IMAGEN™ Adenovirus - Oxoid

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DakoCytomation Ltd
Denmark House
Angel Drove
Ely
Cambridgeshire, CB7 4ET
United Kingdom/Royaume Uni/Großbritannien
Telephone: +44 1353 669911
Fax: +44 1353 668989 IMAGEN
(105585-001)
Adenovirus
July 2003 9607044EFG
IMAGEN Adenovirus
50
K6100
A direct immunofluorescence test for the detection of
Adenovirus.
Test pour la détection de l’Adenovirus par
Immunofluorescence directe.
Direkter Immunfluoreszentest zum Nachweis von
Adenovirus.

1 INTENDED USE
The IMAGEN Adenovirus test is a qualitative direct immunofluorescence test for the detection of
adenovirus antigen in clinical specimens and the confirmation of adenovirus in cell cultures.
2 SUMMARY
Adenoviruses are non-enveloped DNA viruses of icosahedral symmetry. The family Adenoviridae comprise
2 genera, mammalian adenoviruses (Mastadenoviruses) and avian adenoviruses (Aviadenoviruses). 1 At
least 47 known serotypes of human adenovirus have been identified and characterised by
haemagglutination, neutralisation, DNA-hybridization and restriction endonuclease analysis of adenoviral
DNA. 1,2,3,4
Human adenoviruses are associated with a wide range of clinical disease in both immunocompetent and
immunocompromised individuals which include infections of the respiratory tract, conjunctiva and gastrointestinal
tract. 3,5 Infections are common in children and can occur sporadically or in outbreaks.
Approximately 5% of acute respiratory disease in children and 10% of febrile illnesses and childhood
pneumonias have been associated with adenovirus infection. 3,6,7
Adenovirus infections of the eye may lead to pharyngo-conjunctival fever, follicular conjunctivitis or
epidemic keratoconjunctivitis. 3,8
Adenovirus serotypes 40 and 41 are commonly associated with viral gastroenteritis in infants and are
reported to be responsible for 4-15% of nosocomial infections in paediatric wards. 3,9,10 In
immunocompromised patients (eg transplant or AIDS patients) severe systemic infections can occur which
can be life threatening. 3
The laboratory diagnosis of adenovirus infection plays an important role in patient management and
enables effective management and control of outbreaks. Diagnostic methods include direct detection of
virus or viral proteins in clinical specimens (eg nasopharyngeal aspirates), isolation of viable virus in cell
culture monolayers inoculated with respiratory, conjunctival or faecal specimens, and detection of
adenovirus specific immunoglobulins. 3,5
Isolation of adenoviruses from clinical specimens can be accomplished in continuous cell lines of mainly
epithelial origin including HeLa, HEp-2, KB and 293 cell lines, in which adenoviruses may exhibit
characteristic cytopathic effect. 3,5
A range of techniques have been used to confirm the identification of adenovirus isolates including
neutralisation tests, radioimmunoassay, DNA hybridisation, electron microscopy and DNA
electrophoretyping. 11,12,13,14,15 These techniques can be complex, laborious and often inappropriate for
routine use.
Recently indirect immunofluorescence tests or enzyme-immunoassays (eg IDEIA Adenovirus) using
genus specific monoclonal or polyclonal antibodies have been described for the direct detection of
adenovirus in clinical specimens or cell culture monolayers. 15,16,17
Direct immunofluorescence tests utilising specific monoclonal antibodies offer a rapid sensitive and specific
method for the direct detection of adenoviruses in clinical specimens such as nasopharyngeal aspirates and
conjunctival smears or for the confirmation of adenovirus isolates in cell culture monolayers.
IMAGEN Adenovirus is a direct immunofluorescence test for the detection and identification of human
adenovirus serotypes in clinical specimens or cell cultures. The test utilises a genus specific monoclonal
antibody to detect an epitope of adenovirus hexon proteins which is expressed in all known human
adenovirus serotypes. 18
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3 PRINCIPLE OF THE TEST
The IMAGEN Adenovirus test contains monoclonal antibody conjugated to fluorescein isothiocyanate
(FITC). The conjugated reagent binds specifically to an epitope common to the hexon protein found in all
serotypes of human adenovirus. The reagent is used in a one-step direct immunofluorescence technique.
Specimens are incubated with the FITC conjugated antibody reagent for 15 minutes, then excess reagent is
washed off with phosphate buffered saline (PBS). The stained areas are mounted and viewed
microscopically using epifluorescent illumination. If adenovirus is present, characteristic bright apple-green
fluorescence is seen within the cytoplasm and/or nucleus of infected cells, contrasting with the red
background staining of uninfected cells.
Acknowledgements
The monoclonal antibody used in this test was originated by the Division of Microbiological Reagents and
Quality Control, Central Public Health Laboratory, Colindale, London, United Kingdom.
4 DEFINITIONS
The following symbols and definitions are in accordance with ISO 15223 and EN 980 and have been used in
the product information.
N
Product code and catalogue number.
Consult the instructions for use.
Contains sufficient for tests.
Manufactured by.
In vitro diagnostic medical device.
Use by.
Batch Code.
Storage temperature limitations.
5 REAGENTS PROVIDED
50 - Each kit contains sufficient materials for 50 direct specimens or cell culture preparations. - The
shelf life of the kit is as indicated on the outer box label.
5.1 IMAGEN ADENOVIRUS REAGENT
One bottle of each of the following:
One Instructions for Use Booklet.
2 x 1 well positive control slide containing acetone-fixed human epithelial cells
(HEp-2) infected with adenovirus.
3mL of mounting fluid. The mounting fluid contains a photobleaching inhibitor in
a glycerol solution (pH 10.0).
1.4mL of IMAGEN Adenovirus reagent. The reagent contains purified murine
monoclonal antibody, specific to a common epitope on the adenovirus hexon
protein, conjugated to FITC. The conjugate is prepared in a protein stabilised
buffer solution (pH 7.5) containing evans blue dye as counterstain and
15mmol/L sodium azide as preservative.
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5.2 PREPARATION, STORAGE AND RE-USE OF KIT COMPONENTS
In order to ensure optimal kit performance it is important that unused kit components are stored according to
the following instructions:
5.3 POSITIVE CONTROL SLIDES -
Positive control slides are provided individually in sealed foil pouches filled with nitrogen. Store unused
slides at 2-8 °C. The slide should be left for 5 minutes at room temperature (15-30 °C) before opening.
Stain the slide immediately after opening.
5.4 MOUNTING FLUID -
Ready to use. Store mounting fluid at 2-8 °C. The mounting fluid should be left at room temperature (15-30
°C) for 5 minutes before use.
5.5 REAGENT -
Ready to use. Store unused reagent 2-8 °C. The reagent should be stored in the dark at 2-8 °C and left at
room temperature (15-30 °C) for 5 minutes before use.
6 ADDITIONAL REAGENTS
6.1 REAGENTS
Fresh acetone (for fixation).
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.5 for washing stained specimens and for specimen preparation.
6.2 ACCESSORIES
The following products are intended for use in conjunction with IMAGEN Adenovirus. Contact your local
DakoCytomation subsidiary or distributor for further information.
Teflon coated glass microscope slides with single 6mm diameter well (100 slides per box) available from
your local DakoCytomation subsidiary or distributor, (Code No. S6114).
Positive Control Slide (Code No. S6125).
7 EQUIPMENT
The following equipment is required:
Precision pipette and disposable tips to deliver 25µL.
Wash bath.
Coverslips suitable to cover 6mm diameter well.
Non-fluorescing immersion oil.
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Epifluorescence microscope with filter system for FITC (maximum excitation wavelength 490nm, mean
emission wavelength 520nm) and x200-x500 magnification.
Incubator at 37 °C.
Low speed centrifuge.
For Direct Specimens
Sterile swabs.
Mucus extractor (nasopharyngeal specimens only).
For Culture Confirmation
Sterile swabs, viral transport medium (VTM) and container suitable for collection, transportation and culture
of Adenoviruses.
Cell lines recommended for culture and isolation of Adenoviruses.
8 PRECAUTIONS
- For in vitro diagnostic use. Anyone performing an assay with this product must be trained in its use
and must be experienced in laboratory procedures.
8.1 SAFETY PRECAUTIONS
8.1.1 The IMAGEN Adenovirus reagent contains 15mmol/L sodium azide, which is a poison. Sodium
azide may react with copper and lead plumbing systems to form explosive metal azides. Always dispose of
materials containing azide by flushing with large quantities of water.
8.1.2 Adenovirus on the positive control slide has been shown to be non-infectious in cell culture, however,
the slide should be handled and disposed of as though potentially infectious.
8.1.3 Evans blue dye is present in the reagent. This may be carcinogenic and contact with the skin should
be avoided.
8.1.4 Care should be taken when using the mounting fluid as it may cause skin irritation. Skin should be
flushed with water if contact occurs.
8.1.5 Do not eat, drink, smoke, store or prepare foods, or apply cosmetics within the designated work area.
8.1.6 Do not pipette materials by mouth.
8.1.7 Wear disposable gloves while handling clinical specimens and infected cells, always wash hands after
working with infectious materials.
8.1.8 Dispose of all clinical specimens in accordance with local legislation.
8.1.9 Safety data sheet available for professional user on request.
8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS
8.2.1 Components must not be used after the expiry date printed on the labels. Do not mix or interchange
different batches/lots of reagents.
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8.2.2 The reagents are provided at fixed working concentrations. Test performance will be adversely
affected if the reagents are modified or stored under conditions other than those detailed in Section 5.
8.2.3 Prepare fresh Phosphate Buffered Saline (PBS) as required on the day of use.
8.2.4 Washing in PBS is necessary. Use of other wash solutions such as tap water or distilled water will
compromise test results.
8.2.5 Avoid microbial contamination of reagents.
8.2.6 The reagents must not be frozen.
9 COLLECTION AND PREPARATION OF SPEClMENS 19
The collection and preparation of specimens is of fundamental importance in the diagnosis of adenovirus by
direct immunofluorescence and cell culture methods. Specimens must be collected from the site of infection
during the time of peak viral shedding so that they contain as much infected material as possible and
prepared in such a way as to preserve either intact cells which are free from adherent mucus etc for direct
microscopy of specimens or the viability of viruses in specimens to be cultured.
9.1 CLINICAL SPECIMENS
9.1.1 Ophthalmic Specimens
Collection
Apply local anaesthetic to the eye, then expose upper and lower conjunctiva. Using a cotton or Dacron
tipped swab vigorously wipe both upper and lower conjunctival surfaces, rotating the swab during the
sampling process to ensure that the entire conjunctival surface is sampled.
Preparation of Slides
Roll the specimen swab, using slight pressure, within the 6mm well area on the microscope slide. Ensure
that the whole swab tip is used to prepare the slide. Allow the specimen to air dry thoroughly at room
temperature (15-30 °C) and then fix in fresh acetone for 10 minutes. Allow the slide to air dry. If the
specimen is not stained immediately store at 4 °C overnight.
9.1.2 Nasopharyngeal aspirates/secretions
Collection
Collect specimens from the nasopharyngeal region into a mucus extractor through a size 8 feeding tube.
The mucus extractor and tubing should be maintained at 2-8 °C and sent to the laboratory as soon as
possible for processing.
Cell Separation
If necessary add 2mL phosphate buffered saline (PBS) to the sample prior to centrifugation to reduce the
viscosity and dilute the mucus. Centrifuge the mucus extractor at room temperature (15-30 °C) for 10
minutes at 380g. Remove the supernatant which can be used for cell culture. Resuspend the cell deposit in
2mL PBS and gently pipette the cells up and down with a wide bore pipette, or vortex gently, until the
mucus is broken up and cellular material released. Avoid vigorous pipetting/vortexing to prevent damage to
the cells. When a smooth suspension has been obtained add further PBS as required, pipetting or vortexing
after addition of the extra PBS to wash the cells further. Remove and discard any visible flecks of mucus
remaining at this point. Excess mucus must be removed as it will prevent adequate penetration of the
reagent and may result in non-specific fluorescence.
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If all secretions remain in the feeding tube and none reach the mucus extractor, wash all secretions out of
the tube into PBS. This is best achieved by inserting a pasteur pipette into the end of the tube which was
attached to the mucus extractor. Suck up the appropriate fluid into the tube and expel it repeatedly until the
secretions adhering to the wall of the tube have been dislodged. Pipette the suspension up and down until
the mucus has been adequately broken up.
Preparation of Slides
After completing the cell separation process, centrifuge the resultant cell suspension at room temperature
(15-30 °C) for 10 minutes at 380g and discard the supernatant. Resuspend the cell deposit in sufficient PBS
to dilute any remaining mucus, while at the same time maintaining a high cell density. Place 25µL of the
resuspended cell deposit into the well area on the slide. Allow the specimen to air dry thoroughly at room
temperature (15-30 °C) and fix in fresh acetone at room temperature (15-30 °C) for 10 minutes. If the
specimen is not stained immediately store at 4 °C overnight or freeze at –20 °C for longer storage periods.
9.2 CELL CULTURE
Inoculation of Cell Cultures
Specimens collected for the diagnosis of adenovirus infections should be inoculated into the cell lines
routinely used in the laboratory according to established laboratory methods. Cell cultures should be
examined regularly for the appearance of cytopathic effect (CPE) and haemadsorption tests carried out at
regular intervals. Any haemadsorption positive cultures or cell cultures showing CPE, can be harvested
and tested for the presence of Adenovirus.
Preparation of Slides
If a haemadsorption or CPE consistent with adenovirus infection is observed then the cell culture monolayer
should be harvested when at least 50% of the cells are affected.
Scrape the cell sheet into the liquid culture medium using a sterile pipette. Deposit the cells by Centrifuge at
200g for 10 minutes at room temperature (15-30 °C) and remove the supernatant.
Wash the cells by resuspending the cell deposit in PBS (see Section 8.2) and repeat the centrifugation.
Remove the supernatant and resuspend the cell deposit in a small volume of fresh PBS to maintain a high
cell density.
Place 25µL aliquots of the cell suspension on to individuals wells on the slides. Allow to air dry thoroughly
and fix in fresh acetone at room temperature (15-30 °C) for 10 minutes. If the specimen is not stained
immediately store at 4 °C overnight or freeze at –20 °C for longer storage periods.
10 TEST PROCEDURE
PLEASE REFER TO SECTION 8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS BEFORE PERFORMING TEST
PROCEDURE.
10.1 ADDITION OF REAGENT
Add 25µL of Reagent to each 6mm well. Ensure that the reagent covers the entire well area.
10.2 FIRST INCUBATION
Incubate the slides with reagent in a moist chamber for 15 minutes at 37 °C. Do not allow the reagent to
dry on the specimen, as this will cause the appearance of non-specific staining.
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10.3 WASHING THE SLIDE
Wash off excess reagent with Phosphate Buffered Saline (PBS) then gently wash the slide in an agitating
bath containing PBS for 5 minutes. Drain off PBS and allow the slide to air dry at room temperature (15-30
°C).
10.4 ADDITION OF MOUNTING FLUID
Add one drop of IMAGEN Adenovirus mounting fluid to the centre of each well and place a coverslip over
the mounting fluid and specimen ensuring that no air bubbles are trapped.
10.5 READING THE SLIDE
Examine the entire well area containing the stained specimen using an epifluorescence microscope.
Fluorescence, as described in Section 11, should be visible at x200-x500 magnification. (For best results
slides should be examined immediately after staining, but may be stored at 2-8 °C, in the dark, for up to 24
hours).
11 INTERPRETATION OF TEST RESULTS
11.1 CONTROLS
11.1.1 Positive Control Slide
When stained and viewed as described in Section 10, the positive control slide should show cells with
intracellular nuclear and/or cytoplasmic apple-green fluorescence contrasting against a background of red
counterstained material. These cells are slightly larger than respiratory or conjunctival epithelial cells but
show similar intracellular, nuclear and/or cytoplasmic fluorescence when infected with adenovirus. Positive
control slides should be used to check that the staining procedure has been satisfactorily performed.
11.1.2 Negative Control
If a negative control is required, uninfected intact cells of the type used for the culture and isolation of
adenovirus are recommended. The cells should be prepared and fixed as described in Section 9.2 and
stained as described in Section 10.
11.2 CLINICAL SPECIMENS
11.2.1 Appearance of Adenovirus Infected Cells
Intracellular, nuclear and/or cytoplasmic granular apple-green fluorescence is seen in respiratory or
conjunctival epithelial cells infected with adenovirus.
Uninfected cells stain red with the evans blue counterstain.
11.2.2 Interpretation of Results
A positive diagnosis is made when one or more cells in the fixed, stained specimen show the typical
fluorescence pattern described in Section 11.2.1.
A negative diagnosis is made when fixed, stained specimens do not exhibit fluorescence with the reagent.
For directly stained nasopharyngeal aspirate or ophthalmic specimens, at least 20 uninfected respiratory or
conjunctival epithelial cells must be observed before a negative result is reported. See Section 11.2.3 if
insufficient cells are present.
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11.2.3 Insufficient Cells
If insufficient cells are present on the slide, the remainder of the clinical specimen should be centrifuged at
380g for 10 minutes at room temperature (15-30 °C). Resuspend the cells in a smaller volume of PBS
before re-distribution (25µL) on the well area. Alternatively, a repeat clinical specimen should be requested.
11.3 CELL CULTURE CONFIRMATION
11.3.1 Appearance of Adenovirus Infected Cells
Infected cells will demonstrate intracellular, nuclear and/or cytoplasmic apple-green fluorescence and
should be recorded as positive for Adenovirus.
Uninfected cells will be counterstained red, with the evans blue counterstain.
11.3.2 Interpretation of Results
A positive diagnosis is made when at least one fixed, stained cell shows the fluorescence pattern described
in Section 11.3.1 after staining.
At least 50 uninfected cells of the cell culture being tested must be observed in the slide well before a
negative result is reported. See Section 11.3.3. if insufficient cells are present.
11.3.3 Insufficient Cells
If insufficient cells are present in the slide preparation, the remainder of the cell culture specimen should be
centrifuged at 200g for 10 minutes at room temperature (15-30 °C). Resuspended in a smaller volume of
PBS before re-distribution (25µL) on the well area.
Alternatively, a repeat specimen should be re-inoculated on to fresh cell monolayers and the cell culture
repeated.
12 PERFORMANCE LIMITATIONS
12.1 Use only the mounting fluid provided with the IMAGEN Adenovirus test.
12.2 The visual appearance of the fluorescence image obtained may vary due to the type of microscope
and light source used.
12.3 It is recommended that 25µL of reagent is used to cover a 6mm diameter well area. A reduction in this
volume may lead to difficulties in covering the specimen area and may reduce sensitivity.
12.4 All reagents are provided at fixed working concentrations. Test performance may be affected if the
reagents are modified in any way or not stored under recommended conditions as outlined in Section 5.
12.5 Failure to detect adenovirus may be a result of factors such as inappropriate collection, improper
sampling and/or handling of specimen, failure of cell culture etc. A negative result does not exclude the
possibility of adenovirus infection.
12.6 The presence of adenovirus in nasopharyngeal secretions does not necessarily exclude the possibility
of concomitant infection with other pathogens. All positive results must be interpreted with caution since
adenovirus is capable of latency and recrudescence. Asymptomatic shedding may occur up to 18 months
after infection. 20 Test results should be interpreted in conjunction with information available from
epidemiological studies, clinical diagnosis of the patient and other diagnostic procedures.
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12.7 Test results should be interpreted in conjunction with information available from epidemiological studies,
clinical assessment of the patient and other diagnostic procedures.
13 EXPECTED VALUES
Members of different adenovirus subgenera show distinctly different organ tropisms. However, illnesses are
primarily manifested as respiratory, ocular and enteric infections. The positive isolation rate will vary,
depending on the test employed, the adequacy of the specimen collection, age of the population being
tested and whether the populations studied are subject to overcrowding.
Isolation frequency is influenced by the severity of virus-associated diseases and also by the tendency of
virus strains to cause persistent infections with shedding of infectious virus over extended periods.
Adenoviruses are responsible for 5% of the acute respiratory infections in children under 4 years of age and
they account for 10% of the hospitalised respiratory infections in this age group. 3,6,7 Acute haemorrhagic
cystitis in children may be caused by adenoviruses. Enteric adenoviruses have been implicated in 4% to
15% of all hospitalised children with viral gastroenteritis and are most prevalent in children under 3 years of
age. 3,11,12
Ocular infections with adenoviruses (epidemic keratoconjunctivitis and swimming pool conjunctivitis) may
occur in any age group as may adenovirus infection in immunosuppressed patients. 3,8
In adults, adenoviruses have been isolated from the cervix and penile lesions and from acute respiratory
infection, especially in military personnel.
14 SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
14.1 SPECIFICITY OF THE MONOCLONAL ANTIBODY WITH ADENOVIRUS SEROTYPES
The monoclonal antibody utilised in this test has been shown to react with a genus specific epitope of
adenovirus hexon protein which is present in all human serotypes.
14.2 CLINICAL STUDIES
The IMAGEN Adenovirus test was evaluated for direct use at two clinical trial centres on nasopharyngeal
secretions collected from children and adults hospitalised with symptoms of respiratory infection. The test
was also evaluated at a leading ophthalmic centre on conjunctival specimens from patients presenting with
conjunctivitis. Three trial centres evaluated the IMAGEN Adenovirus test for the detection of adenovirus in
cell culture.
The trial centres tested 474 clinical respiratory specimens and 179 conjunctival specimens directly, plus 296
specimens for culture confirmation. The standard tests for direct specimens were cell culture with or
without indirect immunofluorescence and for culture confirmation the standard tests were indirect polyclonal
antibody fluorescence or specific neutralisation.
All calculations assume that the standard tests were 100% sensitive and specific. Sensitivity, specificity and
predictive values were calculated as previously described. 21
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14.3 CLINICAL PERFORMANCE
14.3.1 Direct Specimens
Nasopharyngeal Secretions
Fresh clinical specimens were tested during the winter of 1988/89 and stored (frozen) specimens which had
been collected between 1978 and 1988 were also tested. The two centres compared IMAGEN
Adenovirus test with reference methods. A result by the reference method was considered positive if either
the cell culture or indirect immunofluorescence was positive. This allowed for the presence of non-viable
virus to be detected by fluorescence or cell-free virus to be detected by cell culture. A specimen was scored
positive in the IMAGEN Adenovirus test when one or more fluorescing epithelial cells were seen (see
Section 11.2).
Table 14.1 shows the results of the IMAGEN Adenovirus test reagent. The overall incidence of
adenovirus in these populations was 9.1% (43/474). The results correlated with the standard tests in 468
cases (98.7%). The IMAGEN Adenovirus test sensitivity was 86.0% (37/43) and specificity was 100%
(431/431). The predictive values for positive and negative results were 100% (37/37) and 98.6% (431/437)
respectively.
Table 14.1 Comparison of test results by the IMAGEN Adenovirus test and cell culture on
nasopharyngeal specimens at 2 trial centres
TEST RESULT
Reference method
IMAGEN Adenovirus
Neg
Neg
No. of Specimens (474) 431 37 6* 0
*1) 4/6 specimens took greater than 10 days to produce CPE in culture. This may indicate a very low
level of virus initially present in the sample.
2) 2/6 specimens were negative by indirect IF.
Ophthalmic Specimens
The IMAGEN Adenovirus test was evaluated against an established cell culture system. Conjunctival
swabs were collected from 179 patients with conjunctivitis attending an eye hospital. The incidence of
adenovirus infection in the population group studied was 19.6% (35/179). Smears were prepared from
specimen swabs at the clinic and the swabs were then placed in a transport medium for cell culture
evaluation. A specimen was scored positive in the IMAGEN Adenovirus test when one or more
fluorescing epithelial cells were observed (see Section 11.2). A specimen was scored positive in the cell
culture test when characteristic cytopathic effect was confirmed by indirect immunofluorescence. The
results from this trial are shown in Table 14.2. Of 179 specimens tested, the same result was obtained by
both methods in 174 specimens after repeat testing, giving a correlation of 97.2%. The sensitivity and
specificity of the IMAGEN Adenovirus test was 91.4% (32/35) and 98.6% (142/144) respectively. The
predictive values for positive and negative tests were 94.1% (32/34) and 97.9% (142/145) respectively.
Table 14.2 Comparison of test results by the IMAGEN Adenovirus test and cell culture on
human ophthalmic specimens
TEST RESULT
Reference method
IMAGEN Adenovirus
Neg
Neg
No. of Specimens (179) 142 32 3* 2**
* Insufficient material available for retesting of one specimen.
** Both specimens were cultured for only 2 days.
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Neg
Pos
Neg
Neg
Pos
Neg
Pos
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14.3.2 Cell Culture Confirmation
Three trial centres tested the IMAGEN Adenovirus test on cell cultures from clinical specimens. This was
compared against indirect immunofluorescence and/or neutralisation tests for culture confirmation.
Isolations were made in routine cell lines used for adenovirus culture. Cell cultures were washed in PBS
before being removed and spotted on to slides. The slides were fixed in acetone and then tested using the
IMAGEN Adenovirus test reagents. Both fresh clinical isolates and previously frozen specimens were
used for this evaluation. A total of 296 cultures were evaluated. Cell culture positive isolates were confirmed
by either immunofluorescence or neutralisation tests.
The results (Table 14.3) indicate that the IMAGEN Adenovirus test detected all positive adenovirus
isolates giving a sensitivity of 100% (162/162). The specificity of the reagent was 100% (134/134).
Table 14.3 Comparison of test results by the IMAGEN Adenovirus test and standard methods
for culture confirmation at 3 trial centres
TEST RESULT
Standard confirmation
IMAGEN Adenovirus
Neg
Neg
No. of Specimens (296) 134 162 0 0
14.4 CROSS-REACTIVITY
The IMAGEN Adenovirus test was performed against preparations of other viruses and organisms likely
to be present in respiratory or ophthalmic specimens or cell cultures. All organisms tested (Table 14.4) were
negative with the IMAGEN Adenovirus test.
Pos
Pos
Pos
Neg
Table 14.4 Organisms tested in the IMAGEN Adenovirus test and found to be non-reactive
Acholeplasma laidlawii
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Coxsackie virus
Cytomegalovirus
Echovirus
Epstein-Barr virus
Haemophilus influenzae
Herpes simplex virus
Influenza virus A & B
Legionella pneumophila
Measles virus
Mumps virus
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinus
Mycoplasma orale
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Neisseria cinerea
Neisseria flavescens
Neisseria gonorrhoea
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis A, B, C & D
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Neisseria pharyngis
Parainfluenza virus types 1,2,3 & 4b
Pneumocystis carinii
Polio virus types 1 & 2
Respiratory syncytial virus
Rhinovirus
Staphylococcus aureus
Streptococcus gps A,B,C,D,F,G
Varicella zoster virus
Neg
Pos
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1 INTERET
Le test IMAGEN Adénovirus est un test qualitatif d'immunofluorescence directe pour la détection de
l'antigène des adénovirus dans des échantillons cliniques et la confirmation de la présence d'un adénovirus
dans les cultures cellulaires.
2 RESUME
Les adénovirus sont des virus à ADN dépourvus d'enveloppe et à symétrie cubique. La famille des
Adénovirus se compose de 2 genres, à savoir les adénovirus mammifères (Mastadénovirus) et les
adénovirus aviaires (Aviadénovirus). 1 On a identifié et caractérisé au moins 47 sérotypes connus
d'adénovirus humains par hémagglutination, neutralisation, hybridation d'ADN et par l'utilisation d'enzymes
de restriction. 1,2,3,4
Les adénovirus humains sont responsables d'un certain nombre de maladies, tant chez les sujets
immunocompétents qu'immunodéficients, parmi lesquelles on compte, entre autres, des infections des
voies respiratoires, conjonctives et gastro-intestinales. 3,5 Ces infections sont fréquentes chez les enfants et
se manifestent sporadiquement ou sous forme d'épidémies.
Environ 5 % des maladies respiratoires graves qui affectent les enfants et 10 % des maladies fébriles et
pneumonies infantiles sont liées à des infections 'adénovirales. 3,6,7
Les infections oculaires adénovirales peuvent engendrer une fièvre pharyngo-conjonctivale, une
conjonctivite folliculaire ou encore une kératoconjonctivite épidémique. 3,8
Les sérotypes d'adénovirus 40 et 41 sont généralement responsables de gastro-entérites virales chez les
nouveau-nés et sont également considérés comme responsables de 4 à 15 % des infections nosocomiales
survenant dans les services pédiatriques 3,9,10 Chez les patients immunodéficients (par exemple, les
patients sidéens ou ayant subi une transplantation), des infections systémiques graves peuvent se
manifester et mettre la vie en danger. 3
Le diagnostic d’une infection adénovirale joue un rôle important au niveau du traitement du patient et
permet de combattre et de contrôler efficacement les épidémies. Parmi les méthodes de diagnostic, on
compte la détection directe du virus ou des protéines virales dans des échantillons cliniques (par exemple,
des aspirations nasopharyngiennes), l'isolement du virus viable dans des monocouches de culture cellulaire
inoculées au moyen d'échantillons respiratoires, conjonctifs ou fécaux, ainsi que la détection des
immunoglobulines spécifiques de l'adénovirus. 3,5
L'isolement des adénovirus dans des échantillons cliniques peut se réaliser dans des lignées continues de
cellules, d'origine principalement épithéliale, telles que les lignées de cellules HeLa, HEp-2, KB et 293,
dans lesquelles les adénovirus peuvent développer un effet cytopathogène caractéristique. 3,5
De nombreuses techniques sont utilisées pour confirmer l'identification des adénovirus isolés, et
notamment des tests de neutralisation, dosages radio-immunologiques, hybridation d'ADN, microscopie
électronique et détermination électrophorétique de l'ADN. 11, 12,13,14,15 Ces techniques peuvent être
complexes, laborieuses et souvent impropres à une utilisation quotidienne.
Les tests d'immunofluorescence directe ou tests immunoenzymatiques (ex : IDEIA Adénovirus) utilisant
des anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques du genre ont été récemment décrits pour la
détection directe d'adénovirus dans des échantillons cliniques ou monocouches de culture cellulaire. 15,16,17
Les tests d'immunofluorescence directe utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques constituent une
méthode sensible, spécifique et rapide pour détecter les adénovirus dans des échantillons cliniques, tels
que les aspirations nasopharyngiennes et les frottis conjonctifs, ou pour confirmer la présence d'adénovirus
isolés dans des monocouches de culture cellulaire.
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Le test IMAGEN Adénovirus est un test d'immunofluorescence directe conçu pour détecter et identifier les
sérotypes d'adénovirus humains dans des échantillons cliniques ou cultures cellulaires. Ce test utilise un
anticorps monoclonal spécifique du genre pour détecter un épitope de protéines hexon d'adénovirus
présent sur tous les sérotypes d'adénovirus humains connus. 18
3 PRINCIPE DU TEST
Le test IMAGEN Adénovirus contient un anticorps monoclonal conjugué à l'isothiocyanate de fluorescéine
(FITC). Le réactif conjugué se lie de façon spécifique à un épitope commun à la protéine hexon présente
sur tous les sérotypes d'adénovirus humains. Le réactif est utilisé dans le cadre d'une technique
d'immunofluorescence directe en une étape. Les échantillons sont incubés avec l'anticorps conjugué au
FITC pendant 15 minutes. L'excès de réactif est ensuite éliminé par lavage à l'aide d'une solution saline
tamponnée (PBS). L'observation s'effectue après montage entre lame et lamelle au microscope, sous un
éclairage épifluorescent. Si un 'adénovirus est présent, il est signalé par une fluorescence caractéristique
vert pomme vif, qui apparaît à l'intérieur du cytoplasme et/ou du noyau des cellules contaminées, et qui
contraste avec la coloration rouge des cellules non infectées.
Déclaration
L'anticorps monoclonal utilisé dans ce test a été produit par la Division of Microbiological Reagents and
Quality Control, Central Public Health Laboratory, Colindale, London, Royaume-Uni.
4 DEFINITIONS
Les définitions et symboles suivants sont conformes aux normes ISO 15223 et EN 980 et sont utilisés dans la
notice du produit.
N
Code du produit et référence du catalogue.
Consulter les instructions d’utilisation.
Contenu suffisant pour tests.
Fabricant.
Dispositif médical de diagnostic in vitro.
Utiliser jusque.
Code du lot
Limite de température de stockage.
5 REACTIFS FOURNIS
50 - Chaque kit contient suffisamment de réactifs pour traiter 50 échantillons ou 50 préparations de
culture cellulaire. - La date de péremption du kit est indiquée sur l'étiquette extérieure de la boîte.
5.1 REACTIF IMAGEN ADENOVIRUS
Un flacon de :
Un fascicule d’ Instructions.
2 lames de contrôle positif à 1 puits contenant des cellules épithéliales humaines
(HEp-2), fixées à l'acétone, contaminées par l'adénovirus.
3mL de liquide de montage. Le liquide de montage contient un agent inhibant
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photodécolorant dans une solution de glycérol (pH10.0).
1,4mL de réactif pour test IMAGEN Adénovirus. Le réactif est un anticorps
murin monoclonal purifié, spécifique d'un épitope commun à la protéine hexon
d'adénovirus, conjugué au FITC. Le conjugué est préparé dans une solution
tampon protéinique stabilisée (pH7.5) contenant du colorant bleu d’Evans
comme contre-colorant et 15 mmol/L d’azide de sodium comme conservateur.
5.2 PREPARATION, STOCKAGE ET REUTILISATION DES COMPOSANTS DU KIT
Pour assurer des performances optimales du kit, il est important de stocker les composants non utilisés
conformément aux instructions suivantes :
5.3 LAMES DE CONTROLE POSITIF -
Les lames sont fournies séparément enveloppées dans des pochettes aluminium scellées et remplies
d’azote. Les lames non utilisées doivent être stockées entre 2 et 8 °C. . La pochette contenant la lame à
utiliser doit rester à température ambiante (15 à 30 °C) pendant 5 minutes avant de l’ouvrir.
Colorez la lame immédiatement après ouverture.
5.4 LIQUIDE DE MONTAGE -
Prêt à l’usage. Conserver entre 2 et 8 °C . Le flacon de liquide de montage doit rester à température
ambiante (15-30 °C) pendant 5 minutes avant de l’ouvrir.
5.5 REACTIF -
Prêt à l’usage. Conserver le réactif non utilisé entre 2 et 8 °C. Le réactif doit être conservé à l'abri de la
lumière, entre 2 et 8 °C et le flacon doit rester à température ambiante (15-30 °C) au moins 5 minutes avant
de l’ouvrir.
6 REACTIFS NON FOURNIS
6.1 REACTIFS
Acétone frais (pour la fixation).
Solution saline tamponnée (PBS), pH 7,5, pour le lavage des échantillons marqués et la préparation des
échantillons.
6.2 ACCESSOIRES
Les produits suivants sont destinés à être utilisés conjointement au test IMAGEN Adenovirus. Pour tous
renseignements supplémentaires, veuillez vous adresser à votre filiale distributeur DakoCytomation.
Lames pour microscope recouvertes de téflon avec un seul puits de 6mm de diamètre (100 lames par
boîte), disponibles auprès de votre filiale ou de votre distributeur DakoCytomation, (Code S6114).
Lame de contrôle positif (Code S6125).
7 MATERIEL
Le matériel suivant est nécessaire :
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Pipette de précision et embouts jetables pour des quantités de 25µL.
Bain de lavage.
Lamelles adaptées à un puits de 6mm de diamètre.
Huile d'immersion non fluorescente.
Microscope épifluorescent avec système de filtre pour FITC (longueur d'onde d'excitation maximale 490
nm, longueur d'onde d'émission moyenne 520 nm) et objectif x 200-x500.
Incubateur à 37 °C.
Centrifugeuse à vitesse réduite.
Pour échantillons directs
Ecouvillons stériles.
Extracteur de mucosités (échantillons nasopharyngiens uniquement).
Pour confirmation de culture
Ecouvillons stériles et milieu de transport viral (VTM) et récipient adapté au prélèvement, au transport et à
la culture des adénovirus.
Lignées de cultures cellulaires recommandées pour la culture et l'isolement des adénovirus.
8 PRECAUTIONS
- Pour diagnostic in vitro. L’utilisateur doit maîtriser les procédures générales de laboratoire et être
spécifiquement formé à I’emploi de ce test.
8.1 MESURES DE SECURITE
8.1.1 Le réactif IMAGEN Adénovirus contient 15mmol/L d'azide de sodium, un agent chimique
extrêmement toxique susceptible de réagir avec les parties en cuivre ou en plomb des tuyauteries pour
former des azides métalliques extrêmement explosifs. Au moment de jeter les solutions contenant de
l'azide de sodium, rincer abondamment à l'eau.
8.1.2 L'adénovirus sur la lame de contrôle positif s'est révélé non infectieux lors de la culture cellulaire.
Toutefois, la lame doit être manipulée et mise au rebut comme si elle était potentiellement infectieuse.
8.1.3 Le réactif contient du bleu d’Evans. Cette substance pouvant être cancérigène, éviter tout contact
avec la peau.
8.1.4 Le liquide de montage doit être utilisé avec précautions, car il peut provoquer des irritations
cutanées. En cas de contact avec la peau, rincer abondamment à l'eau.
8.1.5 Ne pas manger, boire, fumer, conserver ou préparer de la nourriture, ni se maquiller sur les lieux
d'utilisation.
8.1.6 Ne pas pipeter les substances à la bouche.
8.1.7 Porter des gants jetables pour manipuler les échantillons cliniques et les cellules infectées et toujours
se laver les mains après avoir travaillé avec des substances infectieuses.
8.1.8 L'élimination de tous les échantillons cliniques doit avoir lieu conformément à la législation en
vigueur.
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8.1.9 Une fiche de sécurité destinée aux professionnels est disponible sur demande.
8.2 PRECAUTIONS TECHNIQUES
8.2.1 Ne pas utiliser les composants après la date de péremption indiquée sur les étiquettes. Ne pas
mélanger ou échanger différents lots de réactifs.
8.2.2 Les réactifs sont fournis prêts à l'emploi, à des concentrations prédéterminées. Les performances
pourraient être affectées en cas modification ou de non respect des conditions de conservation décrites
dans la Section 5.
8.2.3 Préparer le volume de PBS nécessaire le jour le l’utilisation .
8.2.4 Le lavage doit être obligatoirement effectué dans la PBS. L’utilisation de toute autre solution de
lavage telle que de l’eau du robinet ou distillée compromet les résultats du test.
8.2.5 Eviter la contamination microbienne des réactifs.
8.2.6 Les réactifs ne doivent pas être congelés.
9 PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS 19
Le prélèvement et la préparation des échantillons sont prépondérants dans le cadre du diagnostic des
adénovirus selon les méthodes d'immunofluorescence directe et de culture cellulaire. Les échantillons
doivent être collectés sur le site de l'infection, en période d’excrétion virale maximale, de façon à contenir le
plus de matériau infecté possible, et être préparés de manière à garder intactes soit les cellules qui sont
débarrassées de mucosités adhérentes etc… pour observer les échantillons directement au microscope,
out la viabilité des virus dans les échantillons destinés à une culture cellulaire.
9.1 ECHANTILLONS CLINIQUES
9.1.1 Echantillons ophtalmiques
Prélèvement
Effectuer une anesthésie locale de l'oeil, puis dégager les conjonctives supérieures et inférieures. A l'aide
d'une sonde à embout recouvert de coton ou de Dacron, balayer vigoureusement les conjonctives
supérieures et inférieures, en faisant pivoter la sonde au cours du prélèvement, afin de prélever sur toute la
surface de la conjonctive.
Préparation des lames
Déposer l'échantillon prélevé, en appuyant légèrement, à l'intérieur du puits de 6mm de diamètre d'une
lame pour microscope. Faire attention de bien utiliser le bout de la sonde tout entier pour préparer la lame.
Laisser sécher l'échantillon complètement, à l'air libre, à température ambiante (15-30 °C), puis fixer dans
de l'acétone frais pendant 10 minutes. Laissez sécher la lame à l’air libre. S'il l'échantillon n’est pas marqué
immédiatement, le conserver à 4 °C pendant la nuit
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9.1.2 Aspirations/secrétions nasopharyngiennes
Prélèvement
Prélever les secrétions dans la zone nasopharyngienne, dans un extracteur de mucosités, à l'aide d'un tube
d'alimentation de dimension 8. L'extracteur de mucosités et le tube doivent être maintenus entre 2 et 8 °C
et envoyés au laboratoire aussitôt que possible pour traitement.
Séparation des cellules
Le cas échéant, ajouter à l'échantillon 2mL de solution saline tamponnée (PBS) avant la centrifugation, de
manière à réduire la viscosité et à diluer les mucosités. Centrifuger l'extracteur de mucus à température
ambiante (15-30 °C) pendant 10 minutes à 380g. Eliminer le liquide surnageant, qui peut servir pour la
culture cellulaire. Remettre le dépôt cellulaire en suspension dans 2mL de PBS et pipeter doucement les
cellules de haut en bas, à l'aide d'une pipette de large diamètre, ou agiter légèrement à l'aide du vortex,
jusqu'à ce que le mucus se dissolve et libère la substance cellulaire. Eviter de pipéter/agiter au vortex
vigoureusement, afin de ne pas endommager les cellules. Dès qu'une suspension uniforme est obtenue,
ajouter, si nécessaire, un peu de PBS, et pipeter ou agiter au vortex après addition éventuelle de PBS, afin
de laver les cellules. Eliminer et jeter toutes les particules de mucus restantes à ce stade. L'excès de
mucus doit être éliminé car il risque d'empêcher la pénétration adéquate du réactif, produisant ainsi une
fluorescence non-spécifique.
Si toutes les secrétions restent dans le tube d'alimentation et n'atteignent pas l'extracteur de mucosités,
évacuer les secrétions du tube par lavage et les verser dans du PBS. Pour ce faire, insérer une pipette
pasteur dans l'extrémité du tube attachée à l'extracteur de mucus. Aspirer le liquide adéquat dans le tube et
l'expulser plusieurs fois jusqu'à ce que les secrétions adhérant aux parois du tube soient délogées. Pipéter
la suspension qui en résulte de haut en bas jusqu'à dissolution adéquate du mucus.
Préparation des lames
Une fois le processus de séparation des cellules terminé, centrifuger la suspension cellulaire ainsi obtenue
à température ambiante (15-30 °C) pendant 10 minutes à 380g et éliminer le liquide surnageant. Remettre
le dépôt de cellules en suspension dans une quantité suffisante de PBS, afin de diluer le mucus restant,
tout en maintenant une importante densité cellulaire. Mettre 25µL de dépôt cellulaire remis en suspension
dans le puits, sur une lame. Laisser sécher complètement l'échantillon à l'air libre et à température
ambiante (15-30 °C) et le fixer à l'acétone frais, à température ambiante également (15-30 °C), pendant 10
minutes. S'il l'échantillon n’est pas marqué immédiatement, le conserver à 4 °C pendant la nuit ou le
congeler à –20 °C pour des périodes plus longues.
9.2 CULTURE CELLULAIRE
Inoculation des cultures cellulaires
Les échantillons prélevés en vue du diagnostic d'infections adénovirales doivent être inoculés dans les
lignées cellulaires habituellement utilisées par le laboratoire en fonction des méthodes établies. Les
cultures cellulaires doivent être examinées régulièrement pour vérifier l’aspect du CPE et des tests
d’hémadsorption doivent être effectués à intervalles réguliers. Toute culture positive à l’hémadsorption ou
culture cellulaire indiquant un CPE, peut être collectée et testée pour la présence de l’adénovirus.
Préparation des lames
Si une hémadsorption ou un CPE typique d’ une infection adénovirale apparaît, récolter la monocouche de
culture cellulaire lorsqu'au moins 50 % des cellules sont affectées.
Décoller la lignée de cellules et la placer dans le milieu de culture liquide à l'aide d'une pipette stérile.
Former un culot de cellules par centrifugation à 200g, pendant 10 minutes, à température ambiante (15-30
°C) et éliminer le surnageant.
Laver les cellules en remettant le dépôt cellulaire en suspension dans la solution saline tamponnée (PBS -
voir Section 8.2) et répéter la centrifugation. Eliminer le surnageant et remettre le dépôt cellulaire en
suspension dans un petit volume de PBS frais afin de maintenir une densité cellulaire élevée.
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Mettre des aliquotes de 25µL de suspension cellulaire dans les chaque puits des lames. Laisser sécher
complètement à l'air libre et fixer dans de l'acétone frais, à température ambiante (15-30 °C), pendant 10
minutes. S'il l'échantillon n’est pas marqué immédiatement, le conserver à 4 °C pendant la nuit, ou le
congeler à –20 °C pour des périodes plus longues.
10 MODE OPERATOIRE
VEUILLEZ CONSULTER LA SECTION 8.2, PRÉCAUTIONS TECHNIQUES, AVANT DE RÉALISER LE
TEST.
10.1 ADDITION DE REACTIF
Ajouter 25µL de réactif dans chaque puits de 6 mm. . Vérifier si le réactif couvre toute la surface du puits.
10.2 PREMIERE INCUBATION
Incuber les lames avec le réactif pendant 15 minutes à 37 °C, dans une chambre humide. Ne pas laisser
sécher le réactif sur l'échantillon, car cela provoquerait l'apparition d'un marquage non-spécifique.
10.3 LAVAGE DE LA LAME
Eliminer l'excès de réactif par lavage avec la solution saline (PBS), et laver la lame avec précaution dans
un bain à agitation contenant du PBS, pendant 5 minutes. Laisser égoutter le PBS et laisser sécher la lame
à l'air libre et à température ambiante (15-30 °C).
10.4 ADDITION DE LIQUIDE DE MONTAGE
Ajouter une goutte de liquide de montage IMAGEN Adénovirus au centre de chaque puits et placer une
lamelle, en évitant la formation de bulles d'air sous la lamelle.
10.5 LECTURE DE LA LAME
Examiner le puits contenant l'échantillon coloré dans son ensemble, en utilisant un microscope à
épifluorescence. Comme indiqué à la Section 11, une amplification de x200-x500 permet de visualiser la
fluorescence. (Pour obtenir des résultats optimaux, les échantillons doivent en principe être examinés
immédiatement après le marquage, mais ils peuvent être conservés entre 2 et 8 °C, à l'abri de la lumière,
jusqu'à 24 heures).
11 INTERPRETATION DES RESULTATS
11.1 CONTRÔLES
11.1.1 Lames de contrôle positif
Une fois colorée et examinée conformément aux instructions de la Section 10, la lame de contrôle positif
doit présenter des cellules avec une fluorescence nucléaire et/ou cytoplasmique intracellulaire vert-pomme,
contrastant avec la couleur rouge du contre-colorant. Ces cellules sont légèrement plus grandes que les
cellules épithéliales respiratoires ou conjonctives, mais présentent une fluorescence intracellulaire,
cytoplasmique et/ou nucléaire similaire lorsqu'elles sont contaminées par un adénovirus. Les lames de
contrôle positif doivent servir à vérifier si la procédure de marquage a été réalisée correctement.
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11.1.2 Contrôle négatif
Si un contrôle négatif s'avère nécessaire, il est recommandé d'utiliser des cellules intactes non
contaminées, du même type que celles utilisées pour la culture et l'isolement de l'adénovirus. Les cellules
doivent être préparées et fixées conformément aux indications de la Section 9.2 et colorées comme indiqué
à la Section 10.
11.2 ECHANTILLONS CLINIQUES
11.2.1 Aspect des cellules contaminées par l’adénovirus
Une fluorescence granulaire intranucléaire, nucléaire et/ou cytoplasmique vert-pomme apparaît dans les
cellules épithéliales respiratoires ou conjonctives contaminées par l'adénovirus.
Les cellules non contaminées se colorent en rouge au contact du bleu d’Evans, le contre-colorant.
11.2.2 Interprétation des résultats
Le diagnostic est positif lorsqu'une ou plusieurs cellule(s) présente(nt) une fluorescence caractéristique
dans l'échantillon fixé coloré (voir Section 11.2.1).
Le diagnostic est négatif lorsque les échantillons fixés et colorés ne présentent pas de fluorescence après
marquage avec le réactif.
En ce qui concerne les échantillons ophtalmiques ou d'aspirations nasopharyngiennes colorés directement,
un minimum de 20 cellules épithéliales respiratoires ou conjonctives non infectées doit être visible pour
permettre de conclure à un résultat négatif. Voir Section 11.2.3 s'il n'y a pas suffisamment de cellules.
11.2.3 Quantité de cellules insuffisante
S'il n'y a pas suffisamment de cellules sur la lame, centrifuger le reste de l'échantillon clinique à 380g,
pendant 10 minutes, à température ambiante (15-30 °C). Remettre les cellules en suspension dans un plus
petit volume de PBS avant répartition (25µL) sur la lame.
Le cas échéant, il est conseillé de prélever un nouvel échantillon.
11.3 CONFIRMATION DE LA CULTURE CELLULAIRE
11.3.1 Aspect de cellules contaminées par l'adénovirus
Une fluorescence intracellulaire, nucléaire et/ou cytoplasmique, vert-pomme apparaît dans les cellules
infectées qui doivent être notées comme étant contaminées par l’adénovirus.
Les cellules non contaminées se colorent en rouge au contact du, bleu d’Evans, le contre-colorant.
11.3.2 Interprétation des résultats
Le diagnostic est positif lorsqu'au moins une cellule dans l’échantillon fixé et coloré affiche le type de
fluorescence décrit à la Section 11.3.1. après marquage à l'aide du réactif.
Pour pouvoir conclure à un résultat négatif, il est nécessaire de relever un minimum de 50 cellules non
infectées dans le puits de la lame contenant la culture cellulaire testée. Voir Section 11.3.3 s'il n'y a pas
suffisamment de cellules.
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11.3.3 Quantité de cellules insuffisante
S'il n'y a pas suffisamment de cellules sur la lame, centrifuger le reste de l'échantillon clinique à 200g,
pendant 10 minutes, à température ambiante (15-30 °C). Remettre les cellules en suspension dans un plus
petit volume de PBS avant répartition (25µL) sur la lame.
Le cas échéant, il est conseillé d’inoculer un nouvel échantillon sur des monocouches cellulaires fraîches et
de recommencer la culture cellulaire.
12 LIMITES DU TEST
12.1 Utiliser exclusivement le liquide de montage fourni avec le test IMAGEN Adénovirus.
12.2 L’apparence de l’image de fluorescence obtenue peut varier en fonction du type de microscope et de
la source lumineuse utilisés.
12.3 Il est recommandé d'utiliser 25µL de réactif pour couvrir la surface d'un puits de 6mm de diamètre. Si
ce volume est réduit, il peut de s'avérer difficile de couvrir la surface de l'échantillon, au risque de diminuer
la sensibilité.
12.4 Tous les réactifs sont fournis prêts à l'emploi, à des concentrations prédéterminées. Les
performances pourraient être affectées en cas de modification des réactifs par l'utilisateur ou de non
respect des conditions de conservation, comme cela est indiqué dans la Section 5.
12.5 Le prélèvement d'échantillons à un moment inapproprié, l'échantillonnage et/ou la manipulation
incorrect(e/s) des échantillons, l’échec de la culture cellulaire, etc. sont autant de facteurs qui peuvent
empêcher la détection de l’adénovirus. Un résultat négatif n'exclut pas pour autant la possibilité d'une
contamination adénovirale.
12.6 La présence d'adénovirus dans les secrétions nasopharyngiennes n'exclut pas nécessairement la
possibilité d'une infection concomitante avec d'autres agents pathogènes. Tous les résultats positifs doivent
être interprétés avec circonspection lorsqu'on sait que l'adénovirus peut être latent et recrudescent. Une
excrétion asymptomatique peut survenir jusqu'à 18 mois après l'infection. 20 Les résultats du test doivent être
interprétés en tenant compte des informations fournies par les études épidémiologiques, l’évaluation clinique
du patient et autres procédures de diagnostic.
12.7 Les résultats du test doivent être interprétés en tenant compte des informations fournies par les études
épidémiologiques, l’évaluation clinique du patient et autres procédures de diagnostic.
13 VALEURS NORMALES
Les diverses sous-catégories d'adénovirus présentent des tropismes différents. Toutefois, les maladies se
manifestent d'abord sous forme d'infections respiratoires, oculaires et entériques. Le taux d'isolement positif
varie, en fonction du test utilisé, des conditions de prélèvement des échantillons, de l'âge de la population
testée et d'un facteur de surpeuplement éventuel affectant la population concernée.
Le taux d'isolement est influencé par la gravité des maladies associées au virus, de même que par la
tendance qu'ont les souches de virus à provoquer des infections chroniques avec excrétion du virus
pendant de longues périodes.
Les adénovirus sont responsables de 5 % des infections respiratoires graves chez les enfants âgés de
moins de 4 ans et de 10 % des infections respiratoires nécessitant une hospitalisation pour ce même
groupe. 3,6,7 Les cas de cystites hémorragiques aiguës chez les enfants peuvent être dus à des adénovirus.
Les adénovirus entériques sont à l'origine de 4 à 15 % des cas d'hospitalisation d'enfants atteints de gastroentérites
virales et s'attaquent de préférence aux enfants de moins de 3 ans. 3,11,12
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Les infections oculaires dues aux adénovirus (kératoconjonctivite épidémique et conjonctivite des piscines)
touchent toutes les tranches d'âge, de même que les infections adénovirales des patients
immunodéficients. 3,8
Chez les adultes, et plus particulièrement parmi le personnel militaire, les adénovirus sont isolés au niveau
de lésions du col de l'utérus et du pénis, ainsi que dans le cadre d'infections respiratoires graves (ARD).
14 PERFORMANCES SPECIFIQUES CARACTERISTIQUES
14.1 SPECIFICITE DE L'ANTICORPS MONOCLONAL AVEC LES SEROTYPES D'ADENOVIRUS
On a constaté que l'anticorps monoclonal utilisé dans ce test réagissait avec un épitope spécifique du genre
de la protéine hexon d'adénovirus qui est présent dans tous les types sérologiques humains connus.
14.2 ETUDES CLINIQUES
Le test IMAGEN Adénovirus a été évalué par utilisation directe dans deux centres d'études cliniques, sur
des secrétions nasopharygiennes prélevées sur des enfants et des adultes hospitalisés et présentant des
symptômes d'infections respiratoires. Ce test a également été évalué par un centre ophtalmologique sur
des échantillons conjonctifs prélevés sur des patients atteints de conjonctivite. Trois centres d'étude ont
évalué le test IMAGEN Adénovirus pour détecter l'adénovirus dans la culture cellulaire.
Ces centres ont testé directement 474 échantillons cliniques respiratoires et 179 échantillons conjonctifs,
plus 296 échantillons en confirmation de culture. Les tests standard pour les prélèvements directs
consistaient en une culture cellulaire suivie ou non d'une immunofluorescence indirecte et, pour la
confirmation de la culture, les tests standard consistaient en une immunofluorescence indirecte utilisant un
anticorps polyclonal ou en une neutralisation spécifique.
Tous les calculs supposent que les tests standard sont sensibles et spécifiques à 100 %. La sensibilité, la
spécificité et les valeurs prédictives ont été calculées comme décrit précédemment. 21
14.3 PERFORMANCES CLINIQUES
14.3.1 Echantillons directs
Secrétions nasopharyngiennes
Des échantillons cliniques frais ont été testés au cours de l'hiver 1988/1989 et des échantillons conservés
(congelés) prélevés au cours des hivers 1978 et 1988 ont également fait l'objet d'un test. Les deux centres
ont comparé le test IMAGEN Adénovirus avec les méthodes de référence. Le résultat était considéré
comme positif selon la méthode de référence lorsque la culture cellulaire ou l'immunofluorescence indirecte
était positive. Cela permit de détecter la présence de virus non viable par fluorescence ou de détecter un
virus débarrassé de cellules par culture cellulaire. Un échantillon était considéré comme positif selon le test
IMAGEN Adénovirus lorsqu'une ou plusieurs cellule(s) épithéliale(s) fluorescente(s) apparaissai(en)t (voir
Section 11.2).
Le tableau 14.1 présente les résultats du test IMAGEN Adénovirus. Le taux de prévalence de
l'adénovirus au sein de ces populations atteint 9,1 % (43/474). Ces résultats correspondent à ceux qui ont
été obtenus dans le cadre des tests standard pour 468 cas (98,7 %). La sensibilité du test IMAGEN
Adénovirus test atteint 86,0 % (37/43) et sa spécificité 100 % (431/431). Les valeurs prospectives pour les
résultats positifs et négatifs atteignent respectivement 100 % (37/37) et 98,6 % (431/437).
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Tableau 14.1 Comparaison des résultats obtenus avec le test IMAGEN Adénovirus et la culture
cellulaire sur des échantillons nasopharyngiens dans 2 centres
TEST RESULT
Reference method
IMAGEN Adenovirus
Neg
Neg
Pos
Pos
Pos
Neg
No. of Specimens (474) 431 37 6* 0
*1) 4 échantillons sur 6 ont pris plus de 10 jours pour produire un effet cytopathogène en culture, ce qui
indique vraisemblablement que le taux d'antigènes présents était très faible.
2) 2 échantillons sur 6 étaient négatifs par immunofluorescence indirecte.
Echantillons ophtalmiques
Le test IMAGEN Adénovirus a été évalué par rapport à un système de culture cellulaire établi. Les
prélèvements conjonctifs ont été effectués sur 179 patients atteints de conjonctivite soignés dans un hôpital
spécialisé. Le taux de prévalence des infections à adénovirus dans le groupe d'individus étudié atteint 19,6
% (35/179). Les frottis ont été préparés à partir de prélèvements effectués à la consultation puis placés
dans un milieu de transport en vue de l'évaluation de la culture cellulaire. Un échantillon était considéré
comme positif avec le test IMAGEN Adénovirus lorsqu'une ou plusieurs cellule(s) épithéliale(s)
fluorescente(s) apparaissai(en)t (voir Section 11.2). Un échantillon était considéré comme positif avec le
test de culture cellulaire lorsque l'effet cytopathologique caractéristique était confirmé par
l'immunofluorescence indirecte. Les résultats de cette étude sont mentionnés dans le Tableau 14.2. Sur les
179 échantillons testés, le même résultat a été observé selon les deux méthodes dans 174 cas, soit une
corrélation de 97,2 %. La sensibilité et la spécificité du test IMAGEN Adénovirus atteint respectivement
91,4 % (32/35) et 98,6 % (142/144). Les valeurs prédictives pour les tests positifs et négatifs atteignent
respectivement 94,1 % (32/34) et 97,9 % (142/145).
Tableau 14.2 Comparaison des résultats obtenus avec le test IMAGEN Adénovirus et la
culture cellulaire sur des échantillons ophtalmiques humains
TEST RESULTAT
Méthode de référence
IMAGEN Adénovirus
Nég
Nég
Pos
Pos
Pos
Nég
Nombre d'échantillons (179) 142 32 3* 2**
* Quantité insuffisante de prélèvement pour répéter le test.
** Ces 2 prélèvements n'ont été mis en culture que sur 2 jours.
14.2.2 Confirmation de la culture cellulaire
Trois centres d'étude ont testé le test IMAGEN Adénovirus sur les cultures cellulaires d'échantillons
cliniques. Ce test a été comparé aux tests d'immunofluorescences indirectes et/ou de neutralisation pour la
culture cellulaire. Les isolements ont été effectués sur des lignées de cellules habituellement utilisées pour
la culture d'adénovirus. Les cultures cellulaires ont été lavées dans du PBS avant d'être transférées sur les
lames. Les lames ont été fixées à l'acétone puis testées à l'aide des réactifs du test IMAGEN Adénovirus.
On a utilisé à la fois des prélèvements cliniques frais et des échantillons précédemment congelés. Au total,
296 cultures ont été évaluées. Les cultures cellulaires positives isolées ont été confirmées par des tests soit
d'immunofluorescence, soit de neutralisation.
Les résultats de ces études (Tableau 14.3) indiquent que le test IMAGEN Adénovirus a détecté tous les
isolats d'adénovirus positifs, soit une sensibilité de 100 % (162/162). La spécificité du réactif atteint elle
aussi 100 % (134/134).
Neg
Pos
Nég
Pos
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Tableau 14.3 Comparaison des résultats obtenus par le test IMAGEN Adénovirus et les
méthodes standard de confirmation de culture dans 3 centres
TEST RESULT
Standard confirmation
IMAGEN Adenovirus
Neg
Neg
Pos
Pos
Pos
Neg
No. of Specimens (296) 134 162 0 0
14.3 REACTIONS CROISEES
Le test IMAGEN Adénovirus a été réalisé sur des préparations composées d'autres virus et organismes
susceptibles d'être présents dans des échantillons respiratoires ou ophtalmiques ou de culture cellulaire.
Tous les organismes testés (Tableau 14.4) se sont révélés négatifs avec le test IMAGEN Adénovirus.
Tableau 14.4 Organismes testés selon le test IMAGEN Adénovirus et s'étant révélés
non réactifs
Acholeplasma laidlawii
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Virus Coxsackie
Cytomegalovirus
Echovirus
Virus d’Epstein-Barr
Haemophilus influenzae
Herpes simplex virus
Virus Influenza A & B
Legionella pneumophila
Virus de la rougeole
Virus des oreillons
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinus
Mycoplasma orale
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Neisseria cinerea
Neisseria flavescens
Neisseria gonorrhoea
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis A, B, C & D
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Neisseria pharyngis
Virus parainfluenza types 1,2,3 & 4b
Pneumocystis carinii
Virus de la polio types 1 & 2
Virus respiratoire syncytial
Rhinovirus
Staphylococcus aureus
Streptococcus gps A,B,C,D,F,G
Virus varicella zona
Neg
Pos
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1 ZWECKBESTIMMUNG
Der IMAGEN Adenovirus-Test ist ein qualitativer, direkter Immunfluoreszenztest zum Nachweis von
Adenovirus-Antigen in klinischen Proben und dient zum Adenovirus-Nachweis in Zellkulturen.
2 EINFÜHRUNG
Adenoviren sind hüllenlose, ikosaedrische DNA-Viren. Die Familie der Adenovien umfaßt 2 Gattungen,
Adenoviren der Säuger (Mastadenoviren) und Adenoviren der Vögel (Aviaadenoviren). 1 Mindestens 47
bekannte Serotypen humaner Adenoviren wurden nachgewiesen und mit Verfahren wie der
Hämagglutination, Neutralisation, DNA-Hybridisierung sowie Restriktionsendonuklease-Analyse der
adenoviralen DNA beschrieben. 1,2,3,4
Humane Adenoviren sind mit einer Vielzahl klinischer Erkrankungen, sowohl bei immunkompetenten als
auch abwehrgeschwächten Patienten assoziiert; dazu gehören Infektionen des Respirationstrakts, der
Konjunktiva und des Gastrointestinaltrakts. 3,5 Infektionen kommen häufig bei Kindern vor und können
sporadisch oder als Ausbrüche auftreten.
Circa 5 % der akuten Atemwegserkrankungen bei Kindern und 10 % der fieberhaften Erkrankungen und
Pneumonien im Kindesalter sind mit Adenovirus-Infektionen in Zusammenhang gebracht worden. 3,6,7
Adenovirus-Infektionen des Auges können zu Pharyngokonjunktivalfieber, Conjunctivitis folicularis oder
epidemischer Keratokonjunktivitis führen. 3,8
Die Adenovirus-Serotypen 40 und 41 sind häufig mit Virusgastroenteritis bei Kleinkindern verbunden und
sind für 4-15 % der nosokomialen Infektionen auf Kinderstationen verantwortlich. 3,9,10 Bei
abwehrgeschwächten Patienten (z. B. nach Transplantationen oder bei AIDS-Patienten) können ernsthafte
systemische Infektionen auftreten, die lebensbedrohlich sein können. 3
Die Labordiagnose der Adenovirus-Infektion spielt eine wichtige Rolle für die Behandlung der Patienten und
ermöglicht eine wirksame Kontrolle von Ausbrüchen. Zu den diagnostischen Methoden zählen der direkte
Nachweis des Virus oder der Virusproteine in klinischen Proben (z. B. nasopharyngealen Absaugsekreten),
die Isolierung des lebensfähigen Virus auf Einschicht-Zellkulturen, die mit Atemwegs-, Konjunktival- oder
Stuhlproben inokuliert wurden und der Nachweis adenovirusspezifischer Immunglobuline. 3,5
Die Isolierung der Adenoviren aus klinischen Proben erfolgt mit kontinuierlichen Zelllinien hauptsächlich
epithelialen Ursprungs, wie HeLa-, HEp-2-, KB- und 293-Zelllinien, bei denen Adenoviren den
charakteristischen zytopathischen Effekt zeigen können. 3,5
Die Identifikation von Adenovirus-Isolaten ist mit Hilfe verschiedener Techniken bestätigt worden; zu ihnen
gehören Neutralisationstests, Radioimmunoassay, DNA-Hybridisierung, Elektronenmikroskopie und
DNA-Elektrophorese. 11,12,13,14,15 Diese Verfahren sind kompliziert, arbeitsaufwendig und meist für die
routinemäßige Anwendung ungeeignet.
Kürzlich wurden indirekte Immunfluoreszenztests oder Enzymimmunoassays (z. B. IDEIA Adenovirus)
zum direkten Nachweis von Adenoviren in klinischen Proben oder auf Einschicht-Zellkulturen beschrieben,
bei denen gattungsspezifische mono- oder polyklonale Antikörper eingesetzt werden. 15,16,17
Direkte Immunfluoreszenztests, bei denen spezifische monoklonale Antikörper zur Anwendung gelangen,
bieten eine schnelle, empfindliche und spezifische Methode zum direkten Nachweis von Adenoviren in
klinischen Proben wie nasopharyngealen Absaugsekreten und Konjunktivalabstrichen oder zur Bestätigung
isolierter Adenoviren auf Einschicht-Zellkulturen.
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IMAGEN Adenovirus ist ein direkter Immunfluoreszenztest zum Nachweis und zur Identifikation humaner
Adenovirus-Serotypen in klinischen Proben oder Zellkulturen. Im Test gelangt ein gattungsspezifischer
monoklonaler Antikörper zur Anwendung, der ein Epitop des Adenovirus-Hexonproteins nachweist, das in
allen bekannten humanen Adenovirus-Serotypen exprimiert wird. 18
3 TESTPRINZIP
Der IMAGEN Adenovirus-Test enthält Fluoresceinisothiocyanat- (FITC-) konjugierte monoklonale
Antikörper. Das konjugierte Reagenz bindet spezifisch an ein Epitop, das dem Hexonprotein aller
Serotypen humaner Adenoviren gemein ist. Das Reagenz wird in einem direkten
Einschritt-Immunfluoreszenztest eingesetzt. Die Proben werden mit dem FITC-konjugierten Antikörper
15 Minuten inkubiert und anschließend wird überflüssiges Reagenz durch Waschen mit
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Die gefärbten Flächen werden eingedeckt und anhand
der Epifluoreszenz-Mikroskopie ausgewertet. Falls Adenoviren vorliegen, ist im Zytoplasma und/oder
Zellkern infizierter Zellen eine charakteristische helle, apfelgrüne Fluoreszenz zu beobachten, die im
Kontrast zur roten Hintergrundfärbung nicht infizierter Zellen steht.
Anerkennung
Der in diesem Test verwendete monoklonale Antikörper stammt aus der Division of Microbiological
Reagents and Quality Control, Central Public Health Laboratory, Colindale, London, Großbritannien.
4 DEFINITIONEN
Die folgenden Symbole und Definitionen entsprechen ISO 15223 und EN 980 und wurden in den
Produktinformationen verwendet.
N
Produktcode und Bestellnummer
Gebrauchsanweisung beachten
Inhalt ausreichend für ‚n’ Ansätze
Hersteller
In-Vitro-Diagnostikum
Verwendbar bis
Chargenbezeichnung
Zulässiger Temperaturbereich
5 GELIEFERTE REAGENZIEN
50 - Jeder Testkit enthält ausreichend Reagenzien für die Durchführung des Tests an 50
Patientenproben oder an 50 Zellkulturpräparationen. - Die Haltbarkeit des Testkits ist auf dem äußeren
Verpackungsetikett vermerkt.
5.1 IMAGEN ADENOVIRUS-REAGENZ
Eine Gebrauchsanleitung.
Jeweils ein Fläschchen der folgenden Reagenzien:
2 x als Positivkontrolle vorgesehene Objektträger mit 1 Vertiefung und
Azeton-fixierten humanen Epithelzellen (HEp-2), die mit Adenovirus infiziert sind.
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Ein Fläschchen mit 3 mL Eindeckmedium. Das Eindeckmedium enthält eine
Hemmsubstanz gegen lichtbedingtes Ausbleichen in einer Glyzerinlösung
(pH 10,0) und ist bei 2-8 °C aufzubewahren.
Ein Fläschchen mit 1,4 mL IMAGEN Adenovirus-Testreagenz. Das Reagenz
enthält gereinigten, murinen, monoklonalen Antikörper, spezifisch gegen ein
gemeinsames Epitop am Adenovirus-Hexonprotein und mit FITC konjugiert.
Das Konjugat wurde in einer proteinstabilisierten Pufferlösung (pH 7,5)
angesetzt, enthält Evans-Blau als Gegenfärbemittel und 15 mmol/L Natriumazid
als Konservierungsmittel.
5.2 ANSETZEN, LAGERUNG UND ERNEUTE VERWENDUNG DER KIT-KOMPONENTEN
Um optimale Leistung der Kit-Komponenten sicherzustellen, müssen alle nicht genutzten Komponenten in
Übereinstimmung mit den folgenden Anleitungen gelagert werden:
5.3 POSITIVE KONTROLLOBJEKTTRÄGER -
Als Positivkontrolle dienende Objektträger werden einzeln in versiegelten und mit Stickstoff gefüllten
Kunststoffbeuteln geliefert. Nicht verwendete Objektträger bei 2-8 °C lagern. Vor dem Öffnen den
Objektträger 5 Minuten lang Raumtemperatur (15-30 °C) annehmen lassen.
Die Objektträger müssen unmittelbar nach dem Öffnen der Folienhüllen angefärbt werden.
5.4 EINDECKMEDIUM -
Gebrauchsfertig. Bei 2-8 °C lagern. Das Eindeckmedium vor Gebrauch 5 Minuten auf Raumtemperatur
(15-30 °C) bringen.
5.5 REAGENZ -
Gebrauchsfertig. Das Reagenz bei 2-8 °C im Dunkeln aufbewahren und vor Gebrauch 5 Minuten lang auf
Raumtemperatur (15-30 °C) bringen.
6 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN UND ERFORDERLICHES ZUBEHÖR
6.1 REAGENZIEN
Frisches Azeton (zur Fixierung).
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, zum Waschen der gefärbten Proben und zur
Probenvorbereitung.
6.2 ZUBEHÖR UND GERÄTE
Die folgenden Produkte sind für die Anwendung zusammen mit IMAGEN Adenovirus bestimmt. Weitere
Informationen können von der zuständigen DakoCytomation-Niederlassung oder vom zuständigen Händler
angefordert werden.
Von der zuständigen DakoCytomation-Niederlassung oder vom zuständigen Händler können Teflonbeschichtete
Glasobjektträger mit einer einzelnen Vertiefung mit einem Durchmesser von 6 mm bezogen
werden (100 Objektträger pro Gebinde; Code-Nr. S 6114).
Positiver Kontrollobjektträger (Code-Nr. S 6125).
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7 AUSSTATTUNGEN
Es werden folgende Ausstattungen benötigt:
Präzisionspipette und Einmal-Pipettenspitzen, 25 µL.
Waschtrog.
Deckgläser zum Eindecken einer Vertiefung mit 6 mm Durchmesser.
Nicht fluoreszierendes Immersionsöl.
Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Filtersystem für FITC (maximale Anregungswellenlänge 490 nm,
mittlere Emissionswellenlänge 520 nm) und 200-500facher Vergrößerung.
Inkubator für 37 °C.
Niedertourige Zentrifuge.
Für direkte Proben
Sterile Tupfer.
Schleim-Extraktor (nur für nasopharyngeale Proben).
Zur Zellkultur-Bestätigung
Sterile Tupfer und Virus-Transportmedium (VTM) und Behälter, geeignet für Gewinnung und Transport von
Adenoviren.
Für das Anlegen einer Kultur und für die Isolierung von Adenoviren geeignete Zelllinien.
8 VORSICHTSMASSNAHMEN
- In vitro Diagnostikum. Personen, die Tests mit diesem Produkt durchführen, müssen in die
Durchführung eingewiesen sein und über entsprechende Laborerfahrung verfügen.
8.1 SICHERHEITSMASSNAHMEN
8.1.1 Das IMAGEN Adenovirus-Testreagenz enthält 15 mmol/L. Natriumazid. Natriumazid ist ein Gift, das
mit Blei und Kupferleitungen reagieren und hochexplosive Metallazide bilden kann. Beim Entsorgen der
azidhaltigen Materialien immer mit reichlich Wasser spülen.
8.1.2 Adenoviren auf den positiven Kontrollobjektträgern haben sich in Zellkulturen nachweislich als nicht
infektiös erwiesen; trotzdem sind sie als potentiell infektiös zu handhaben und zu entsorgen.
8.1.3 Das Reagenz enthält Evans-Blau. Evans-Blau ist möglicherweise karzinogen; Hautkontakt ist deshalb
zu vermeiden.
8.1.4 Bei Verwendung des Eindeckmediums muss vorsichtig vorgegangen werden, da es Hautirritationen
verursachen kann. Falls es zu einem Kontakt kommt, muss die Haut mit Wasser abgewaschen werden.
8.1.5 Essen, Trinken, Rauchen, Aufbewahren und Zubereiten von Speisen sowie Schminken sind im für
Arbeiten vorgesehenen Bereich (Labor) verboten.
8.1.6 Reagenzien dürfen nicht mit dem Mund pipettiert werden.
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8.1.7 Beim Handhaben von klinischen Proben und infizierten Zellen sind immer Einweghandschuhe zu
tragen und nach dem Umgang mit infektiösen Stoffen sind immer die Hände zu waschen.
8.1.8 Alle klinischen Proben entsprechend den geltenden gesetzlichen Vorschriften entsorgen.
8.1.9 Von fachlich qualifizierten Anwendern kann ein Sicherheitsdatenblatt angefordert werden.
8.2 TECHNISCHE VORSICHTSMASSNAHMEN
8.2.1 Kit-Komponenten dürfen nach Ablauf des auf den Etiketten vermerkten Verfalldatums (Verwendbar
bis:) nicht mehr verwendet werden. Reagenzien aus verschiedenen Chargen dürfen nicht vermischt oder
gegeneinander ausgetauscht werden.
8.2.2 Die Reagenzien werden in festgelegten Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung wird
beeinträchtigt, falls Reagenzien modifiziert oder unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten
Bedingungen gelagert werden.
8.2.3 Die erforderliche Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ist am Tag der Anwendung frisch
anzusetzen.
8.2.4 Waschschritte müssen mit PBS durchgeführt werden. Die Verwendung anderer Waschlösungen, wie
z. B: Leitungswasser oder destilliertes Wasser, beeinträchtigt die Testergebnisse.
8.2.5 Mikrobielle Kontamination der Reagenzien muss vermieden werden.
8.2.6 Die Reagenzien dürfen nicht tiefgekühlt werden.
9 GEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER PROBEN 19
Gewinnung und Vorbereitung der Proben sind bei der Diagnose von Adenoviren mittels direkter
Immunfluoreszenz und Zellkultur-Methoden von grundlegender Bedeutung. Proben müssen vom
Infektionsort zum Zeitpunkt der maximalen Freisetzung von Viren („viral shedding“) gewonnen werden,
damit sie so viel infiziertes Material als möglich enthalten. Außerdem müssen Proben so vorbereitet
werden, dass entweder intakte Zellen erhalten bleiben, die von anhaftendem Mukus usw. frei sind und eine
direkte mikroskopische Untersuchung ermöglichen oder dass die Lebensfähigkeit der Viren in Proben
erhalten bleibt, anhand derer eine Kultur angelegt werden soll.
9.1 KLINISCHE PROBEN
9.1.1 Ophthalmische Proben
Gewinnung
Das Auge lokal betäuben, anschließend die obere und untere Konjunktiva freilegen. Ein Stäbchen mit einer
Watte- oder Dacron -Spitze kräftig über die Flächen der oberen und unteren Konjunktiva streichen und
das Stäbchen während dieses Prozesses rotieren, um sicherzustellen, dass die Probe von der gesamten
Fläche der Konjunktiva gewonnen wird.
Vorbereitung der Objektträger
Das zur Probengewinnung genutzte Wattestäbchen mit leichtem Druck innerhalb der 6 mm Vertiefung auf
dem Objektträger hin und her rollen. Sicherstellen, dass zum Vorbereiten des Objektträgers die gesamte
Stäbchenspitze verwendet wird. Probe bei Raumtemperatur (15-30 °C) an der Luft trocknen lassen und
daraufhin 10 Minuten lang mit frischem Azeton fixieren. Objektträger an der Luft trocknen lassen. Falls der
Objektträger nicht sofort angefärbt wird, kann er über Nacht bei 4 °C aufbewahrt werden.
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9.1.2 Nasopharyngeale Sekrete/Absaugsekrete
Gewinnung
Proben aus dem nasopharyngealen Bereich durch eine Sonde (Größe 8) in einen Mukusextraktor
gewinnen. Mukusextraktor und Schlauchmaterial müssen bei Temperaturen 2-8 °C gehalten und so schnell
als möglich zur Verarbeitung ans Labor weitergeleitet werden.
Zellseparation
Falls notwendig, der Probe vor Zentrifugation 2 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugeben, um
die Viskosität zu verringern und den Schleim zu verdünnen. Den Schleim-Extraktor bei Raumtemperatur
(15-30 °C) 10 Minuten bei 380 g zentrifugieren. Den Überstand, der für Zellkulturen verwendet werden
kann, entfernen. Das Zellsediment in 2 mL PBS resuspendieren und die Zellen mit einer Weitschaft-Pipette
vorsichtig auf und ab pipettieren oder in einem Vortex-Gerät vorsichtig mischen, bis der Schleim separiert
und das Zellmaterial freigegeben wird. Heftiges Pipettieren/Mischen ist zu vermeiden, um eine
Beschädigung der Zellen zu verhindern. Sobald sich eine gleichmäßige Suspension gebildet hat, je nach
Bedarf weitere PBS zugeben und nach Zugabe der zusätzlichen PBS wieder pipettieren oder in einem
Vortex-Gerät mischen, um die Zellen weiter zu waschen. Jegliche sichtbaren, bis zu diesem Stadium noch
verbliebenen Schleimteilchen entfernen und entsorgen. Überschüssiger Schleim muss entfernt werden, weil
sonst eine adäquate Penetration des Reagenzes verhindert wird, was zu einer unspezifischen Fluoreszenz
führen kann.
Falls das ganze Sekret in der Ernährungssonde verbleibt und nichts davon den Schleim-Extraktor erreicht,
das gesamte Sekret aus der Sonde in PBS herauswaschen. Das wird am besten erreicht, indem eine
Pasteur-Pipette in das Sondenende eingeführt wird, das sich am Schleim-Extraktor befand. Die
entsprechende Flüssigkeit in die Sonde saugen und wiederholt hinausdrücken, bis sich das an der
Sondenwand befindliche Sekret gelöst hat. Die so erhaltene Suspension wird solange auf und ab pipettiert,
bis der Schleim adäquat aufgebrochen ist.
Vorbereitung der Objektträger
Nach der Separation wird die Zellsuspension bei Raumtemperatur (15-30 °C) 10 Minuten bei 380 g
zentrifugiert und der Überstand entsorgt. Das Zellsediment in ausreichend PBS resuspendieren, um
jegliche verbliebenen Schleimreste zu verdünnen und gleichzeitig eine hohe Zelldichte beizubehalten.
25 µL des resuspendierten Zellsediments in die 6 mm große Vertiefung eines teflonbeschichteten
Mikroskopobjektträgers geben. Die Probe bei Raumtemperatur (15-30 °C) gründlich trocknen lassen und in
frischem Azeton bei Raumtemperatur (15-30 °C) 10 Minuten fixieren. Wird die Probe nicht sofort gefärbt, ist
sie über Nacht bei 4 °C aufzubewahren oder für eine längere Aufbewahrungszeit bei –20 °C einzugefrieren.
9.2 ZELLKULTUR
Beimpfung von Zellkulturen
Zur Diagnose von Adenovirus-Infektionen gewonnene Proben werden auf Zelllinien inokuliert, die in
Laboratorien routinemäßig und nach etablierten Labormethoden zur Anwendung gelangen. Zellkulturen
sind regelmäßig auf das Auftreten zytopathischer Effekte (cytopathic effect, CPE) zu untersuchen und es
sind regelmäßige Hämadsorptionstests durchzuführen. Im Hämadsorptionstest positive Kulturen oder CPE
aufweisende Zellkulturen können geerntet und auf das Vorliegen des Adenovirus getestet werden.
Vorbereitung der Objektträger
Wird mit einer Adenovirus-Infektion konsistente Hämadsorption oder CPE beobachtet, dann kann die
Monolayer-Kultur geerntet werden, wenn mindestens 50 % der Zellen betroffen sind.
Die Zellschicht mit einer sterilen Pipette in das flüssige Kulturmedium schaben. Die Zellen durch 10minütige
Zentrifugation bei 200 g und Raumtemperatur (15-30 °C) sedimentieren und den Überstand entsorgen.
Die Zellen durch Resuspension des Zellsediments in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, siehe
Abschnitt 8.2) waschen und die Zentrifugation wiederholen. Den Überstand entsorgen und das
Zellsediment in einer kleinen Menge frischer PBS resuspendieren, um eine hohe Zelldichte beizubehalten.
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Je 25 µL der Suspension in die Vertiefungen der Objektträger geben. Gründlich an der Luft trocknen lassen
und in frischem Azeton 10 Minuten bei Raumtemperatur (15-30 °C) fixieren. Wird die Probe nicht sofort
angefärbt, ist sie über Nacht bei 4 °C aufzubewahren oder, falls eine längere Aufbewahrung vorgesehen ist,
bei –20 °C einzufrieren.
10 TESTVERFAHREN
VOR DURCHFÜHRUNG DES TESTVERFAHRENS SIND DIE IN ABSCHNITT 8.2 AUFGEFÜHRTEN
TECHNISCHEN VORSICHTSMASSNAHMEN ZU BEACHTEN.
10.1 ZUSETZEN DES REAGENZES
25 µL Reagenz in jede 6 mm Vertiefung geben. Dafür sorgen, dass das Reagenz den gesamten Bereich
der Vertiefung bedeckt.
10.2 ERSTE INKUBATION
Die Objektträger 15 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren. Das Reagenz darf nicht
auf der Probe eintrocknen, da dies zu unspezifischer Anfärbung führt.
10.3 WASCHEN DES OBJEKTTRÄGERS
Überschüssiges Reagenz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abwaschen und den Objektträger
anschließend in einem Schüttelbad, das PBS enthält, 5 Minuten vorsichtig waschen. Die PBS vom
Objektträger abfließen lassen und bei Raumtemperatur (15-30 °C) lufttrocknen.
10.4 ZUSETZEN VON EINDECKMEDIUM
Einen Tropfen IMAGEN Adenovirus-Eindeckmedium in die Mitte jeder Vertiefung geben und mit einem
Deckglas eindecken; sicherstellen, dass dabei keine Luftblasen entstehen.
10.5 ABLESEN DES OBJEKTTRÄGERS
Die gesamte 6 mm große Testfläche, auf der sich die gefärbte Probe befindet, mit einem Epifluoreszenz-
Mikroskop untersuchen. Wie in Abschnitt 9 beschrieben, sollte die Fluoreszenz bei 200-500facher
Vergrößerung sichtbar sein. (Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Proben unmittelbar nach dem
Anfärben abgelesen werden; Proben können aber auch bis zu 24 Stunden bei 2-8 °C im Dunkeln
aufbewahrt werden).
11 INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE
11.1 KONTROLLEN
11.1.1 Positive Kontrollobjektträger
Beim positiven Kontrollobjektträger, der gemäß Abschnitt 10 angefärbt und abgelesen wurde, sollten Zellen
mit intrazellulärer nukleärer und/oder zytoplasmatischer apfelgrüner Fluoreszenz sichtbar werden, die mit
einem roten Hintergrund gegengefärbten Materials kontrastiert. Diese Zellen sind etwas größer als
Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva, weisen aber bei Infektion mit Adenovirus ähnliche
intrazelluläre, nukleäre und/oder zytoplasmatische Fluoreszenz auf. Positive Kontrollobjektträger müssen
verwendet werden, um überprüfen zu können, dass das Testverfahren ordnungsgemäß durchgeführt
wurde.
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11.1.2 Negative Kontrolle
Falls eine negative Kontrolle erwünscht ist, empfiehlt sich die Verwendung von nicht infizierten, intakten
Zellen des Typs, der zur Kultur und Isolierung von Adenoviren verwendet wird. Die Zellen sind wie in
Abschnitt 9.2 beschrieben zu präparieren und zu fixieren und anschließend gemäß der Beschreibung in
Abschnitt 10 anzufärben.
11.2 KLINISCHE PROBEN
11.2.1 Erscheinungsbild Adenovirus-infizierter Zellen
Intrazelluläre, nukleäre und/oder zytoplasmatische, granuläre apfelgrüne Fluoreszenz wird bei mit
Adenovirus befallenen Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva sichtbar.
Nicht infizierte Zellen sind bei Gegenfärbung mit Evans-Blau rot angefärbt.
11.2.2 Interpretation der Ergebnisse
Eine positive Diagnose wird gestellt, wenn eine oder mehrere Zellen der fixierten angefärbten Probe die
typische, in Abschnitt 11.2.1 beschriebene Fluoreszenz aufweisen.
Eine negative Diagnose wird gestellt, wenn die fixierten Proben nach Anfärbung mit dem Reagenz keine
Fluoreszenz aufweisen.
Bei direkt angefärbtem nasopharyngealem Absaugsekret oder bei ophthalmischen Proben müssen
mindestens 20 nicht infizierte Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva sichtbar sein, um ein negatives
Ergebnis zu rechtfertigen. Siehe Abschnitt 11.2.3, wenn zu wenig Zellen vorliegen.
11.2.3 Zu wenig Zellen
Falls auf dem Objektträger zu wenig Zellen vorhanden sind, wird der Rest der klinischen Probe 10 Minuten
bei 380 g und Raumtemperatur (15-30 °C) zentrifugiert. Die Zellen werden in einer kleineren Menge PBS
resuspendiert (25 µL), bevor sie wieder in der Vertiefung des Objektträgers aufgebracht werden. Alternativ
hierzu sollte eine neue klinische Probe angefordert werden.
11.3 BESTÄTIGUNG IN DER ZELLKULTUR
11.3.1 Erscheinungsbild Adenovirus-infizierter Zellen
Infizierte Zellen weisen eine intrazelluläre, nukleäre und/oder zytoplasmatische apfelgrüne Fluoreszenz auf
und werden als Adenovirus-positiv registriert.
Nicht infizierte Zellen werden durch Evans-Blau rot gegengefärbt.
11.3.2 Interpretation der Ergebnisse
Eine positive Diagnose wird gestellt, wenn mindestens eine fixierte Zelle nach der Anfärbung das in
Abschnitt 11.3.1 beschriebene Fluoreszenzmuster aufweist.
Ein negatives Ergebnis sollte erst dann registriert werden, wenn in der untersuchten Zellkultur mindestens
50 nicht infizierte Zellen vorliegen. Sollten zu wenig Zellen vorhanden sein, siehe Abschnitt 11.3.3.
11.3.3 Zu wenig Zellen
Falls auf dem Objektträger zu wenig Zellen vorhanden sind, wird der Rest der klinischen Probe 10 Minuten
bei 200 g und Raumtemperatur (15-30 °C) zentrifugiert. Die Zellen werden in einer kleineren Menge PBS
resuspendiert (25 µL), bevor sie wieder in der Vertiefung des Objektträgers aufgebracht werden.
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Alternativ hierzu werden frische Monolayer mit einer neu gewonnenen Probe beimpft und die Zellkultur wird
erneut angelegt.
12 BEGRENZUNGEN DER METHODE
12.1 Nur das mit dem IMAGEN Adenovirus-Test gelieferte Eindeckmedium verwenden.
12.2 Das Erscheinungsbild der erzielten Fluoreszenz kann abhängig vom Typ des Mikroskops und der
benutzten Lichtquelle unterschiedlich sein.
12.3 Es empfiehlt sich, zum Abdecken des gesamten 6 mm großen Testareals 25 µL Reagenz zu
verwenden. Eine Reduzierung dieses Volumens kann zu Schwierigkeiten beim Abdecken der von der
Probe eingenommenen Fläche führen und die Testempfindlichkeit herabsetzen.
12.4 Alle Reagenzien werden in festgelegten Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung kann
beeinträchtigt werden, falls Reagenzien modifiziert oder unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten
Bedingungen gelagert werden.
12.5 Faktoren wie unangemessene Probengewinnung, falsche Probennahme und/oder
Probenhandhabung, Versagen der Zellkultur usw. können dazu führen, dass Adenoviren nicht
nachgewiesen werden. Ein negatives Resultat schließt die Möglichkeit des Vorliegens einer Adenovirus-
Infektion nicht aus.
12.6 Das Vorliegen von Adenoviren in nasopharyngealen Sekreten schließt nicht notwendigerweise die
Möglichkeit einer begleitenden Infektion mit anderen Pathogenen aus. Alle positiven Ergebnisse müssen
immer vorsichtig bewertet werden, da Adenoviren zu Latenz und Rekrudeszenz neigen. Asymptomatische
Freisetzung der Viren (viral shedding) kann bis zu 18 Monate nach erfolgter Infektion stattfinden. 20 Die
Testergebnisse sind zusammen mit verfügbaren Informationen aus epidemiologischen Untersuchungen,
der klinischen Diagnose des Patienten und anderen diagnostischen Verfahren zu interpretieren.
12.7 Die Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit epidemiologischen Informationen, dem klinischen
Erscheinungsbild und anderen diagnostischen Verfahren interpretiert werden.
13 ERWARTETE WERTE
Die verschiedenen Mitglieder der Adenovirus-Subgattungen weisen eindeutig unterschiedliche
Organtropismen auf; trotzdem manifestieren sich die Erkrankungen hauptsächlich als Infektionen des
Respirationstrakts, der Augen und als enterische Infektionen. Der Anteil positiver Isolierungen hängt vom
benutzten Test, einer adäquaten Probengewinnung und der Altersgruppe der getesteten Population ab, und
davon, ob die untersuchten Proben aus Gegenden mit beengten Lebensverhältnissen stammen.
Die Häufigkeit der Isolierung wird zum einen von der Ernsthaftigkeit virusbedingter Erkrankungen und zum
anderen von der Tendenz der Virusstämme beeinflußt, andauernde Infektionen, mit Freisetzung (shedding)
infizierender Viren über längere Zeiträume, zu verursachen.
Bei Kindern unter 4 Jahren sind Adenoviren zu 5 % für akute Infektionen des Respirationstraktes
verantwortlich; in 10 % aller Fälle, in denen Kinder dieser Altersgruppe im Krankenhaus auf
Respirationstraktinfektionen behandelt werden, sind Adenoviren die Ursache. 3,6,7 Bei Kindern kann akute
hämorrhagische Zystitis durch Adenoviren verursacht werden. Es wurde nachgewiesen, dass enterische
Adenoviren an 4 % bis 15 % der Fälle aller hospitalisierten Kinder mit viraler Gastroenteritis beteiligt sind
und besonders bei Kindern unter 3 Jahren vorherrschen. 3,11,12
Augeninfektionen mit Adenoviren (epidemische Keratokonjunktivitis und Schwimmbadkonjunktivitis) können
in allen Altersgruppen vorkommen, genau wie Adenovirus-Infektionen bei immungeschwächten
Patienten. 3,8
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Bei Erwachsenen, insbesondere Angehörigen der Streitkräfte, wurden Adenoviren aus der Zervix und aus
Penisläsionen sowie bei akuten Respirationstraktinfektionen isoliert.
14 SPEZIFISCHE LEISTUNGSKRITERIEN
14.1 REAKTIVITÄT DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS MIT ADENOVIRUS-SEROTYPEN
Der in diesem Test verwendete monoklonale Antikörper reagiert nachweislich mit einem
gattungsspezifischen Epitop des Adenovirus-Hexonproteins, das in allen bekannten Serotypen beim
Menschen vorhanden ist.
14.2 KLINISCHE STUDIEN
Der IMAGEN Adenovirus-Test wurde in zwei klinischen Prüfzentren auf seine Eignung zum
Direktnachweis untersucht; getestet wurden nasopharyngeale Sekrete von Kindern und Erwachsenen, die
wegen Atemwegsinfektionen stationär behandelt wurden. Der Test wurde auch in einer führenden
Augenklinik an Konjunktivalabstrichen von Patienten mit Konjunktivitis ausgewertet. Drei Prüfzentren
bewerteten den IMAGEN Adenovirus-Test zum Nachweis von Adenoviren in Zellkulturen.
In den Prüfzentren wurden 474 klinische Proben des Respirationstrakts und 179 Konjunktivalabstriche im
direkten Verfahren ausgetestet und 296 Proben zur Bestätigung in der Zellkultur. Bei den Standardtests
zum Direktnachweis an Proben handelte es sich um Zellkulturen mit oder ohne indirekte Immunfluoreszenz,
und bei den Standardtests zur Zellkulturbestätigung waren es der indirekte Immunfluoreszenztest mit einem
polyklonalen Antikörper oder ein spezifischer Neutralisationstest.
Bei allen Berechnungen wurde von einer 100%igen Sensitivität und Empfindlichkeit der Standardmethoden
ausgegangen. Empfindlichkeit, Spezifizität und Vorhersagewert wurden wie zuvor beschrieben 21 berechnet.
14.3 KLINISCHE LEISTUNGSFÄHIGKEIT
14.3.1 Direkte Probe
Nasopharyngeale Sekrete
Im Winter 1988/89 wurden frische klinische Proben und eingefrorene Proben, die zwischen 1978 und 1988
gewonnen worden waren, getestet. Die zwei Prüfzentren verglichen den IMAGEN Adenovirus-Test mit
Referenzverfahren. Ein mit der Referenzmethode erhaltenes Ergebnis wurde als positiv bewertet, wenn
entweder Zellkultur oder indirekte Immunfluoreszenz positiv ausfielen. Auf diese Weise war es möglich,
nicht lebensfähige Viren durch Fluoreszenz oder zellfreie Viren durch die Zellkultur nachzuweisen. Mit dem
IMAGEN Adenovirus-Test wurde eine Probe als positiv betrachtet, wenn eine oder mehrere
fluoreszierende Epithelzellen sichtbar waren (siehe Abschnitt 11.2).
Tabelle 14.1 zeigt die Ergebnisse des IMAGEN Adenovirus-Testreagenzes. Die Gesamtzahl der
Adenovirusfälle in diesen Populationen betrug 9,1 % (43/47). Diese Ergebnisse korrelierten in 468 Fällen
mit den Standardmethoden (98,7 %). Die Empfindlichkeit des IMAGEN Adenovirus-Tests betrug 86,0 %
(37/43) und die Spezifität lag bei 100 % (431/431). Die Vorhersagewerte für positive und negative
Ergebnisse betrugen 100 % (37/37) bzw. 98,6 % (431/437).
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Tabelle 14.1 Vergleich der Testergebnisse von IMAGEN Adenovirus-Test und Zellkultur
in 2 Prüfzentren – Durchführung an nasopharyngealen Proben
TEST ERGEBNIS
Zellkultur
IMAGEN Adenovirus
Neg
Neg
Pos
Pos
Pos
Neg
Anzahl der Proben (474) 431 37 6* 0
*1) Von diesen 6 Proben brauchten 4 länger als 10 Tage bis zur Entwicklung des charakteristischen
zytopathischen Effekts in der Zellkultur. Dies kann auf einen sehr niedrigen Antigenspiegel
hinweisen.
2) 2 von diesen 6 Proben waren in der indirekten Immunfluoreszenz negativ.
Ophthalmische Proben
Der IMAGEN Adenovirus Test wurde gegen ein etabliertes Zellkultursystem ausgewertet. Die
Konjunktivalabstriche wurden von 179 Patienten mit einer Konjunktivitis gewonnen, die in einer Augenklinik
behandelt wurden. Die Inzidenz von Adenovirus-Infektionen in der getesteten Populationsgruppe betrug
19,6 % (35/179). Die Ausstriche wurden mit den im Krankenhaus entnommenen Probenabstrichen
hergestellt, die anschließend in ein Transportmedium gegeben wurden, um sie in der Zellkultur
auszutesten. Eine Probe wurde im IMAGEN Adenovirus-Test als positiv bewertet, wenn eine oder
mehrere fluoreszierende Epithelzellen sichtbar waren (siehe Abschnitt 11.2). In der Zellkultur wurde eine
Probe als positiv bewertet, wenn der charakteristische zytopathische Effekt durch die indirekte
Immunfluoreszenz bestätigt wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 2 dargestellt. Von
den 179 getesteten Proben wurde in 174 Fällen mit beiden Methoden ein übereinstimmendes Ergebnis
erzielt, was einer Korrelation von 97,2 % entspricht. Empfindlichkeit und Spezifität des IMAGEN
Adenovirus-Tests betrugen 91,4 % (32/35) bzw. 98,6 % (142/144). Die Vorhersagewerte für positive und
negative Tests betrugen 94,1 % (32/34) bzw. 97,9 % (142/145).
Tabelle 14.2 Vergleich der Testergebnisse von IMAGEN Adenovirus Test und Zellkultur -
humane ophthalmische Proben
TEST ERGEBNIS
Zellkultur
IMAGENAdenovirus
Neg
Neg
Pos
Pos
Pos
Neg
Anzahl der Proben (179) 142 32 3* 2**
* Bei einer Probe konnte keine Wiederholung durchgeführt werden.
** Beide Proben wurden nur 2 Tage kultiviert.
14.2.2 Bestätigung der Zellkultur
In drei Prüfzentren wurde der IMAGEN Adenovirus-Test an Zellkulturen klinischer Proben getestet. Die
Ergebnisse wurden mit der indirekten Immunfluoreszenz und/oder Neutralisationstests zur
Zellkulturbestätigung verglichen. Die Isolierungen wurden auf routinemäßig verwendeten Zelllinien zur
Adenovirus-Zellkultur durchgeführt. Die Zellkulturen wurden in PBS gewaschen bevor sie entfernt und auf
die Objektträger aufgebracht wurden. Die Objektträger wurden in Azeton fixiert und anschließend mit den
Testreagenzien des IMAGEN Adenovirus-Tests getestet. Zu dieser Bewertung wurden sowohl frisch
isolierte als auch zuvor eingefrorene klinische Proben herangezogen. Insgesamt wurden 296 Kulturen
ausgewertet. In der Zellkultur positiv ausgefallene Proben wurden entweder durch Immunfluoreszenz- oder
Neutralisationstests bestätigt.
Die Ergebnisse (Tabelle 14.3) zeigen, dass mit dem IMAGEN Adenovirus-Test alle positiven
Adenovirus-Isolierungen mit einer Empfindlichkeit von 100 % (162/162) nachgewiesen wurden. Die
Spezifizität betrug 100 % (134/134).
Neg
Pos
Neg
Pos
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Tabelle 14.3 Vergleich der Testergebnisse von IMAGEN Adenovirus-Test und
Standardverfahren
- zur Zellkulturbestätigung in 3 Prüfzentren durchgeführt
TEST ERGEBNIS
Standardbestätigungsverfahren
IMAGEN Adenovirus
Neg
Neg
Pos
Pos
Pos
Neg
Anzahl der Proben (296) 134 162 0 0
14.3 KREUZREAKTIVITÄT
Der IMAGEN Adenovirus-Test wurde an Präparationen anderer Viren und Mikroorganismen durchgeführt,
die mit hoher Wahrscheinlichkeit in Atemwegs- oder ophthalmischen Proben oder Zellkulturen vorhanden
sind. Alle getesteten Organismen (Tabelle 4) fielen mit dem IMAGEN Adenovirus-Test negativ aus.
Tabelle 14.4 Mit dem IMAGEN Adenovirus-Test getestete und für nicht reaktiv befundene
Organismen
Acholeplasma laidlawii
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Coxsackie-Virus
Zytomegalie-Virus
Echovirus
Epstein-Barr-Virus
Haemophilus influenzae
Herpes simplex-Virus
Influenza-Virus A & B
Legionella pneumophila
Masernvirus
Mumpsvirus
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinus
Mycoplasma orale
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Neisseria cinerea
Neisseria flavescens
Neisseria gonorrhoea
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis A, B, C & D
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Neisseria pharyngis
Parainfluenza-Virus, Typ 1,2,3 & 4b
Pneumocystis carinii
Poliovirus, Typ 1 & 2
Respiratory Syncytial Virus
Rhinovirus
Staphylococcus aureus
Streptococcus Gruppen A, B, C, D, F, G
Varicella-Zoster-Virus
Neg
Pos
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