THESE UNIQUE El Hassane Kéhien-Piho TOU - Nutridev

Matériels et méthodes
III.2.2. Préparation des échantillons et ensemencement
Avant la préparation des solutions mères, les échantillons prélevés sont d’abord homogénéisés
à l’aide d’un ultraturrax à tige stérilisée et à 10000 tours/min. La solution mère utilisée est
préparée de la manière suivante:
- Pipeter aseptiquement 1ml de l’échantillon à analyser
- Ajouter l’échantillon (1ml) dans des tubes à vis contenant environ 9ml de diluant
autoclavé
- Homogénéiser le mélange à l’aide d’un vortex. Cet homogénat a constitué la solution
mère à une concentration de 10 -1 .
Dilution en cascade
On a réalisé à partir des solutions mères des dilutions décimales en cascade dans de l’eau
physiologique.
Ensemencement
La technique utilisée a été l’ensemencement par étalement de 0,1ml de la dilution de
suspension microbienne dans chaque boîte contenant le milieu MRS gélosé.
Incubation
Les boîtes de pétri étiquetées ont ensuite été incubées 48h à 30°C, voire 72 h si nécessaire.
Pour les levures, l’incubation s’est déroulée à 37°C pendant 72 h et pour la microflore totale à
37°C pendant 48 h.
Dénombrement des colonies
Les boîtes de pétri contenant des nombres de colonies compris entre 30 et 300 sont retenues
pour la numération, deux boîtes de Pétri sont comptées par dilution.
III.2.3. Repiquage, purification et conservation des colonies
Nous avons repiqué dans chaque tube contenant du bouillon MRS une colonie. Le nombre de
colonies prélevées au hasard par boîte est la racine carrée de N colonies (N=nombre total de
colonies sur la boîte compris entre 100 et 300). Les tubes sont ensuite mis à incuber pendant
12 à 24 h (selon la croissance obtenue) à 30°C. Une seconde étape de purification est
effectuée par des ensemencements par stries. Pour la conservation, une fraction de la culture
liquide pure a été prélevée pour être distribuée dans 5 cryotubes stériles à raison de 0,5 ml par
cryotube auxquels sont additionnés 0,5 ml d’une solution stérile de glycérol à 50 %. La
conservation a été faite au congélateur à – 80°C.
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