélèvements directs<br />
consistaient en une culture cellulaire suivie ou non d'une immunofluorescence indirecte et, pour la<br />
confirmation de la culture, les tests standard consistaient en une immunofluorescence indirecte utilisant un<br />
anticorps polyclonal ou en une neutralisation spécifique.<br />
Tous les calculs supposent que les tests standard sont sensibles et spécifiques à 100 %. La sensibilité, la<br />
spécificité et les valeurs prédictives ont été calculées comme décrit précédemment. 21<br />
14.3 PERFORMANCES CLINIQUES<br />
14.3.1 Echantillons directs<br />
Secrétions nasopharyngiennes<br />
Des échantillons cliniques frais ont été testés au cours de l'hiver 1988/1989 et des échantillons conservés<br />
(congelés) prélevés au cours des hivers 1978 et 1988 ont également fait l'objet d'un test. Les deux centres<br />
ont comparé le test IMAGEN Adénovirus avec les méthodes de référence. Le résultat était considéré<br />
comme positif selon la méthode de référence lorsque la culture cellulaire ou l'immunofluorescence indirecte<br />
était positive. Cela permit de détecter la présence de virus non viable par fluorescence ou de détecter un<br />
virus débarrassé de cellules par culture cellulaire. Un échantillon était considéré comme positif selon le test<br />
IMAGEN Adénovirus lorsqu'une ou plusieurs cellule(s) épithéliale(s) fluorescente(s) apparaissai(en)t (voir<br />
Section 11.2).<br />
Le tableau 14.1 présente les résultats du test IMAGEN Adénovirus. Le taux de prévalence de<br />
l'adénovirus au sein de ces populations atteint 9,1 % (43/474). Ces résultats correspondent à ceux qui ont<br />
été obtenus dans le cadre des tests standard pour 468 cas (98,7 %). La sensibilité du test IMAGEN<br />
Adénovirus test atteint 86,0 % (37/43) et sa spécificité 100 % (431/431). Les valeurs prospectives pour les<br />
résultats positifs et négatifs atteignent respectivement 100 % (37/37) et 98,6 % (431/437).<br />
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Tableau 14.1 Comparaison des résultats obtenus avec le test IMAGEN Adénovirus et la culture<br />
cellulaire sur des échantillons nasopharyngiens dans 2 centres<br />
TEST RESULT<br />
Reference method<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong><br />
Neg<br />
Neg<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Neg<br />
No. of Specimens (474) 431 37 6* 0<br />
*1) 4 échantillons sur 6 ont pris plus de 10 jours pour produire un effet cytopathogène en culture, ce qui<br />
indique vraisemblablement que le taux d'antigènes présents était très faible.<br />
2) 2 échantillons sur 6 étaient négatifs par immunofluorescence indirecte.<br />
Echantillons ophtalmiques<br />
Le test IMAGEN Adénovirus a été évalué par rapport à un système de culture cellulaire établi. Les<br />
prélèvements conjonctifs ont été effectués sur 179 patients atteints de conjonctivite soignés dans un hôpital<br />
spécialisé. Le taux de prévalence des infections à adénovirus dans le groupe d'individus étudié atteint 19,6<br />
% (35/179). Les frottis ont été préparés à partir de prélèvements effectués à la consultation puis placés<br />
dans un milieu de transport en vue de l'évaluation de la culture cellulaire. Un échantillon était considéré<br />
comme positif avec le test IMAGEN Adénovirus lorsqu'une ou plusieurs cellule(s) épithéliale(s)<br />
fluorescente(s) apparaissai(en)t (voir Section 11.2). Un échantillon était considéré comme positif avec le<br />
test de culture cellulaire lorsque l'effet cytopathologique caractéristique était confirmé par<br />
l'immunofluorescence indirecte. Les résultats de cette étude sont mentionnés dans le Tableau 14.2. Sur les<br />
179 échantillons testés, le même résultat a été observé selon les deux méthodes dans 174 cas, soit une<br />
corrélation de 97,2 %. La sensibilité et la spécificité du test IMAGEN Adénovirus atteint respectivement<br />
91,4 % (32/35) et 98,6 % (142/144). Les valeurs prédictives pour les tests positifs et négatifs atteignent<br />
respectivement 94,1 % (32/34) et 97,9 % (142/145).<br />
Tableau 14.2 Comparaison des résultats obtenus avec le test IMAGEN Adénovirus et la<br />
culture cellulaire sur des échantillons ophtalmiques humains<br />
TEST RESULTAT<br />
Méthode de référence<br />
IMAGEN Adénovirus<br />
Nég<br />
Nég<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Nég<br />
Nombre d'échantillons (179) 142 32 3* 2**<br />
* Quantité insuffisante de prélèvement pour répéter le test.<br />
** Ces 2 prélèvements n'ont été mis en culture que sur 2 jours.<br />
14.2.2 Confirmation de la culture cellulaire<br />
Trois centres d'étude ont testé le test IMAGEN Adénovirus sur les cultures cellulaires d'échantillons<br />
cliniques. Ce test a été comparé aux tests d'immunofluorescences indirectes et/ou de neutralisation pour la<br />
culture cellulaire. Les isolements ont été effectués sur des lignées de cellules habituellement utilisées pour<br />
la culture d'adénovirus. Les cultures cellulaires ont été lavées dans du PBS avant d'être transférées sur les<br />
lames. Les lames ont été fixées à l'acétone puis testées à l'aide des réactifs du test IMAGEN Adénovirus.<br />
On a utilisé à la fois des prélèvements cliniques frais et des échantillons précédemment congelés. Au total,<br />
296 cultures ont été évaluées. Les cultures cellulaires positives isolées ont été confirmées par des tests soit<br />
d'immunofluorescence, soit de neutralisation.<br />
Les résultats de ces études (Tableau 14.3) indiquent que le test IMAGEN Adénovirus a détecté tous les<br />
isolats d'adénovirus positifs, soit une sensibilité de 100 % (162/162). La spécificité du réactif atteint elle<br />
aussi 100 % (134/134).<br />
Neg<br />
Pos<br />
Nég<br />
Pos<br />
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Tableau 14.3 Comparaison des résultats obtenus par le test IMAGEN Adénovirus et les<br />
méthodes standard de confirmation de culture dans 3 centres<br />
TEST RESULT<br />
Standard confirmation<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong><br />
Neg<br />
Neg<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Neg<br />
No. of Specimens (296) 134 162 0 0<br />
14.3 REACTIONS CROISEES<br />
Le test IMAGEN Adénovirus a été réalisé sur des préparations composées d'autres virus et organismes<br />
susceptibles d'être présents dans des échantillons respiratoires ou ophtalmiques ou de culture cellulaire.<br />
Tous les organismes testés (Tableau 14.4) se sont révélés négatifs avec le test IMAGEN Adénovirus.<br />
Tableau 14.4 Organismes testés selon le test IMAGEN Adénovirus et s'étant révélés<br />
non réactifs<br />
Acholeplasma laidlawii<br />
Branhamella catarrhalis<br />
Candida albicans<br />
Chlamydia psittaci<br />
Chlamydia trachomatis<br />
Virus Coxsackie<br />
Cytomegalovirus<br />
Echovirus<br />
Virus d’Epstein-Barr<br />
Haemophilus influenzae<br />
Herpes simplex virus<br />
Virus Influenza A & B<br />
Legionella pneumophila<br />
Virus de la rougeole<br />
Virus des oreillons<br />
Mycobacterium avium<br />
Mycobacterium intracellulare<br />
Mycobacterium tuberculosis<br />
Mycoplasma arginini<br />
Mycoplasma hominis<br />
Mycoplasma hyorhinus<br />
Mycoplasma orale<br />
Mycoplasma pneumoniae<br />
Mycoplasma salivarium<br />
Neisseria cinerea<br />
Neisseria flavescens<br />
Neisseria gonorrhoea<br />
Neisseria lactamica<br />
Neisseria meningitidis A, B, C & D<br />
Neisseria mucosa<br />
Neisseria perflava<br />
Neisseria pharyngis<br />
Virus parainfluenza types 1,2,3 & 4b<br />
Pneumocystis carinii<br />
Virus de la polio types 1 & 2<br />
Virus respiratoire syncytial<br />
Rhinovirus<br />
Staphylococcus aureus<br />
Streptococcus gps A,B,C,D,F,G<br />
Virus varicella zona<br />
Neg<br />
Pos<br />
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1 ZWECKBESTIMMUNG<br />
Der IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test ist ein qualitativer, direkter Immunfluoreszenztest zum Nachweis von<br />
<strong>Adenovirus</strong>-Antigen in klinischen Proben und dient zum <strong>Adenovirus</strong>-Nachweis in Zellkulturen.<br />
2 EINFÜHRUNG<br />
Adenoviren sind hüllenlose, ikosaedrische DNA-Viren. Die Familie der Adenovien umfaßt 2 Gattungen,<br />
Adenoviren der Säuger (Mastadenoviren) und Adenoviren der Vögel (Aviaadenoviren). 1 Mindestens 47<br />
bekannte Serotypen humaner Adenoviren wurden nachgewiesen und mit Verfahren wie der<br />
Hämagglutination, Neutralisation, DNA-Hybridisierung sowie Restriktionsendonuklease-Analyse der<br />
adenoviralen DNA beschrieben. 1,2,3,4<br />
Humane Adenoviren sind mit einer Vielzahl klinischer Erkrankungen, sowohl bei immunkompetenten als<br />
auch abwehrgeschwächten Patienten assoziiert; dazu gehören Infektionen des Respirationstrakts, der<br />
Konjunktiva und des Gastrointestinaltrakts. 3,5 Infektionen kommen häufig bei Kindern vor und können<br />
sporadisch oder als Ausbrüche auftreten.<br />
Circa 5 % der akuten Atemwegserkrankungen bei Kindern und 10 % der fieberhaften Erkrankungen und<br />
Pneumonien im Kindesalter sind mit <strong>Adenovirus</strong>-Infektionen in Zusammenhang gebracht worden. 3,6,7<br />
<strong>Adenovirus</strong>-Infektionen des Auges können zu Pharyngokonjunktivalfieber, Conjunctivitis folicularis oder<br />
epidemischer Keratokonjunktivitis führen. 3,8<br />
Die <strong>Adenovirus</strong>-Serotypen 40 und 41 sind häufig mit Virusgastroenteritis bei Kleinkindern verbunden und<br />
sind für 4-15 % der nosokomialen Infektionen auf Kinderstationen verantwortlich. 3,9,10 Bei<br />
abwehrgeschwächten Patienten (z. B. nach Transplantationen oder bei AIDS-Patienten) können ernsthafte<br />
systemische Infektionen auftreten, die lebensbedrohlich sein können. 3<br />
Die Labordiagnose der <strong>Adenovirus</strong>-Infektion spielt eine wichtige Rolle für die Behandlung der Patienten und<br />
ermöglicht eine wirksame Kontrolle von Ausbrüchen. Zu den diagnostischen Methoden zählen der direkte<br />
Nachweis des Virus oder der Virusproteine in klinischen Proben (z. B. nasopharyngealen Absaugsekreten),<br />
die Isolierung des lebensfähigen Virus auf Einschicht-Zellkulturen, die mit Atemwegs-, Konjunktival- oder<br />
Stuhlproben inokuliert wurden und der Nachweis adenovirusspezifischer Immunglobuline. 3,5<br />
Die Isolierung der Adenoviren aus klinischen Proben erfolgt mit kontinuierlichen Zelllinien hauptsächlich<br />
epithelialen Ursprungs, wie HeLa-, HEp-2-, KB- und 293-Zelllinien, bei denen Adenoviren den<br />
charakteristischen zytopathischen Effekt zeigen können. 3,5<br />
Die Identifikation von <strong>Adenovirus</strong>-Isolaten ist mit Hilfe verschiedener Techniken bestätigt worden; zu ihnen<br />
gehören Neutralisationstests, Radioimmunoassay, DNA-Hybridisierung, Elektronenmikroskopie und<br />
DNA-Elektrophorese. 11,12,13,14,15 Diese Verfahren sind kompliziert, arbeitsaufwendig und meist für die<br />
routinemäßige Anwendung ungeeignet.<br />
Kürzlich wurden indirekte Immunfluoreszenztests oder Enzymimmunoassays (z. B. IDEIA <strong>Adenovirus</strong>)<br />
zum direkten Nachweis von Adenoviren in klinischen Proben oder auf Einschicht-Zellkulturen beschrieben,<br />
bei denen gattungsspezifische mono- oder polyklonale Antikörper eingesetzt werden. 15,16,17<br />
Direkte Immunfluoreszenztests, bei denen spezifische monoklonale Antikörper zur Anwendung gelangen,<br />
bieten eine schnelle, empfindliche und spezifische Methode zum direkten Nachweis von Adenoviren in<br />
klinischen Proben wie nasopharyngealen Absaugsekreten und Konjunktivalabstrichen oder zur Bestätigung<br />
isolierter Adenoviren auf Einschicht-Zellkulturen.<br />
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IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> ist ein direkter Immunfluoreszenztest zum Nachweis und zur Identifikation humaner<br />
<strong>Adenovirus</strong>-Serotypen in klinischen Proben oder Zellkulturen. Im Test gelangt ein gattungsspezifischer<br />
monoklonaler Antikörper zur Anwendung, der ein Epitop des <strong>Adenovirus</strong>-Hexonproteins nachweist, das in<br />
allen bekannten humanen <strong>Adenovirus</strong>-Serotypen exprimiert wird. 18<br />
3 TESTPRINZIP<br />
Der IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test enthält Fluoresceinisothiocyanat- (FITC-) konjugierte monoklonale<br />
Antikörper. Das konjugierte Reagenz bindet spezifisch an ein Epitop, das dem Hexonprotein aller<br />
Serotypen humaner Adenoviren gemein ist. Das Reagenz wird in einem direkten<br />
Einschritt-Immunfluoreszenztest eingesetzt. Die Proben werden mit dem FITC-konjugierten Antikörper<br />
15 Minuten inkubiert und anschließend wird überflüssiges Reagenz durch Waschen mit<br />
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Die gefärbten Flächen werden eingedeckt und anhand<br />
der Epifluoreszenz-Mikroskopie ausgewertet. Falls Adenoviren vorliegen, ist im Zytoplasma und/oder<br />
Zellkern infizierter Zellen eine charakteristische helle, apfelgrüne Fluoreszenz zu beobachten, die im<br />
Kontrast zur roten Hintergrundfärbung nicht infizierter Zellen steht.<br />
Anerkennung<br />
Der in diesem Test verwendete monoklonale Antikörper stammt aus der Division of Microbiological<br />
Reagents and Quality Control, Central Public Health Laboratory, Colindale, London, Großbritannien.<br />
4 DEFINITIONEN<br />
Die folgenden Symbole und Definitionen entsprechen ISO 15223 und EN 980 und wurden in den<br />
Produktinformationen verwendet.<br />
N<br />
Produktcode und Bestellnummer<br />
Gebrauchsanweisung beachten<br />
Inhalt ausreichend für ‚n’ Ansätze<br />
Hersteller<br />
In-Vitro-Diagnostikum<br />
Verwendbar bis<br />
Chargenbezeichnung<br />
Zulässiger Temperaturbereich<br />
5 GELIEFERTE REAGENZIEN<br />
50 - Jeder Testkit enthält ausreichend Reagenzien für die Durchführung des Tests an 50<br />
Patientenproben oder an 50 Zellkulturpräparationen. - Die Haltbarkeit des Testkits ist auf dem äußeren<br />
Verpackungsetikett vermerkt.<br />
5.1 IMAGEN ADENOVIRUS-REAGENZ<br />
Eine Gebrauchsanleitung.<br />
Jeweils ein Fläschchen der folgenden Reagenzien:<br />
2 x als Positivkontrolle vorgesehene Objektträger mit 1 Vertiefung und<br />
Azeton-fixierten humanen Epithelzellen (HEp-2), die mit <strong>Adenovirus</strong> infiziert sind.<br />
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Ein Fläschchen mit 3 mL Eindeckmedium. Das Eindeckmedium enthält eine<br />
Hemmsubstanz gegen lichtbedingtes Ausbleichen in einer Glyzerinlösung<br />
(pH 10,0) und ist bei 2-8 °C aufzubewahren.<br />
Ein Fläschchen mit 1,4 mL IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Testreagenz. Das Reagenz<br />
enthält gereinigten, murinen, monoklonalen Antikörper, spezifisch gegen ein<br />
gemeinsames Epitop am <strong>Adenovirus</strong>-Hexonprotein und mit FITC konjugiert.<br />
Das Konjugat wurde in einer proteinstabilisierten Pufferlösung (pH 7,5)<br />
angesetzt, enthält Evans-Blau als Gegenfärbemittel und 15 mmol/L Natriumazid<br />
als Konservierungsmittel.<br />
5.2 ANSETZEN, LAGERUNG UND ERNEUTE VERWENDUNG DER KIT-KOMPONENTEN<br />
Um optimale Leistung der Kit-Komponenten sicherzustellen, müssen alle nicht genutzten Komponenten in<br />
Übereinstimmung mit den folgenden Anleitungen gelagert werden:<br />
5.3 POSITIVE KONTROLLOBJEKTTRÄGER -<br />
Als Positivkontrolle dienende Objektträger werden einzeln in versiegelten und mit Stickstoff gefüllten<br />
Kunststoffbeuteln geliefert. Nicht verwendete Objektträger bei 2-8 °C lagern. Vor dem Öffnen den<br />
Objektträger 5 Minuten lang Raumtemperatur (15-30 °C) annehmen lassen.<br />
Die Objektträger müssen unmittelbar nach dem Öffnen der Folienhüllen angefärbt werden.<br />
5.4 EINDECKMEDIUM -<br />
Gebrauchsfertig. Bei 2-8 °C lagern. Das Eindeckmedium vor Gebrauch 5 Minuten auf Raumtemperatur<br />
(15-30 °C) bringen.<br />
5.5 REAGENZ -<br />
Gebrauchsfertig. Das Reagenz bei 2-8 °C im Dunkeln aufbewahren und vor Gebrauch 5 Minuten lang auf<br />
Raumtemperatur (15-30 °C) bringen.<br />
6 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN UND ERFORDERLICHES ZUBEHÖR<br />
6.1 REAGENZIEN<br />
Frisches Azeton (zur Fixierung).<br />
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, zum Waschen der gefärbten Proben und zur<br />
Probenvorbereitung.<br />
6.2 ZUBEHÖR UND GERÄTE<br />
Die folgenden Produkte sind für die Anwendung zusammen mit IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> bestimmt. Weitere<br />
Informationen können von der zuständigen DakoCytomation-Niederlassung oder vom zuständigen Händler<br />
angefordert werden.<br />
Von der zuständigen DakoCytomation-Niederlassung oder vom zuständigen Händler können Teflonbeschichtete<br />
Glasobjektträger mit einer einzelnen Vertiefung mit einem Durchmesser von 6 mm bezogen<br />
werden (100 Objektträger pro Gebinde; Code-Nr. S 6114).<br />
Positiver Kontrollobjektträger (Code-Nr. S 6125).<br />
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7 AUSSTATTUNGEN<br />
Es werden folgende Ausstattungen benötigt:<br />
Präzisionspipette und Einmal-Pipettenspitzen, 25 µL.<br />
Waschtrog.<br />
Deckgläser zum Eindecken einer Vertiefung mit 6 mm Durchmesser.<br />
Nicht fluoreszierendes Immersionsöl.<br />
Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Filtersystem für FITC (maximale Anregungswellenlänge 490 nm,<br />
mittlere Emissionswellenlänge 520 nm) und 200-500facher Vergrößerung.<br />
Inkubator für 37 °C.<br />
Niedertourige Zentrifuge.<br />
Für direkte Proben<br />
Sterile Tupfer.<br />
Schleim-Extraktor (nur für nasopharyngeale Proben).<br />
Zur Zellkultur-Bestätigung<br />
Sterile Tupfer und Virus-Transportmedium (VTM) und Behälter, geeignet für Gewinnung und Transport von<br />
Adenoviren.<br />
Für das Anlegen einer Kultur und für die Isolierung von Adenoviren geeignete Zelllinien.<br />
8 VORSICHTSMASSNAHMEN<br />
- In vitro Diagnostikum. Personen, die Tests mit diesem Produkt durchführen, müssen in die<br />
Durchführung eingewiesen sein und über entsprechende Laborerfahrung verfügen.<br />
8.1 SICHERHEITSMASSNAHMEN<br />
8.1.1 Das IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Testreagenz enthält 15 mmol/L. Natriumazid. Natriumazid ist ein Gift, das<br />
mit Blei und Kupferleitungen reagieren und hochexplosive Metallazide bilden kann. Beim Entsorgen der<br />
azidhaltigen Materialien immer mit reichlich Wasser spülen.<br />
8.1.2 Adenoviren auf den positiven Kontrollobjektträgern haben sich in Zellkulturen nachweislich als nicht<br />
infektiös erwiesen; trotzdem sind sie als potentiell infektiös zu handhaben und zu entsorgen.<br />
8.1.3 Das Reagenz enthält Evans-Blau. Evans-Blau ist möglicherweise karzinogen; Hautkontakt ist deshalb<br />
zu vermeiden.<br />
8.1.4 Bei Verwendung des Eindeckmediums muss vorsichtig vorgegangen werden, da es Hautirritationen<br />
verursachen kann. Falls es zu einem Kontakt kommt, muss die Haut mit Wasser abgewaschen werden.<br />
8.1.5 Essen, Trinken, Rauchen, Aufbewahren und Zubereiten von Speisen sowie Schminken sind im für<br />
Arbeiten vorgesehenen Bereich (Labor) verboten.<br />
8.1.6 Reagenzien dürfen nicht mit dem Mund pipettiert werden.<br />
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8.1.7 Beim Handhaben von klinischen Proben und infizierten Zellen sind immer Einweghandschuhe zu<br />
tragen und nach dem Umgang mit infektiösen Stoffen sind immer die Hände zu waschen.<br />
8.1.8 Alle klinischen Proben entsprechend den geltenden gesetzlichen Vorschriften entsorgen.<br />
8.1.9 Von fachlich qualifizierten Anwendern kann ein Sicherheitsdatenblatt angefordert werden.<br />
8.2 TECHNISCHE VORSICHTSMASSNAHMEN<br />
8.2.1 Kit-Komponenten dürfen nach Ablauf des auf den Etiketten vermerkten Verfalldatums (Verwendbar<br />
bis:) nicht mehr verwendet werden. Reagenzien aus verschiedenen Chargen dürfen nicht vermischt oder<br />
gegeneinander ausgetauscht werden.<br />
8.2.2 Die Reagenzien werden in festgelegten Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung wird<br />
beeinträchtigt, falls Reagenzien modifiziert oder unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten<br />
Bedingungen gelagert werden.<br />
8.2.3 Die erforderliche Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ist am Tag der Anwendung frisch<br />
anzusetzen.<br />
8.2.4 Waschschritte müssen mit PBS durchgeführt werden. Die Verwendung anderer Waschlösungen, wie<br />
z. B: Leitungswasser oder destilliertes Wasser, beeinträchtigt die Testergebnisse.<br />
8.2.5 Mikrobielle Kontamination der Reagenzien muss vermieden werden.<br />
8.2.6 Die Reagenzien dürfen nicht tiefgekühlt werden.<br />
9 GEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER PROBEN 19<br />
Gewinnung und Vorbereitung der Proben sind bei der Diagnose von Adenoviren mittels direkter<br />
Immunfluoreszenz und Zellkultur-Methoden von grundlegender Bedeutung. Proben müssen vom<br />
Infektionsort zum Zeitpunkt der maximalen Freisetzung von Viren („viral shedding“) gewonnen werden,<br />
damit sie so viel infiziertes Material als möglich enthalten. Außerdem müssen Proben so vorbereitet<br />
werden, dass entweder intakte Zellen erhalten bleiben, die von anhaftendem Mukus usw. frei sind und eine<br />
direkte mikroskopische Untersuchung ermöglichen oder dass die Lebensfähigkeit der Viren in Proben<br />
erhalten bleibt, anhand derer eine Kultur angelegt werden soll.<br />
9.1 KLINISCHE PROBEN<br />
9.1.1 Ophthalmische Proben<br />
Gewinnung<br />
Das Auge lokal betäuben, anschließend die obere und untere Konjunktiva freilegen. Ein Stäbchen mit einer<br />
Watte- oder Dacron -Spitze kräftig über die Flächen der oberen und unteren Konjunktiva streichen und<br />
das Stäbchen während dieses Prozesses rotieren, um sicherzustellen, dass die Probe von der gesamten<br />
Fläche der Konjunktiva gewonnen wird.<br />
Vorbereitung der Objektträger<br />
Das zur Probengewinnung genutzte Wattestäbchen mit leichtem Druck innerhalb der 6 mm Vertiefung auf<br />
dem Objektträger hin und her rollen. Sicherstellen, dass zum Vorbereiten des Objektträgers die gesamte<br />
Stäbchenspitze verwendet wird. Probe bei Raumtemperatur (15-30 °C) an der Luft trocknen lassen und<br />
daraufhin 10 Minuten lang mit frischem Azeton fixieren. Objektträger an der Luft trocknen lassen. Falls der<br />
Objektträger nicht sofort angefärbt wird, kann er über Nacht bei 4 °C aufbewahrt werden.<br />
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9.1.2 Nasopharyngeale Sekrete/Absaugsekrete<br />
Gewinnung<br />
Proben aus dem nasopharyngealen Bereich durch eine Sonde (Größe 8) in einen Mukusextraktor<br />
gewinnen. Mukusextraktor und Schlauchmaterial müssen bei Temperaturen 2-8 °C gehalten und so schnell<br />
als möglich zur Verarbeitung ans Labor weitergeleitet werden.<br />
Zellseparation<br />
Falls notwendig, der Probe vor Zentrifugation 2 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugeben, um<br />
die Viskosität zu verringern und den Schleim zu verdünnen. Den Schleim-Extraktor bei Raumtemperatur<br />
(15-30 °C) 10 Minuten bei 380 g zentrifugieren. Den Überstand, der für Zellkulturen verwendet werden<br />
kann, entfernen. Das Zellsediment in 2 mL PBS resuspendieren und die Zellen mit einer Weitschaft-Pipette<br />
vorsichtig auf und ab pipettieren oder in einem Vortex-Gerät vorsichtig mischen, bis der Schleim separiert<br />
und das Zellmaterial freigegeben wird. Heftiges Pipettieren/Mischen ist zu vermeiden, um eine<br />
Beschädigung der Zellen zu verhindern. Sobald sich eine gleichmäßige Suspension gebildet hat, je nach<br />
Bedarf weitere PBS zugeben und nach Zugabe der zusätzlichen PBS wieder pipettieren oder in einem<br />
Vortex-Gerät mischen, um die Zellen weiter zu waschen. Jegliche sichtbaren, bis zu diesem Stadium noch<br />
verbliebenen Schleimteilchen entfernen und entsorgen. Überschüssiger Schleim muss entfernt werden, weil<br />
sonst eine adäquate Penetration des Reagenzes verhindert wird, was zu einer unspezifischen Fluoreszenz<br />
führen kann.<br />
Falls das ganze Sekret in der Ernährungssonde verbleibt und nichts davon den Schleim-Extraktor erreicht,<br />
das gesamte Sekret aus der Sonde in PBS herauswaschen. Das wird am besten erreicht, indem eine<br />
Pasteur-Pipette in das Sondenende eingeführt wird, das sich am Schleim-Extraktor befand. Die<br />
entsprechende Flüssigkeit in die Sonde saugen und wiederholt hinausdrücken, bis sich das an der<br />
Sondenwand befindliche Sekret gelöst hat. Die so erhaltene Suspension wird solange auf und ab pipettiert,<br />
bis der Schleim adäquat aufgebrochen ist.<br />
Vorbereitung der Objektträger<br />
Nach der Separation wird die Zellsuspension bei Raumtemperatur (15-30 °C) 10 Minuten bei 380 g<br />
zentrifugiert und der Überstand entsorgt. Das Zellsediment in ausreichend PBS resuspendieren, um<br />
jegliche verbliebenen Schleimreste zu verdünnen und gleichzeitig eine hohe Zelldichte beizubehalten.<br />
25 µL des resuspendierten Zellsediments in die 6 mm große Vertiefung eines teflonbeschichteten<br />
Mikroskopobjektträgers geben. Die Probe bei Raumtemperatur (15-30 °C) gründlich trocknen lassen und in<br />
frischem Azeton bei Raumtemperatur (15-30 °C) 10 Minuten fixieren. Wird die Probe nicht sofort gefärbt, ist<br />
sie über Nacht bei 4 °C aufzubewahren oder für eine längere Aufbewahrungszeit bei –20 °C einzugefrieren.<br />
9.2 ZELLKULTUR<br />
Beimpfung von Zellkulturen<br />
Zur Diagnose von <strong>Adenovirus</strong>-Infektionen gewonnene Proben werden auf Zelllinien inokuliert, die in<br />
Laboratorien routinemäßig und nach etablierten Labormethoden zur Anwendung gelangen. Zellkulturen<br />
sind regelmäßig auf das Auftreten zytopathischer Effekte (cytopathic effect, CPE) zu untersuchen und es<br />
sind regelmäßige Hämadsorptionstests durchzuführen. Im Hämadsorptionstest positive Kulturen oder CPE<br />
aufweisende Zellkulturen können geerntet und auf das Vorliegen des <strong>Adenovirus</strong> getestet werden.<br />
Vorbereitung der Objektträger<br />
Wird mit einer <strong>Adenovirus</strong>-Infektion konsistente Hämadsorption oder CPE beobachtet, dann kann die<br />
Monolayer-Kultur geerntet werden, wenn mindestens 50 % der Zellen betroffen sind.<br />
Die Zellschicht mit einer sterilen Pipette in das flüssige Kulturmedium schaben. Die Zellen durch 10minütige<br />
Zentrifugation bei 200 g und Raumtemperatur (15-30 °C) sedimentieren und den Überstand entsorgen.<br />
Die Zellen durch Resuspension des Zellsediments in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, siehe<br />
Abschnitt 8.2) waschen und die Zentrifugation wiederholen. Den Überstand entsorgen und das<br />
Zellsediment in einer kleinen Menge frischer PBS resuspendieren, um eine hohe Zelldichte beizubehalten.<br />
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Je 25 µL der Suspension in die Vertiefungen der Objektträger geben. Gründlich an der Luft trocknen lassen<br />
und in frischem Azeton 10 Minuten bei Raumtemperatur (15-30 °C) fixieren. Wird die Probe nicht sofort<br />
angefärbt, ist sie über Nacht bei 4 °C aufzubewahren oder, falls eine längere Aufbewahrung vorgesehen ist,<br />
bei –20 °C einzufrieren.<br />
10 TESTVERFAHREN<br />
VOR DURCHFÜHRUNG DES TESTVERFAHRENS SIND DIE IN ABSCHNITT 8.2 AUFGEFÜHRTEN<br />
TECHNISCHEN VORSICHTSMASSNAHMEN ZU BEACHTEN.<br />
10.1 ZUSETZEN DES REAGENZES<br />
25 µL Reagenz in jede 6 mm Vertiefung geben. Dafür sorgen, dass das Reagenz den gesamten Bereich<br />
der Vertiefung bedeckt.<br />
10.2 ERSTE INKUBATION<br />
Die Objektträger 15 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren. Das Reagenz darf nicht<br />
auf der Probe eintrocknen, da dies zu unspezifischer Anfärbung führt.<br />
10.3 WASCHEN DES OBJEKTTRÄGERS<br />
Überschüssiges Reagenz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abwaschen und den Objektträger<br />
anschließend in einem Schüttelbad, das PBS enthält, 5 Minuten vorsichtig waschen. Die PBS vom<br />
Objektträger abfließen lassen und bei Raumtemperatur (15-30 °C) lufttrocknen.<br />
10.4 ZUSETZEN VON EINDECKMEDIUM<br />
Einen Tropfen IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Eindeckmedium in die Mitte jeder Vertiefung geben und mit einem<br />
Deckglas eindecken; sicherstellen, dass dabei keine Luftblasen entstehen.<br />
10.5 ABLESEN DES OBJEKTTRÄGERS<br />
Die gesamte 6 mm große Testfläche, auf der sich die gefärbte Probe befindet, mit einem Epifluoreszenz-<br />
Mikroskop untersuchen. Wie in Abschnitt 9 beschrieben, sollte die Fluoreszenz bei 200-500facher<br />
Vergrößerung sichtbar sein. (Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Proben unmittelbar nach dem<br />
Anfärben abgelesen werden; Proben können aber auch bis zu 24 Stunden bei 2-8 °C im Dunkeln<br />
aufbewahrt werden).<br />
11 INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE<br />
11.1 KONTROLLEN<br />
11.1.1 Positive Kontrollobjektträger<br />
Beim positiven Kontrollobjektträger, der gemäß Abschnitt 10 angefärbt und abgelesen wurde, sollten Zellen<br />
mit intrazellulärer nukleärer und/oder zytoplasmatischer apfelgrüner Fluoreszenz sichtbar werden, die mit<br />
einem roten Hintergrund gegengefärbten Materials kontrastiert. Diese Zellen sind etwas größer als<br />
Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva, weisen aber bei Infektion mit <strong>Adenovirus</strong> ähnliche<br />
intrazelluläre, nukleäre und/oder zytoplasmatische Fluoreszenz auf. Positive Kontrollobjektträger müssen<br />
verwendet werden, um überprüfen zu können, dass das Testverfahren ordnungsgemäß durchgeführt<br />
wurde.<br />
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11.1.2 Negative Kontrolle<br />
Falls eine negative Kontrolle erwünscht ist, empfiehlt sich die Verwendung von nicht infizierten, intakten<br />
Zellen des Typs, der zur Kultur und Isolierung von Adenoviren verwendet wird. Die Zellen sind wie in<br />
Abschnitt 9.2 beschrieben zu präparieren und zu fixieren und anschließend gemäß der Beschreibung in<br />
Abschnitt 10 anzufärben.<br />
11.2 KLINISCHE PROBEN<br />
11.2.1 Erscheinungsbild <strong>Adenovirus</strong>-infizierter Zellen<br />
Intrazelluläre, nukleäre und/oder zytoplasmatische, granuläre apfelgrüne Fluoreszenz wird bei mit<br />
<strong>Adenovirus</strong> befallenen Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva sichtbar.<br />
Nicht infizierte Zellen sind bei Gegenfärbung mit Evans-Blau rot angefärbt.<br />
11.2.2 Interpretation der Ergebnisse<br />
Eine positive Diagnose wird gestellt, wenn eine oder mehrere Zellen der fixierten angefärbten Probe die<br />
typische, in Abschnitt 11.2.1 beschriebene Fluoreszenz aufweisen.<br />
Eine negative Diagnose wird gestellt, wenn die fixierten Proben nach Anfärbung mit dem Reagenz keine<br />
Fluoreszenz aufweisen.<br />
Bei direkt angefärbtem nasopharyngealem Absaugsekret oder bei ophthalmischen Proben müssen<br />
mindestens 20 nicht infizierte Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva sichtbar sein, um ein negatives<br />
Ergebnis zu rechtfertigen. Siehe Abschnitt 11.2.3, wenn zu wenig Zellen vorliegen.<br />
11.2.3 Zu wenig Zellen<br />
Falls auf dem Objektträger zu wenig Zellen vorhanden sind, wird der Rest der klinischen Probe 10 Minuten<br />
bei 380 g und Raumtemperatur (15-30 °C) zentrifugiert. Die Zellen werden in einer kleineren Menge PBS<br />
resuspendiert (25 µL), bevor sie wieder in der Vertiefung des Objektträgers aufgebracht werden. Alternativ<br />
hierzu sollte eine neue klinische Probe angefordert werden.<br />
11.3 BESTÄTIGUNG IN DER ZELLKULTUR<br />
11.3.1 Erscheinungsbild <strong>Adenovirus</strong>-infizierter Zellen<br />
Infizierte Zellen weisen eine intrazelluläre, nukleäre und/oder zytoplasmatische apfelgrüne Fluoreszenz auf<br />
und werden als <strong>Adenovirus</strong>-positiv registriert.<br />
Nicht infizierte Zellen werden durch Evans-Blau rot gegengefärbt.<br />
11.3.2 Interpretation der Ergebnisse<br />
Eine positive Diagnose wird gestellt, wenn mindestens eine fixierte Zelle nach der Anfärbung das in<br />
Abschnitt 11.3.1 beschriebene Fluoreszenzmuster aufweist.<br />
Ein negatives Ergebnis sollte erst dann registriert werden, wenn in der untersuchten Zellkultur mindestens<br />
50 nicht infizierte Zellen vorliegen. Sollten zu wenig Zellen vorhanden sein, siehe Abschnitt 11.3.3.<br />
11.3.3 Zu wenig Zellen<br />
Falls auf dem Objektträger zu wenig Zellen vorhanden sind, wird der Rest der klinischen Probe 10 Minuten<br />
bei 200 g und Raumtemperatur (15-30 °C) zentrifugiert. Die Zellen werden in einer kleineren Menge PBS<br />
resuspendiert (25 µL), bevor sie wieder in der Vertiefung des Objektträgers aufgebracht werden.<br />
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Alternativ hierzu werden frische Monolayer mit einer neu gewonnenen Probe beimpft und die Zellkultur wird<br />
erneut angelegt.<br />
12 BEGRENZUNGEN DER METHODE<br />
12.1 Nur das mit dem IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test gelieferte Eindeckmedium verwenden.<br />
12.2 Das Erscheinungsbild der erzielten Fluoreszenz kann abhängig vom Typ des Mikroskops und der<br />
benutzten Lichtquelle unterschiedlich sein.<br />
12.3 Es empfiehlt sich, zum Abdecken des gesamten 6 mm großen Testareals 25 µL Reagenz zu<br />
verwenden. Eine Reduzierung dieses Volumens kann zu Schwierigkeiten beim Abdecken der von der<br />
Probe eingenommenen Fläche führen und die Testempfindlichkeit herabsetzen.<br />
12.4 Alle Reagenzien werden in festgelegten Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung kann<br />
beeinträchtigt werden, falls Reagenzien modifiziert oder unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten<br />
Bedingungen gelagert werden.<br />
12.5 Faktoren wie unangemessene Probengewinnung, falsche Probennahme und/oder<br />
Probenhandhabung, Versagen der Zellkultur usw. können dazu führen, dass Adenoviren nicht<br />
nachgewiesen werden. Ein negatives Resultat schließt die Möglichkeit des Vorliegens einer <strong>Adenovirus</strong>-<br />
Infektion nicht aus.<br />
12.6 Das Vorliegen von Adenoviren in nasopharyngealen Sekreten schließt nicht notwendigerweise die<br />
Möglichkeit einer begleitenden Infektion mit anderen Pathogenen aus. Alle positiven Ergebnisse müssen<br />
immer vorsichtig bewertet werden, da Adenoviren zu Latenz und Rekrudeszenz neigen. Asymptomatische<br />
Freisetzung der Viren (viral shedding) kann bis zu 18 Monate nach erfolgter Infektion stattfinden. 20 Die<br />
Testergebnisse sind zusammen mit verfügbaren Informationen aus epidemiologischen Untersuchungen,<br />
der klinischen Diagnose des Patienten und anderen diagnostischen Verfahren zu interpretieren.<br />
12.7 Die Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit epidemiologischen Informationen, dem klinischen<br />
Erscheinungsbild und anderen diagnostischen Verfahren interpretiert werden.<br />
13 ERWARTETE WERTE<br />
Die verschiedenen Mitglieder der <strong>Adenovirus</strong>-Subgattungen weisen eindeutig unterschiedliche<br />
Organtropismen auf; trotzdem manifestieren sich die Erkrankungen hauptsächlich als Infektionen des<br />
Respirationstrakts, der Augen und als enterische Infektionen. Der Anteil positiver Isolierungen hängt vom<br />
benutzten Test, einer adäquaten Probengewinnung und der Altersgruppe der getesteten Population ab, und<br />
davon, ob die untersuchten Proben aus Gegenden mit beengten Lebensverhältnissen stammen.<br />
Die Häufigkeit der Isolierung wird zum einen von der Ernsthaftigkeit virusbedingter Erkrankungen und zum<br />
anderen von der Tendenz der Virusstämme beeinflußt, andauernde Infektionen, mit Freisetzung (shedding)<br />
infizierender Viren über längere Zeiträume, zu verursachen.<br />
Bei Kindern unter 4 Jahren sind Adenoviren zu 5 % für akute Infektionen des Respirationstraktes<br />
verantwortlich; in 10 % aller Fälle, in denen Kinder dieser Altersgruppe im Krankenhaus auf<br />
Respirationstraktinfektionen behandelt werden, sind Adenoviren die Ursache. 3,6,7 Bei Kindern kann akute<br />
hämorrhagische Zystitis durch Adenoviren verursacht werden. Es wurde nachgewiesen, dass enterische<br />
Adenoviren an 4 % bis 15 % der Fälle aller hospitalisierten Kinder mit viraler Gastroenteritis beteiligt sind<br />
und besonders bei Kindern unter 3 Jahren vorherrschen. 3,11,12<br />
Augeninfektionen mit Adenoviren (epidemische Keratokonjunktivitis und Schwimmbadkonjunktivitis) können<br />
in allen Altersgruppen vorkommen, genau wie <strong>Adenovirus</strong>-Infektionen bei immungeschwächten<br />
Patienten. 3,8<br />
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Bei Erwachsenen, insbesondere Angehörigen der Streitkräfte, wurden Adenoviren aus der Zervix und aus<br />
Penisläsionen sowie bei akuten Respirationstraktinfektionen isoliert.<br />
14 SPEZIFISCHE LEISTUNGSKRITERIEN<br />
14.1 REAKTIVITÄT DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS MIT ADENOVIRUS-SEROTYPEN<br />
Der in diesem Test verwendete monoklonale Antikörper reagiert nachweislich mit einem<br />
gattungsspezifischen Epitop des <strong>Adenovirus</strong>-Hexonproteins, das in allen bekannten Serotypen beim<br />
Menschen vorhanden ist.<br />
14.2 KLINISCHE STUDIEN<br />
Der IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test wurde in zwei klinischen Prüfzentren auf seine Eignung zum<br />
Direktnachweis untersucht; getestet wurden nasopharyngeale Sekrete von Kindern und Erwachsenen, die<br />
wegen Atemwegsinfektionen stationär behandelt wurden. Der Test wurde auch in einer führenden<br />
Augenklinik an Konjunktivalabstrichen von Patienten mit Konjunktivitis ausgewertet. Drei Prüfzentren<br />
bewerteten den IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test zum Nachweis von Adenoviren in Zellkulturen.<br />
In den Prüfzentren wurden 474 klinische Proben des Respirationstrakts und 179 Konjunktivalabstriche im<br />
direkten Verfahren ausgetestet und 296 Proben zur Bestätigung in der Zellkultur. Bei den Standardtests<br />
zum Direktnachweis an Proben handelte es sich um Zellkulturen mit oder ohne indirekte Immunfluoreszenz,<br />
und bei den Standardtests zur Zellkulturbestätigung waren es der indirekte Immunfluoreszenztest mit einem<br />
polyklonalen Antikörper oder ein spezifischer Neutralisationstest.<br />
Bei allen Berechnungen wurde von einer 100%igen Sensitivität und Empfindlichkeit der Standardmethoden<br />
ausgegangen. Empfindlichkeit, Spezifizität und Vorhersagewert wurden wie zuvor beschrieben 21 berechnet.<br />
14.3 KLINISCHE LEISTUNGSFÄHIGKEIT<br />
14.3.1 Direkte Probe<br />
Nasopharyngeale Sekrete<br />
Im Winter 1988/89 wurden frische klinische Proben und eingefrorene Proben, die zwischen 1978 und 1988<br />
gewonnen worden waren, getestet. Die zwei Prüfzentren verglichen den IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test mit<br />
Referenzverfahren. Ein mit der Referenzmethode erhaltenes Ergebnis wurde als positiv bewertet, wenn<br />
entweder Zellkultur oder indirekte Immunfluoreszenz positiv ausfielen. Auf diese Weise war es möglich,<br />
nicht lebensfähige Viren durch Fluoreszenz oder zellfreie Viren durch die Zellkultur nachzuweisen. Mit dem<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test wurde eine Probe als positiv betrachtet, wenn eine oder mehrere<br />
fluoreszierende Epithelzellen sichtbar waren (siehe Abschnitt 11.2).<br />
Tabelle 14.1 zeigt die Ergebnisse des IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Testreagenzes. Die Gesamtzahl der<br />
<strong>Adenovirus</strong>fälle in diesen Populationen betrug 9,1 % (43/47). Diese Ergebnisse korrelierten in 468 Fällen<br />
mit den Standardmethoden (98,7 %). Die Empfindlichkeit des IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Tests betrug 86,0 %<br />
(37/43) und die Spezifität lag bei 100 % (431/431). Die Vorhersagewerte für positive und negative<br />
Ergebnisse betrugen 100 % (37/37) bzw. 98,6 % (431/437).<br />
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Tabelle 14.1 Vergleich der Testergebnisse von IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test und Zellkultur<br />
in 2 Prüfzentren – Durchführung an nasopharyngealen Proben<br />
TEST ERGEBNIS<br />
Zellkultur<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong><br />
Neg<br />
Neg<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Neg<br />
Anzahl der Proben (474) 431 37 6* 0<br />
*1) Von diesen 6 Proben brauchten 4 länger als 10 Tage bis zur Entwicklung des charakteristischen<br />
zytopathischen Effekts in der Zellkultur. Dies kann auf einen sehr niedrigen Antigenspiegel<br />
hinweisen.<br />
2) 2 von diesen 6 Proben waren in der indirekten Immunfluoreszenz negativ.<br />
Ophthalmische Proben<br />
Der IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> Test wurde gegen ein etabliertes Zellkultursystem ausgewertet. Die<br />
Konjunktivalabstriche wurden von 179 Patienten mit einer Konjunktivitis gewonnen, die in einer Augenklinik<br />
behandelt wurden. Die Inzidenz von <strong>Adenovirus</strong>-Infektionen in der getesteten Populationsgruppe betrug<br />
19,6 % (35/179). Die Ausstriche wurden mit den im Krankenhaus entnommenen Probenabstrichen<br />
hergestellt, die anschließend in ein Transportmedium gegeben wurden, um sie in der Zellkultur<br />
auszutesten. Eine Probe wurde im IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test als positiv bewertet, wenn eine oder<br />
mehrere fluoreszierende Epithelzellen sichtbar waren (siehe Abschnitt 11.2). In der Zellkultur wurde eine<br />
Probe als positiv bewertet, wenn der charakteristische zytopathische Effekt durch die indirekte<br />
Immunfluoreszenz bestätigt wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 2 dargestellt. Von<br />
den 179 getesteten Proben wurde in 174 Fällen mit beiden Methoden ein übereinstimmendes Ergebnis<br />
erzielt, was einer Korrelation von 97,2 % entspricht. Empfindlichkeit und Spezifität des IMAGEN<br />
<strong>Adenovirus</strong>-Tests betrugen 91,4 % (32/35) bzw. 98,6 % (142/144). Die Vorhersagewerte für positive und<br />
negative Tests betrugen 94,1 % (32/34) bzw. 97,9 % (142/145).<br />
Tabelle 14.2 Vergleich der Testergebnisse von IMAGEN <strong>Adenovirus</strong> Test und Zellkultur -<br />
humane ophthalmische Proben<br />
TEST ERGEBNIS<br />
Zellkultur<br />
IMAGEN<strong>Adenovirus</strong><br />
Neg<br />
Neg<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Neg<br />
Anzahl der Proben (179) 142 32 3* 2**<br />
* Bei einer Probe konnte keine Wiederholung durchgeführt werden.<br />
** Beide Proben wurden nur 2 Tage kultiviert.<br />
14.2.2 Bestätigung der Zellkultur<br />
In drei Prüfzentren wurde der IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test an Zellkulturen klinischer Proben getestet. Die<br />
Ergebnisse wurden mit der indirekten Immunfluoreszenz und/oder Neutralisationstests zur<br />
Zellkulturbestätigung verglichen. Die Isolierungen wurden auf routinemäßig verwendeten Zelllinien zur<br />
<strong>Adenovirus</strong>-Zellkultur durchgeführt. Die Zellkulturen wurden in PBS gewaschen bevor sie entfernt und auf<br />
die Objektträger aufgebracht wurden. Die Objektträger wurden in Azeton fixiert und anschließend mit den<br />
Testreagenzien des IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Tests getestet. Zu dieser Bewertung wurden sowohl frisch<br />
isolierte als auch zuvor eingefrorene klinische Proben herangezogen. Insgesamt wurden 296 Kulturen<br />
ausgewertet. In der Zellkultur positiv ausgefallene Proben wurden entweder durch Immunfluoreszenz- oder<br />
Neutralisationstests bestätigt.<br />
Die Ergebnisse (Tabelle 14.3) zeigen, dass mit dem IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test alle positiven<br />
<strong>Adenovirus</strong>-Isolierungen mit einer Empfindlichkeit von 100 % (162/162) nachgewiesen wurden. Die<br />
Spezifizität betrug 100 % (134/134).<br />
Neg<br />
Pos<br />
Neg<br />
Pos<br />
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Tabelle 14.3 Vergleich der Testergebnisse von IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test und<br />
Standardverfahren<br />
- zur Zellkulturbestätigung in 3 Prüfzentren durchgeführt<br />
TEST ERGEBNIS<br />
Standardbestätigungsverfahren<br />
IMAGEN <strong>Adenovirus</strong><br />
Neg<br />
Neg<br />
Pos<br />
Pos<br />
Pos<br />
Neg<br />
Anzahl der Proben (296) 134 162 0 0<br />
14.3 KREUZREAKTIVITÄT<br />
Der IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test wurde an Präparationen anderer Viren und Mikroorganismen durchgeführt,<br />
die mit hoher Wahrscheinlichkeit in Atemwegs- oder ophthalmischen Proben oder Zellkulturen vorhanden<br />
sind. Alle getesteten Organismen (Tabelle 4) fielen mit dem IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test negativ aus.<br />
Tabelle 14.4 Mit dem IMAGEN <strong>Adenovirus</strong>-Test getestete und für nicht reaktiv befundene<br />
Organismen<br />
Acholeplasma laidlawii<br />
Branhamella catarrhalis<br />
Candida albicans<br />
Chlamydia psittaci<br />
Chlamydia trachomatis<br />
Coxsackie-Virus<br />
Zytomegalie-Virus<br />
Echovirus<br />
Epstein-Barr-Virus<br />
Haemophilus influenzae<br />
Herpes simplex-Virus<br />
Influenza-Virus A & B<br />
Legionella pneumophila<br />
Masernvirus<br />
Mumpsvirus<br />
Mycobacterium avium<br />
Mycobacterium intracellulare<br />
Mycobacterium tuberculosis<br />
Mycoplasma arginini<br />
Mycoplasma hominis<br />
Mycoplasma hyorhinus<br />
Mycoplasma orale<br />
Mycoplasma pneumoniae<br />
Mycoplasma salivarium<br />
Neisseria cinerea<br />
Neisseria flavescens<br />
Neisseria gonorrhoea<br />
Neisseria lactamica<br />
Neisseria meningitidis A, B, C & D<br />
Neisseria mucosa<br />
Neisseria perflava<br />
Neisseria pharyngis<br />
Parainfluenza-Virus, Typ 1,2,3 & 4b<br />
Pneumocystis carinii<br />
Poliovirus, Typ 1 & 2<br />
Respiratory Syncytial Virus<br />
Rhinovirus<br />
Staphylococcus aureus<br />
Streptococcus Gruppen A, B, C, D, F, G<br />
Varicella-Zoster-Virus<br />
Neg<br />
Pos<br />
35/37 K6100EFG
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