Oncognse des tumeurs respiratoires et urognitales - Service d ...

GETU
Etapes du projet et Bases Méthodologiques
L’objectif général de ce projet est de caractériser sur le plan moléculaire et génétique, les tumeurs
urothéliales de la vessie au diagnostic initial en fonction de l’intoxication tabagique et de l’exposition
professionnelle.
Les objectifs spécifiques sont :
1. d’identifier des mécanismes exogènes et endogènes de carcinogenèse vésicale en fonction des
mutations de p53 et de FGFR3
2. de caractériser d’autres altérations génétiques ou moléculaires connues ou non, en fonction des
expositions et du génotype p53/ FGFR3 par l’utilisation des techniques d’analyse à haut débit :
puce a tissus, puce à ADN (transcrits et CGH)
3. d’identifier des signatures d’exposition professionnelles et ou de l’intoxication tabagique, et de
disposer de marqueurs étiologiques
4. d’améliorer la prise en charge de ces tumeurs par une classification moléculaire tenant
également compte des facteurs étiologiques.
La Méthodologie
Collection biologique, caractéristiques anatomocliniques, épidemiologiques et analyses :
Les données clinico-pathologiques (endoscopiques et histologiques) ont fait l’objet d’un consensus
urologique et anatomopathologique dans le cadre du Comité de Cancérologie de l’Association
Française d’Urologie, résumé dans le rapport de l’AFU sur les tumeurs superficielles rédigé en 2001
par D Chopin et B Gattegno. L’ensemble de ces variables codées de façon exclusive est relevé sur une
base de données relationnelle anonymisée.
Les données épidémiologiques font l’objet d’un questionnaire standardisé recueilli auprès des patients
par des enquêteurs et sont analysées en aveugle par une équipe de Médecine du Travail, de l'Institut
Inter Universitaire de Médecine du Travail de Paris, Ile de France.
Tumorothèque : Ce projet s’appuie donc sur la constitution d’une banque de tissus et de sang total. Les
prélèvements proviennent de trois hopitaux : Bichat, Tenon et Henri Mondor. Ils sont centralisés dans
le cadre de la tumorothéque des services de pathologie respective. Actuellement nous utilisons une
technique de triple extraction qui permet d’isoler, à partir d’un même prélèvement broyé dans le
thiocyanate de guanidine, à l'aide d'un gradient de chlorure de césium, l’ADN, l’ARN et les protéines.
L’isolement de l’ADN contrôle est réalisé à partir du sang total. Cette méthodologie nous permet
d’avoir accès non seulement aux anomalies de l’ADN, mais également à l’ARN et pour une partie aux
protéines. L’inconvénient de cette technique est son coût en consommables et temps technique.
Cependant la qualité d’obtention du matériel permet la conservation et le transport des échantillons
dans les différents laboratoires impliqués dans l’étude.
Mutations : Les tumeurs utilisées dans ce projet seront génotypées pour P53 et FGFR3 qui
caractérisent deux voies spécifiques de carcinogenèse utilisant la technique de DHPLC. Après
amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), nous avons réalisé une PCR
de l’ADN tumoral et génomique pour chaque prélèvement et pour chaque exon étudié. Dans le cas de
P53, nous avons étudié les exons 2 à 11 et en ce qui concerne le FGFR3, les exons 7, 10 et 15. En ce
qui concerne les mutations de P53, on utilise une matrice de 100 nanogrammes de l’ADN génomique.
Les amorces utilisées dans l’étude des mutations du gène P53 et FGFR3 ont fait l’objet de
publications.
Utilisation des Puces à ADN : L'analyse des nouveaux gènes potentiellement impliqués dans les
groupes de tumeurs que nous avons définis sera effectuée dans le cadre de la plateforme de l’IFR10 de
Créteil. Pour l’analyse du transcriptome, les puces Affymetrix U133 Plus seront utilisées avec 5 µg
d’ARN par échantillon. Pour l’analyse du génome, nous utiliserons les puces CGH produites par le
laboratoire de Dan Pinkel UCSF, les expériences que nous avons déjà effectuées sur quarante
échantillons montrent que 300ng d’ADN par hybridation sont suffisants.
Tissu Micro-Arrays/Immunohistochimie : La constitution de tissu micro-array apparaît comme
indispensable pour évaluer rapidement les gènes candidats identifiés par les puces à ADN. On
considère que 3 prélèvements par tumeurs sont souhaitables pour avoir un échantillon représentatif.
Les analyses immunohistochimiques seront dans certains cas particuliers effectuées sur coupes
congelées. Nous étudierons en particulier les voies de signalisation des EGFs (ligands, récepteurs).
12