Oncognse des tumeurs respiratoires et urognitales - Service d ...

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GETU actuellement en cours. L’obtention de ces cellules nous permettra d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes moléculaires mis en jeux par la protocadhérine-PC pour permettre aux cellules tumorales de résister à l’apoptose induite par le traitement hormonal. b– Identifier les mécanismes moléculaires associés à la surexpression de la protocadhérine-PC Pour déterminer les gènes qui pourraient être régulés par la protocadhérine-PC et qui participeraient à la progression tumorale et à l’échappement hormonal, nous envisageons d’utiliser la technique des puces à ADN. Nous comparerons le niveau d’expression des gènes des cellules surexprimant la protocadhérine-PC (LNCaP-TR, SSR, LNCaP-T6-2) comparé à la lignée parentale LNCaP. Selon les résultats obtenus, nous utiliserons ensuite les cellules contenant le système inductible de la protocadhérine-PC pour étudier la régulation des gènes cibles qui auraient été identifiés. Ces données devraient nous permettre de mieux comprendre les fonctions de la protocadhérine-PC et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour l’analyse du transcriptome seront utilisés les puces U133A et U133B avec au minimum 10 microgrammes d’ARN par échantillon. Les données du transcriptome et du génome seront analysées en collaboration avec les services de l’Institut Curie, de Statistiques (Directeur Bernard Asselain) et de Bioinformatique (Directeur Emmanuel Barillot). c– Mise au point des protocole pour inhiber l'expression du gène de la protocadhérine-PC Nos études ont démontrés une surexpression de la protocadhérine PC dans le cancer en échappement hormonal. L’inhibition de l’expression de cette protéine constitue donc une approche thérapeutique potentielle. Pour cela nous envisageons de développer l’approche d’interférence d’ARN pour inhiber l'expression de cette molécule et de bloquer ainsi ses fonctions. L’interférence d’ARN consiste en un mécanisme d’inhibition spécifique des gènes. Ce phénomène est provoqué par l’activation du complexe RISC (RNA-induced silencing complex) qui clive un ARNm cible empêchant donc sa traduction. Ce complexe est activé par des siRNA (small interfering ARN) qui sont de courts oligonucléotides double brins de 21 nucléotides environ et dont l’extrémité 3’ est libre sur 2 nucléotides Pour réprimer l'expression de la protocadhérine PC, nous utiliserons dans un premier temps les cellules LNCaP-TR et SSR pour la mise au point des séquences de nucléotides permettant d'inhiber spécifiquement l'expression de la cette protéine. Le design des séquences ainsi que leur synthèse seront confiés à la société Dharmacon Reseach. Plusieurs siRNA seront testés afin de définir la séquence la plus efficace. L’inconvénient de l’interférence par des siRNA est que le phénomène ne dure pas plus de 48h à 72h. A ce stade, il reste toujours de la protéine endogène. Pour surmonter ce problème, nous construirons, dans un second temps, des vecteurs d’expression permettant de produire des shRNA (transcrits RNA sous forme d’épingle à cheveux qui seront ensuite clivés par le complexe DICER pour aboutir à des siRNA). Ces vecteurs seront ensuite transfectées dans les cellules LNCaP- TR et SSR pour évaluer leur efficacité de bloquer l’expression de la protocadhérine PC à long terme. Nous envisageons également de construire des vecteurs d’expression de shRNA. d- Production et fonctions des anticorps monoclonaux anti-protocadhérine-PC Nous avons obtenu un anticorps monoclonal (clone C32) reconnaissant spécifiquement la protocadhérine-PC sur tissus prostatiques humains et par ELISA. D’autres souris sont actuellement en cours d’immunisation. Nous espérons ainsi obtenir de nouveaux anticorps reconnaissant différents épitopes de la molécule. L’obtention de ces anticorps nous permettra de développer notre projet de recherche sur l’étude des mécanismes d'action de la protocadhérine PC, mais aussi d'évaluer la protocadhérine-PC comme marqueur biologique du cancer de la prostate. e- Evaluation de l’effet des anticorps anti-protocadhérine-PC sur des cellules tumorales prostatiques Une des étapes de la caractérisation de la fonction de la protocadhérine-PC passe par l’étude de l’effet de la présence des anticorps anti-protocadhérine-PC sur le développement et la croissance in vitro et in vivo des cellules résistantes à l’apoptose (LNCaP-TR et -SSR). Il est donc prévu d’étudier dans un premier temps, le comportement de ces cellules cultivées en présence des anticorps ou microinjectées avec ces protéines et d’évaluer leur sensibilité plus accrue aux différents stimuli apoptotiques. 6
GETU f- Mise au point d’un dosage ELISA de la Protocadhérine-PC La poursuite de l’obtention d’anticorps monoclonaux sera de mettre au point un dosage ELISA. Nous disposons un appareil, le BIAcore, nous permettant d'analyser l'affinité des anticorps vis-à-vis de la protocadhérine-PC et de les sélectionner ensuite en fonction de leur reconnaissance aux différents épitopes. Cette première étape nous permettra d'isoler les anticorps intéressants qui seront ensuite utilisés dans la mise au point du test d'ELISA. L'anticorps ayant la meilleure affinité vis-à-vis de la protocadhérine-PC sera fixé sur plaque de 96 puits et utilisé pour la capture de la protéine recombinante. Après lavage des protéines non fixées, la détection du complexe antigène/anticorps se fera par l'incubation avec un mélange de plusieurs anticorps monoclonaux biotinylés, suivie d'une étape de révélation avec de la streptavidine couplée à un traceur fluorescence. g- Création d’une banque de Tissue MicroArrays La technique des tissue microarrays est un outil performant, rapide et rentable pour étudier l’intérêt clinique des nouvelles molécules Elle a pour finalité de concentrer sur 1 lame plusieurs centaines d’échantillons pouvant provenir de plusieurs centaines de patients différents (voir principe ci après). Nous avons entrepris, sur la cohorte de patients du service d’urologie de l’Hôpital Henri Mondor, en collaboration avec le service d’anatomopathologie, de réaliser une puce à tissu comprenant 30 échantillons d’adénome de la prostate obtenus après résection transuréthrale de la prostate ou adénomectomie, 250 tissus de cancer de la prostate au stade localisé (après prostatectomie radicale par voie coelioscopique ou par voie rétropubienne) et 50 tissus de patients présentant un cancer de la prostate en hormono-échappement ayant bénéficié d’une résection transuréthrale de la prostate pour obstacle sous vésical. Pour chacun de ces patients, les données cliniques et anatomopathologiques sont collectées sur fichier informatisé anonymisé qui a permis l’évaluation des différentes techniques chirurgicales utilisées dans le service d’urologie. h- Place de la protocadhérine-PC dans le cancer de la prostate en échappement hormonal La comparaison de l’expression de la protocadhérine-PC aux autres molécules impliquées dans le cancer de la prostate en échappement hormonal sera étudiée par RT-PCR quantitative et/ou immunohistochimie. Les transcrits concernés sont ceux : du récepteur des androgènes ; des familles de facteurs de croissance et de leurs récepteurs comme EGF, FGF, IGF et HARP ; certains marqueurs neuroendocriniens comme l’adrénomédulline, des marqueurs des gènes de résistance à l’apoptose comme bcl2 et la clustérine. IV.1. 2. Oncogénèse urothéliale. D., Chopin, J.L Lagrange, D. Vordos Deux types de recherches sont développées : • l’utilisation de modèles in vitro pour évaluer de nouvelles thérapeutiques • l’étude des altérations moléculaires et génétiques des tumeurs urothéliales dans un but étiopathogénique et pronostique IV.1. 2.1 - Modèles in vitro de culture de l'urothélium Nous avons étudié la croissance, la différentiation et la sénescence de l'urothélium humain normal dans un modèle de culture pseudo organo typique. Des explants d'urothélium humain normal ont été micro disséqués et placés sur des membranes semi poreuses prétraitées par différents composants de la matrice extra cellulaire avec un milieu défini. Ces cultures ont été maintenues pour une durée de 30 jours pendant laquelle nous avons étudié la prolifération cellulaires par l'incorporation de Brdu, la différentiation par l'expression des cytokératines et de l'uroplakine. Nous avons également étudié l'expression des facteurs de croissance de la famille de l'EGF par RT-PCR quantitative, ainsi que la sénescence en mesurant l'expression des transcrits de p16 et l'activité β-galactosidase endogène, Utilisant le collagène 4 qui est le composant de la matrice le plus efficace. Nous pouvons utiliser ce modèle à l'état d'équilibre du 15 ème au 30 ème jour. Dans les 15 premiers jours, on un pic de prolifération(15%) qui s'associe à la production d'HB-EGF d'amphiréguline et de TGF-α. A partir du 15 ème jour la prolifération retombe à 3 à 5 %. L'expression des cytokératines et de l'uroplakine est stable a confluence. Une activité significative de sénescence apparaît à J.25. Ces résultats montrent que ce modèle maintient les caractéristiques de l'urothélium humain in vivo et peut être utilisé entre le 15 ème et le 25 ème jour. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour étudier l'implication des facteurs de croissance de la famille de l'EGF et celle du récepteur à l'EGF au cours de la cicatrisation urothéliale. Les mécanismes de cicatrisation étant en partie impliqués et déviés au cours de la cancérogenèse 7
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