Tri par Cytométrie en flux - incommet
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FORMATION CYTOMETRIE EN FLUX<br />
28-30 janvier 2013 – INSTM- La Goulette<br />
<strong>Tri</strong> <strong>par</strong> cytométrie <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
Gérald Grégori<br />
Université d’Aix-Marseille<br />
Institut Méditerrané<strong>en</strong> d’Océanographie MIO<br />
Campus de Luminy - Case 901- Bât TPR1 - Entrée F,<br />
13288 Marseille Cedex 9, France<br />
gerald.gregori@univ-amu.fr<br />
http://precym.com.univ-mrs.fr<br />
INCOMMET 2013
Intérêt du tri<br />
Echantillon hétérogène<br />
-Diversité spécifique<br />
-Diversité physiologique (ex: cellules vivantes/mortes)<br />
<strong>Tri</strong> <strong>par</strong><br />
Cytométrie <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
- Sé<strong>par</strong>ation physique des cellules d’intérêt<br />
- Conc<strong>en</strong>tration des « cellules moins abondantes »<br />
- Mainti<strong>en</strong> de la viabilité<br />
- Analyses ultérieures<br />
(biologie moléculaire, protéomique)<br />
- Mises <strong>en</strong> culture<br />
- Observation microscopique<br />
INCOMMET 2013
Principes du tri<br />
<strong>par</strong> cytométrie <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
• <strong>Tri</strong> mécanique<br />
• <strong>Tri</strong> électrostatique<br />
• Technique de photo-altération<br />
– toutes les <strong>par</strong>ticules à l’exception des cellules d’intérêt sont<br />
illuminées <strong>par</strong> un faisceau laser pulsé de très haute énergie qui a<br />
pour but de les tuer (destruction de l’ADN)<br />
INCOMMET 2013
Principe du tri mécanique<br />
• Action mécanique pour dévier la portion de liquide<br />
qui conti<strong>en</strong>t la <strong>par</strong>ticule à trier<br />
•Différ<strong>en</strong>ts types :<br />
1973<br />
1991<br />
(Disponible sur BD FACSort)<br />
Un gaz dévie les cellules<br />
non sélectionnées.<br />
Extrait de Practical Flow Cytometry, 4 Ed – H. Shapiro<br />
INCOMMET 2013<br />
(Disponible sur Partec)
Avantages et inconvéni<strong>en</strong>ts<br />
du tri mécanique<br />
• Avantages<br />
– Matériel moins onéreux que le tri électrostatique<br />
– Facilité d’utilisation (pas besoin d’un technici<strong>en</strong> spécialisé)<br />
– <strong>Tri</strong> <strong>en</strong> système clos pas de génération d’aérosol (important pour le tri de<br />
cellules pathogènes)<br />
• Inconvéni<strong>en</strong>ts<br />
– <strong>Tri</strong> peu rapide (<strong>en</strong>viron 300 – 500 cellules/s max.) <strong>en</strong> raison des<br />
contraintes physiques<br />
– Dilution des cellules triées <strong>en</strong> raison du volume de liquide déplacé<br />
– Action mécanique sur les <strong>par</strong>ticules (cellules <strong>en</strong>dommagées?)<br />
INCOMMET 2013
La technologie du tri électrostatique<br />
• Richard Sweet a développé la technologie électrostatique des<br />
imprimantes à jet d’<strong>en</strong>cre.<br />
• Utilisé <strong>par</strong> Mack Fulwyler pour créer un trieur de cellules (1960s).<br />
INCOMMET 2013<br />
Courtoisie de Paul Robinson (PUCL)
Génération de gouttelettes<br />
Impulsion électrique<br />
Cristal piezoelectrique<br />
Volume<br />
d’interrogation<br />
Dernière gouttelette<br />
attachée<br />
1ere gouttelette<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+ +<br />
Délai<br />
(micros)<br />
Point de rupture<br />
du jet<br />
As liquid is ejected into<br />
air, it will form droplets.<br />
By vibrating the nozzle at<br />
a defined frequ<strong>en</strong>cy, the<br />
size of these droplets<br />
and the position along<br />
the stream where they<br />
form can be controlled<br />
with great precision.<br />
INCOMMET 2013<br />
T. Lindmo, D.C. Peters & R.G Sweet - MLM Chapt. 8
INCOMMET 2013<br />
Génération de gouttelettes
Sé<strong>par</strong>ation des gouttelettes<br />
Décision de tri<br />
Petites billes<br />
Grosses billes<br />
488 nm laser<br />
DPA<br />
<strong>Tri</strong> à droite<br />
<strong>Tri</strong> à gauche<br />
Plaques électriques<br />
(haut voltage 4kV)<br />
-<br />
+ +<br />
+<br />
+ +<br />
+ +<br />
+ + - - -<br />
+ + - - -<br />
Fluoresc<strong>en</strong>ce<br />
diffusion a 90°<br />
+<br />
Histogramme<br />
Tubes, plaques,<br />
lames, etc.<br />
INCOMMET 2013<br />
Déchets<br />
(Adapté de P. Robinson, PUCL)<br />
@Que<strong>en</strong>s University, USA
Optimiser la formation des gouttelettes<br />
Ondulation du jet<br />
La vitesse du <strong>flux</strong> dép<strong>en</strong>d de la<br />
pression du liquide de gaine et de la<br />
taille de l’embout de la buse<br />
Dernière goutte attachée<br />
Goutte Satellite<br />
A 60 psi, avec un embout de 70 µm,<br />
la vitesse du <strong>flux</strong> est de 25 m/s<br />
Goutte<br />
INCOMMET 2013<br />
Adapté de<br />
DakoCytomation
Optimiser la formation des gouttelettes<br />
• Le point de rupture du jet doit être optimisé<br />
être le plus près de la buse<br />
• Eviter les gouttelettes satellites<br />
• Travailler à haute fréqu<strong>en</strong>ce<br />
Très nombreuses gouttelettes/s (>> au nombre de<br />
cellules/s)<br />
INCOMMET 2013
Att<strong>en</strong>tion! Formation d’aérosol<br />
Perfetto et. al.,<br />
Cytometry A. 2003 Apr;52(2):122-30<br />
INCOMMET 2013
Formation des gouttelettes<br />
- Fréqu<strong>en</strong>ce et amplitude de vibration<br />
du cristal piézoélectrique -<br />
Amplitude<br />
augm<strong>en</strong>tée (v)<br />
Fréqu<strong>en</strong>ce<br />
augm<strong>en</strong>tée (Hz)<br />
• Amplitude<br />
0 - 135 V<br />
λ<br />
• Fréqu<strong>en</strong>ce<br />
# Gouttes/Sec<br />
0 – 200 000 Hz Gouttes<br />
Augm<strong>en</strong>tation<br />
du nombre<br />
de gouttelettes<br />
INCOMMET 2013<br />
Adapté de<br />
DakoCytomation
Formation des gouttelettes<br />
- Charge électrique des gouttelettes -<br />
- 3000 V + 3000 V<br />
• La déflexion électrostatique agit<br />
sur les gouttes individualisées<br />
• <strong>Tri</strong> 2 voies<br />
– ± 190 volts<br />
+190 V<br />
• <strong>Tri</strong> 4 voies<br />
– ± 190 volts (gauche & droite)<br />
– ± 85 volts (1/2 gauche & 1/2<br />
droite)<br />
INCOMMET 2013<br />
Adapté de<br />
DakoCytomation
Condition hydrodynamique<br />
• Pressions du liquide de gaine / échantillon :<br />
– Pression de l’échantillon toujours supérieure à celle du liquide<br />
de gaine<br />
– Sur MoFlo (Coulter), la différ<strong>en</strong>ce <strong>en</strong>tre les 2 = 0,1 à 0,7 psi (soit<br />
0,007 à 0,05 bars)<br />
– Sur l’Aria (BD), elle est de 0,1 à 1 psi (soit 0,007 à 0,07 bars)<br />
INCOMMET 2013
Différ<strong>en</strong>ts modes de tri (I)<br />
Mode de tri Caractéristique des gouttes Application<br />
Enrichi / <strong>en</strong>richir Essai de ret<strong>en</strong>ir tous les<br />
événem<strong>en</strong>ts positifs sans se<br />
soucier de la prés<strong>en</strong>ce<br />
d’événem<strong>en</strong>ts négatifs<br />
Pureté / purifier<br />
Une seule cellule<br />
Single cell<br />
Mixte<br />
<strong>Tri</strong>e les événem<strong>en</strong>ts positifs<br />
seulem<strong>en</strong>t (<strong>en</strong> l’abs<strong>en</strong>ce<br />
d’événem<strong>en</strong>ts négatifs)<br />
Idem que mode pureté si ce<br />
n’est qu’il accepte seulem<strong>en</strong>t un<br />
seul événem<strong>en</strong>t positif <strong>par</strong><br />
décision de tri<br />
<strong>Tri</strong>e <strong>en</strong> mode pureté à gauche<br />
et tous les événem<strong>en</strong>ts non<br />
ret<strong>en</strong>us à droite<br />
Haut recouvrem<strong>en</strong>t<br />
Haute pureté<br />
Dépôt d’une seule cellule<br />
Haute pureté dans une<br />
direction et recouvrem<strong>en</strong>t<br />
des événem<strong>en</strong>ts positifs<br />
(aborts) non ret<strong>en</strong>us dans<br />
l’autre direction<br />
INCOMMET 2013<br />
Adapté de<br />
DakoCytomation
Différ<strong>en</strong>ts modes de tri (II)<br />
Pureté<br />
R<strong>en</strong>dem<strong>en</strong>t<br />
Cellules exclues<br />
du tri<br />
Single<br />
99 - 100 %<br />
Purifier<br />
95 %<br />
Enrichir<br />
65-85 %<br />
INCOMMET 2013<br />
Adapté de<br />
DakoCytomation
De l’importance des rapports<br />
des pressions<br />
Pression (PSI) :<br />
70um<br />
70um<br />
Echantillon<br />
60.3<br />
61.5<br />
Liquide de gaine<br />
60.0<br />
60.0<br />
Risque<br />
de doublets!<br />
• Bon r<strong>en</strong>dem<strong>en</strong>t<br />
• R<strong>en</strong>dem<strong>en</strong>t moy<strong>en</strong><br />
• Volume trié correct<br />
• Faible volume trié<br />
• Nombre d’aborts<br />
faible<br />
• Nombre d’aborts<br />
important<br />
INCOMMET 2013<br />
Adapté de<br />
DakoCytomation
3 Règles fondam<strong>en</strong>tales pour le tri<br />
1) Pression différ<strong>en</strong>tielle échantillon / liquide de gaine<br />
(pression éch.>pression liquide de gaine)<br />
2) [ Echantillon/ml ] = Vitesse X 1000<br />
Ex: Si tri à 40 000 événem<strong>en</strong>ts/sec, il faut un<br />
échantillon où 40 millions de cellules/ml<br />
3) Diamètre de la buse / diamètre de la cellule<br />
= 3 à 5 fois supérieur<br />
INCOMMET 2013<br />
Adapté de<br />
DakoCytomation
Avantages et inconvéni<strong>en</strong>ts<br />
du tri électrostatique<br />
• Avantages<br />
– Très rapide (jusqu’à 70 000 cellules triées <strong>par</strong> seconde)<br />
– Peu de dilution des cellules (faible volume des<br />
gouttelettes)<br />
– Pas d’action mécanique sur les cellules<br />
– <strong>Tri</strong> sur plusieurs voies<br />
– Viabilité cellulaire<br />
• Inconvéni<strong>en</strong>ts<br />
– Prix<br />
– Système ouvert (formation d’aérosol)<br />
– Stabilité/s<strong>en</strong>sibilité (s<strong>en</strong>sible à température)<br />
– Mise au point (requiert un technici<strong>en</strong> expérim<strong>en</strong>té)<br />
INCOMMET 2013
Exemple d’application du tri (I)<br />
Echantillon marin<br />
- Sé<strong>par</strong>ation physique des<br />
cellules d’intérêt<br />
- Observation visuelle<br />
(microscopie)<br />
- Conc<strong>en</strong>tration des « cellules<br />
moins abondantes »<br />
- Mises <strong>en</strong> culture<br />
INCOMMET 2013<br />
Marcus Reckermann,<br />
Research and Technology<br />
C<strong>en</strong>tre Westcoast (FTZ)<br />
at Büsum (Kiel University)
Exemple d’application du tri (2)<br />
Id<strong>en</strong>tification d’une<br />
nouvelle population<br />
<strong>Tri</strong>chomes libres<br />
Li et al. (2012). Possible bloom of free<br />
trichomes in the Bay of Marseille, NW<br />
Mediterranean Sea : an anomaly evid<strong>en</strong>ced by<br />
flow cytometry. J. Plankton Res. 34 (8) : 711-718<br />
INCOMMET 2013
Fluo. rouge (au)<br />
Exemple d’application du tri (II)<br />
Echantillon hétérog<strong>en</strong>e<br />
Analyse <strong>par</strong> cytométrie <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
<strong>Tri</strong><br />
Diff. 90°(au)<br />
Analyses ultérieures<br />
Biologie moléculaire<br />
(génomique, protéomique)<br />
INCOMMET 2013 Bernas T, Gregori G, Asem EK, et Robinson JP (sous presse). Integrating cytomics and proteomics. MCP
Conclusion<br />
Génomique<br />
Protéomique<br />
<strong>Tri</strong> <strong>par</strong><br />
cytométrie <strong>en</strong> <strong>flux</strong><br />
Cellule<br />
(cytomique)<br />
Isolem<strong>en</strong>t<br />
- Culture<br />
- Observation<br />
Relation structure/fonction<br />
INCOMMET 2013
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