Introduction au tri des cellules par cytometrie en flux - incommet
Introduction au tri des cellules par cytometrie en flux - incommet
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FORMATION CYTOMETRIE EN FLUX<br />
28-30 janvier 2013 – INSTM- La Goulette<br />
Applications <strong>en</strong> Microbiologie<br />
Gérald Grégori<br />
Université d’Aix-Marseille<br />
Institut Méditerrané<strong>en</strong> d’Océanographie MIO<br />
Campus de Luminy - Case 901- Bât TPR1 - Entrée F,<br />
13288 Marseille Cedex 9, France<br />
gerald.gregori@univ-amu.fr<br />
http://precym.com.univ-mrs.fr<br />
INCOMMET 2013
Complexité <strong>des</strong> commun<strong>au</strong>tés microbi<strong>en</strong>nes (I)<br />
hétérogénéité taxonomique<br />
Eucaryotes: <strong>cellules</strong> complexes qui possèd<strong>en</strong>t <strong>des</strong> structures organisées<br />
appelées organelles (noy<strong>au</strong>, mitochondries, chloroplastes).<br />
Ex : Protistes, Champignons, Algues.<br />
• Procaryotes: <strong>cellules</strong> simples, dépourvues d’organelle.<br />
Ex : Bacteria, Archaea<br />
• Autotrophes, hétérotrophes, mixotrophes<br />
bâtonnets<br />
Bactéries<br />
coques<br />
Echantillon naturel<br />
vibrilles<br />
INCOMMET 2013
Complexité <strong>des</strong> commun<strong>au</strong>tés microbi<strong>en</strong>nes (II)<br />
hétérogénéité physiologique<br />
• Cellules vivantes<br />
• Cellules mortes<br />
Cellules actives<br />
Cellules inactives<br />
Analyse<br />
individuelle<br />
<strong>des</strong> <strong>cellules</strong><br />
INCOMMET 2013
Observation directe : exemple <strong>des</strong> bactéries<br />
• Microscopie optique<br />
– Limité difficulté à distinguer différ<strong>en</strong>tes sous-populations ou<br />
les bactéries d’<strong>au</strong>tres <strong>par</strong>ticules de taille et de forme similaires.<br />
Streptococcus (800x)<br />
(from http://www.hardin.k12.tn.us/)<br />
• Cultures <strong>en</strong> milieu sélectif<br />
– Plusieurs jours; opérateur(?)<br />
– Efficacité (0.1 à 1% <strong>des</strong> bactéries marines sont cultivables ;<br />
0.1% dans les sols)<br />
Développem<strong>en</strong>t de nouvelles métho<strong>des</strong> directes basées sur les propriétés<br />
optiques plutôt que sur <strong>des</strong> cultures Coloration de composants<br />
cellulaires, activités <strong>en</strong>zymatiques, ou intégrité membranaire (viabilité)<br />
INCOMMET 2013
Intérêt de ces nouvelles approches<br />
• Pour obt<strong>en</strong>ir l’abondance <strong>des</strong> bactéries dans <strong>des</strong> échantillons<br />
naturels Analyse individuelle <strong>des</strong> <strong>cellules</strong><br />
– Mesure immédiate<br />
– Pas besoin de faire <strong>des</strong> cultures (donc plus rapide)<br />
– Image de l’hétérogénéité <strong>des</strong> échantillons prélevés in situ<br />
• Accès <strong>au</strong>x processus métaboliques de la biomasse<br />
bactéri<strong>en</strong>ne active:<br />
– Discrimination <strong>des</strong> <strong>cellules</strong> vivantes & actives, vivantes &<br />
inactives (spores, <strong>cellules</strong> stressées) et <strong>cellules</strong> mortes.<br />
Cytomé<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
INCOMMET 2013
Pourquoi la cytomé<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong> devi<strong>en</strong>t populaire<br />
chez les microbiologistes?<br />
• Analyses rapi<strong>des</strong> (plusieurs dizaines de milliers de <strong>cellules</strong> analysées <strong>par</strong><br />
seconde)<br />
Permet d’analyser un grand nombre de <strong>cellules</strong><br />
Résultats statistiques robustes et représ<strong>en</strong>tatifs<br />
• Analyse multi<strong>par</strong>amé<strong>tri</strong>que à l’échelle individuelle<br />
• Données quantitatives (corrélation avec d’<strong>au</strong>tres données biochimiques)<br />
• Mesures <strong>en</strong> temps réel<br />
• Classes de taille et abondance cellulaire<br />
• Marqueurs uniques:<br />
- naturels (chlorophylle, <strong>au</strong>tres pigm<strong>en</strong>ts <strong>au</strong>tofluoresc<strong>en</strong>ts)<br />
- induits (coloration) fluorochromes (son<strong>des</strong>)<br />
• Tri (post-analyses, cultures)<br />
INCOMMET 2013
Détermination <strong>des</strong> abondances cellulaires:<br />
Mesure du volume analysé<br />
I. Comptage absolu direct <strong>par</strong> le cytomètre<br />
II. Pesée de l’échantillon avant et après l’analyse<br />
Volume analysé<br />
III. Ajout d’un volume précis d’une solution de<br />
microsphères (billes) de conc<strong>en</strong>tration connue<br />
dans l’échantillon<br />
INCOMMET 2013<br />
IV. Détermination de la vitesse de <strong>flux</strong> exacte du<br />
cytomètre avant l’analyse
Utilisation <strong>des</strong> propriétés de diffusion <strong>au</strong>x petits<br />
angles et à 90 degrés.<br />
Pas besoin de coloration<br />
Résolution de groupes et sous-groupes différ<strong>en</strong>ts <strong>en</strong> taille, forme, structure interne<br />
Informations sur la taille <strong>des</strong> <strong>cellules</strong><br />
Dénombrem<strong>en</strong>t<br />
INCOMMET 2013
Diffuion 90° (ua)<br />
Résolution optique <strong>des</strong> bactéries à <strong>par</strong>tir de la<br />
lumière diffusée <strong>par</strong> les <strong>cellules</strong><br />
Diffuion petits angles (ua)<br />
INCOMMET 2013
Utilisation <strong>des</strong> propriétés de diffusion<br />
de la lumière<br />
• Vacuoles Dubelaar et al. 1987<br />
• Bactéries différ<strong>en</strong>ciées Allman et al. 1993<br />
• Taille <strong>des</strong> bactéries Troussellier et al. 1999<br />
INCOMMET 2013
Résolution <strong>des</strong> <strong>cellules</strong> photo<strong>au</strong>totrophes:<br />
Utiliser les propriétés <strong>des</strong> pigm<strong>en</strong>ts naturels<br />
Pas besoin de coloration<br />
Résolution optique <strong>des</strong> micro-organismes<br />
détection, id<strong>en</strong>tification, mise <strong>en</strong> évid<strong>en</strong>ce de sous-groupes<br />
Dénombrem<strong>en</strong>t<br />
INCOMMET 2013
Red fluo. (<strong>au</strong>)<br />
Fluoresc<strong>en</strong>ce rouge (ua)<br />
Autofluoresc<strong>en</strong>ce<br />
Pigm<strong>en</strong>t<br />
Chlorophylle<br />
Phycoerythrine<br />
Phycocyanine<br />
Laser excitation<br />
(nm)<br />
488<br />
488<br />
633<br />
Emission de<br />
fluoresc<strong>en</strong>ce (nm)<br />
>650<br />
575 ; 585<br />
650 ; 660<br />
picoeucaryotes<br />
Synechococcus<br />
Prochlorococcus<br />
INCOMMET 2013<br />
Diffuion 90° (ua)
A v<strong>en</strong>ir : Analyse <strong>des</strong> populations rares<br />
Globally dis<strong>tri</strong>buted uncultivated<br />
oceanic N2-Fixing cyanobacteria<br />
lack oxyg<strong>en</strong>ic Photosystem II<br />
Zehr et al., Sci<strong>en</strong>ce 322:1110-1112<br />
INCOMMET 2013
Résolution <strong>des</strong> <strong>cellules</strong> hétérotrophes<br />
(pas de pigm<strong>en</strong>t photosynthétique)<br />
Besoin de coloration (fluoresc<strong>en</strong>ce induite)<br />
Voir site internet http://www.probes.com/<br />
pour liste <strong>des</strong> colorants (fluorochromes)<br />
- Dénombrem<strong>en</strong>ts<br />
- Viabilité (état physiologique)<br />
- Fonction cellulaire<br />
INCOMMET 2013
Fluoresc<strong>en</strong>ce induite<br />
• Constitu<strong>en</strong>ts Moléculaires<br />
Aci<strong>des</strong> nucléiques<br />
Proteines<br />
Lipi<strong>des</strong><br />
Carbohydrates<br />
Toxines<br />
• Organelles<br />
Noy<strong>au</strong>x<br />
Chloroplastes<br />
Mitochondries<br />
Flagelles<br />
INCOMMET 2013<br />
(Leg<strong>en</strong>dre et al., 1989, Cytometry 10)
Dénombrem<strong>en</strong>t <strong>des</strong> bactéries <strong>par</strong> cytomé<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
INCOMMET 2013
Procaryotes hétérotrophes<br />
(exemple de coloration <strong>des</strong> aci<strong>des</strong> nucléiques)<br />
SYBR Gre<strong>en</strong> I<br />
+ Sous-groupes de bactéries<br />
+ Dénombrem<strong>en</strong>t<br />
(Casotti, 2000)<br />
(M. Veldhuis)<br />
(J.Gasol)<br />
INCOMMET 2013
Toujours plus petit : Résolution <strong>des</strong> Virus<br />
(coloration <strong>des</strong> aci<strong>des</strong> nucléiques)<br />
Culture de M. pusilla<br />
Echantillon naturel (fjord, Norway)<br />
SYBRGre<strong>en</strong> I<br />
D. Marie et al., Curr<strong>en</strong>t Protocols in Cytometry, 1999, Unit 11.11<br />
INCOMMET 2013
Analyse de gran<strong>des</strong> « <strong>par</strong>ticules »<br />
Analyse et <strong>tri</strong> <strong>par</strong> CMF (Moflo, BC)<br />
de filam<strong>en</strong>ts de cyanobactéries de 1063,5 µm<br />
Analyse et <strong>tri</strong><br />
de Pseudanaba<strong>en</strong>a CCY 9704<br />
et Planktothrix rubesc<strong>en</strong>s<br />
van Dijk M., Grégori G. et al. (2010). Optimizing the Setup of a Flow Cytome<strong>tri</strong>c Cell Sorter for Effici<strong>en</strong>t Quantitative Sorting of Long Filam<strong>en</strong>tous<br />
Cyanobacteria. Cytometry 77A: 911924<br />
INCOMMET 2013
Fluorochromes : Analyse individuelle <strong>des</strong> <strong>cellules</strong><br />
Limitation : les fluorochromes doiv<strong>en</strong>t pouvoir pénétrer les <strong>en</strong>veloppes cellulaires<br />
INCOMMET 2013<br />
Joux et al.. Microbes and Infection, 2, 2000, 1523−1535
Son<strong>des</strong> taxonomiques<br />
Id<strong>en</strong>tification de taxons<br />
(jusqu’<strong>au</strong> nive<strong>au</strong> de l’espèce?)<br />
INCOMMET 2013
Différ<strong>en</strong>tes métho<strong>des</strong><br />
- Anticorps fluoresc<strong>en</strong>ts<br />
Target cell<br />
- Son<strong>des</strong> moléculaires a aci<strong>des</strong> nucléiques (ARNr 16s)<br />
Fluorochrome<br />
HRP<br />
Target cell<br />
Target cell<br />
Tyramide<br />
+ Fluorochrome<br />
INCOMMET 2013<br />
FISH<br />
TSA- FISH<br />
Visualisation :<br />
- Microscopie<br />
épifluoresc<strong>en</strong>ce<br />
confocale<br />
- Cytome<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong>
Id<strong>en</strong>tification ( Qui?)<br />
– Développem<strong>en</strong>t de son<strong>des</strong> moléculaires spécifiques pour cibler <strong>des</strong><br />
individus (espèces?) clés (FISH)<br />
– Suivre ces individus dans le milieu naturel (abondances)<br />
– Evaluer comm<strong>en</strong>t ils sont affectés <strong>par</strong> <strong>des</strong> changem<strong>en</strong>ts biotiques et<br />
abiotiques naturels ou anthropiques.<br />
INCOMMET 2013<br />
(Biegala, IRD, Marseille)
Caractérisation physiologique<br />
<strong>des</strong> <strong>cellules</strong> <strong>par</strong> cytomé<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
Viabilité cellulaire<br />
Cellules actives/inactives<br />
Fonction cellulaire<br />
INCOMMET 2013
La viabilité cellulaire?<br />
• Seules les <strong>cellules</strong> viables sont responsables <strong>des</strong><br />
activités mesurées in situ <strong>par</strong> <strong>des</strong> métho<strong>des</strong> globales<br />
• Pourquoi les <strong>cellules</strong> sont viables ou mortes?<br />
Facteurs?<br />
INCOMMET 2013
Une question de vie ou de mort<br />
Bogosian & Bourneuf,2001, EMBO reports Vol.2: 770-774.<br />
INCOMMET 2013
Le concept de viabilité<br />
Rét<strong>en</strong>tion de substrat fluoresc<strong>en</strong>t<br />
Absorption/relargage<br />
de colorant fluoresc<strong>en</strong>t<br />
G . Nebe-von-Caron et al., Journal of Microbiological Methods 42 (2000)<br />
INCOMMET 2013
Test de viabilité<br />
Basé sur l’intégrité membranaire:<br />
• Isole la cellule de son <strong>en</strong>vironnem<strong>en</strong>t<br />
• Régulation <strong>des</strong> ions et <strong>des</strong> échanges de molécules<br />
• Membranes bioénergétiques synthèse d’ATP (énergie)<br />
INCOMMET 2013<br />
Principe:<br />
Double marquage <strong>des</strong> aci<strong>des</strong> nucléiques<br />
Nucleic Acid Double Staining (NADS)<br />
Gregori et al., . Appl. Environ. Microbiol.67: 4662-4670
Principe du double marquage (NADS)<br />
Membranes perméables<br />
<strong>au</strong> SYBR Gre<strong>en</strong><br />
SYBRGre<strong>en</strong><br />
FRET<br />
Si membranes<br />
<strong>en</strong>dommagées<br />
Aci<strong>des</strong> nucléiques<br />
Bactérie<br />
Membrane<br />
externe<br />
Membrane<br />
interne<br />
Si membranes intactes<br />
Propidium iodide (PI)<br />
INCOMMET 2013<br />
Membranes intactes<br />
non perméables <strong>au</strong> PI
Transfert d’énergie de fluoresc<strong>en</strong>ce <strong>par</strong> résonance<br />
(FRET)<br />
distance <strong>en</strong>tre les molecules < 7 nm<br />
A = absorption<br />
E = émission<br />
Donneur d’énergie<br />
(SYBRGre<strong>en</strong>)<br />
Accepteur d’énergie<br />
(PI)<br />
A donor<br />
E donor<br />
A acceptor<br />
E acceptor<br />
INCOMMET 2013<br />
em max.<br />
Longueur d’onde<br />
em max.
Fluoresc<strong>en</strong>ce verte<br />
SYBRGre<strong>en</strong> (<strong>au</strong>)<br />
Viabilité <strong>par</strong> cytomé<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
E.coli<br />
Membranes intactes<br />
Membranes<br />
<strong>en</strong>dommagées<br />
Membranes<br />
compromises<br />
Fluoresc<strong>en</strong>ce rouge<br />
Propidium iodide (<strong>au</strong>)<br />
INCOMMET 2013
Viabilité du phytoplancton<br />
- Le principe du test est basé sur l’intégrité <strong>des</strong> membranes et un colorant <strong>des</strong> ADN<br />
- Le colorant fluoresc<strong>en</strong>t (SYTOX gre<strong>en</strong>) ne pénètre pas les membranes intactes<br />
INCOMMET 2013<br />
(M. Veldhuis)
Discrimination <strong>des</strong> bactéries actives<br />
• Deux types de métho<strong>des</strong> pour détecter les <strong>cellules</strong><br />
métaboliquem<strong>en</strong>t actives:<br />
– Basées sur <strong>des</strong> processus énergie-dép<strong>en</strong>dants<br />
(biosynthèses, pot<strong>en</strong>tiel de membrane, transport de<br />
molécules à travers les membranes, etc.)<br />
– Basées sur <strong>des</strong> processus énergie-indép<strong>en</strong>dants<br />
(activité <strong>en</strong>zymatique)<br />
INCOMMET 2013
Exemple de méthode basée sur <strong>des</strong> processus<br />
énergie-dép<strong>en</strong>dants<br />
INCOMMET 2013<br />
Nebe-von-Caron et al., Journal of Microbiological Methods 42 (2000)
Cycle cellulaire<br />
Limitations:<br />
- Cellules fixées<br />
- Colorant stœchiomé<strong>tri</strong>que<br />
(Courtoisie de M. Veldhuis)<br />
INCOMMET 2013
Exemple de méthode basée<br />
sur <strong>des</strong> processus énergie-indép<strong>en</strong>dants<br />
• Activités <strong>en</strong>zymatiques<br />
– Activité estérase (diacetate de fluorescéine)<br />
(FDA, CFDA, BCECF-AM, Calcein-AM, Chemchrome B)<br />
– Déshydrogénase (CTC)<br />
INCOMMET 2013
Détection de l’activité <strong>des</strong> estérases<br />
INCOMMET 2013<br />
esterases<br />
CFDA<br />
(non fluoresc<strong>en</strong>t)<br />
CF<br />
fluoresc<strong>en</strong>t<br />
Cellule<br />
viable<br />
active
Principe du CFDA (suite)<br />
estérases<br />
CF<br />
fluoresc<strong>en</strong>t<br />
INCOMMET 2013<br />
CFDA<br />
(non fluoresc<strong>en</strong>t)<br />
Cellule morte
Exemple d’analyse <strong>par</strong> cytome<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
combinant CFDA et un <strong>au</strong>tre colorant<br />
Flow Cytome<strong>tri</strong>c Assessm<strong>en</strong>t of Viability of Lactic Acid Bacteria<br />
CFDA<br />
PI<br />
TOTO1<br />
Lactococcus lactis and<br />
Leuconostoc mes<strong>en</strong>teroi<strong>des</strong> cell<br />
susp<strong>en</strong>sions after exposure to<br />
deconjugated bile salts (DBS)<br />
INCOMMET (Bunthof et 2013 al., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,2001, Vol. 67, No. 5)
Activité déshydrogénase<br />
(bactéries qui respir<strong>en</strong>t)<br />
Principe du CTC:<br />
• Le 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) est<br />
reduit <strong>par</strong> les déshydrog<strong>en</strong>ases (<strong>en</strong>zymes de la chaine<br />
respiratoire) <strong>en</strong> un précipité fluoresc<strong>en</strong>t rouge (CTCformazan)<br />
qui peut être détecté à faible conc<strong>en</strong>tration<br />
dans les <strong>cellules</strong><br />
• Indique le fonctionnem<strong>en</strong>t de la chaîne respiratoire<br />
INCOMMET 2013<br />
--- Les échantillons incubés avec le CTC peuv<strong>en</strong>t être fixés et conservés<br />
avant analyse ---
Exemple d’analyse <strong>par</strong> cytomé<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
avec le CTC<br />
Bactéries<br />
totales<br />
Bruit<br />
B- Dénombrem<strong>en</strong>t <strong>des</strong><br />
bactéries totales (marquage<br />
<strong>des</strong> aci<strong>des</strong> nucléiques <strong>au</strong><br />
Picogre<strong>en</strong>)<br />
Bactéries CTC+<br />
D- dénombrem<strong>en</strong>t <strong>des</strong><br />
bactéries CTC+cells<br />
Sieracki et al., Applied and Environm<strong>en</strong>tal Microbiology, 1999, Vol. 65, No. 6<br />
INCOMMET 2013
Activités cellulaires<br />
Exemple : Activité phosphatase alcaline <strong>des</strong> bactéries<br />
hétérotrophes mesurée à l’échelle individuelle <strong>des</strong> <strong>cellules</strong><br />
- Quand le Phosphore inorganique (Pi) devi<strong>en</strong>t un<br />
élém<strong>en</strong>t limitant<br />
Certaines bactéries hydrolys<strong>en</strong>t <strong>des</strong><br />
composés organiques exogène riches <strong>en</strong> phosphate<br />
<strong>en</strong> formes inorganiques utilisables (Pi) via l’activité<br />
phosphatase alcaline (APA).<br />
- Le substrat ELF (Enzyme Labeled Fluoresc<strong>en</strong>ce)<br />
permet de visualiser l’activité APA à l’échelle<br />
cellulaire<br />
INCOMMET 2013
Activité phosphatase alcaline<br />
détectée <strong>par</strong> cytomé<strong>tri</strong>e <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
- Duhamel S., Grégori G., Van Wambeke F., and Nedoma J. (2009). Cytometry 75A Issue 2 : 163 - 168.<br />
- Duhamel S., Grégori G., Van-Wambeke F., Nedoma J. (2009). Curr<strong>en</strong>t Protocols in Cytometry : Unit 11.18<br />
INCOMMET 2013
Est-ce que toutes les métho<strong>des</strong><br />
de mesure de viabilité/activité se val<strong>en</strong>t?<br />
- Echantillon dép<strong>en</strong>dant (Salinité, pH.)<br />
- Dép<strong>en</strong>d <strong>des</strong> <strong>cellules</strong> (la sonde doit pénétrer les <strong>cellules</strong>)<br />
COMBINER PLUSIEURS FLUOROCHROMES POUR<br />
APPREHENDER LA VIABILITE PAR DIFFERENTES<br />
FONCTIONS (les spectres d’émission de fluoresc<strong>en</strong>ce <strong>des</strong><br />
différ<strong>en</strong>ts colorants ne doiv<strong>en</strong>t se recouvrir)<br />
INCOMMET 2013
INCOMMET 2013<br />
Conclusion
Informations nécessaires<br />
sur les assemblages microbi<strong>en</strong>s<br />
• Id<strong>en</strong>tification<br />
– Développem<strong>en</strong>t de son<strong>des</strong> moléculaires spécifiques pour cibler <strong>des</strong> individus<br />
(espèces?) clés (FISH)<br />
– Suivre ces individus dans le milieu naturel (abondances)<br />
– Evaluer comm<strong>en</strong>t ils sont affectés <strong>par</strong> <strong>des</strong> changem<strong>en</strong>ts biotiques et abiotiques<br />
naturels ou anthropiques.<br />
• Viabilité cellulaire<br />
– Seules les <strong>cellules</strong> vivantes sont responsables <strong>des</strong> activités observées in situ<br />
– Meilleure caractérisation <strong>des</strong> facteurs (naturels ou anthropiques) qui influ<strong>en</strong>c<strong>en</strong>t<br />
la viabilité<br />
• Fonction cellulaire<br />
– Son<strong>des</strong> métaboliques pour mettre <strong>en</strong> évid<strong>en</strong>ce l’activité cellulaire (voies<br />
métaboliques, photosynthèse, respiration, activité phosphatase, production<br />
d’aldéhy<strong>des</strong>)<br />
– Détection de la capacité <strong>des</strong> <strong>cellules</strong> à se diviser (crucial pour les risques<br />
sanitaires)<br />
– Caractériser le t<strong>au</strong>x de croissance spécifique <strong>par</strong> espèce (échantillonnage à<br />
h<strong>au</strong>te fréqu<strong>en</strong>ce temporelle et spatiale)<br />
INCOMMET 2013
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