Oncognse des tumeurs respiratoires et urognitales - Service d ...
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GETU<br />
Etapes du proj<strong>et</strong> <strong>et</strong> Bases Méthodologiques<br />
L’objectif général de ce proj<strong>et</strong> est de caractériser sur le plan moléculaire <strong>et</strong> génétique, les <strong>tumeurs</strong><br />
urothéliales de la vessie au diagnostic initial en fonction de l’intoxication tabagique <strong>et</strong> de l’exposition<br />
professionnelle.<br />
Les objectifs spécifiques sont :<br />
1. d’identifier <strong>des</strong> mécanismes exogènes <strong>et</strong> endogènes de carcinogenèse vésicale en fonction <strong>des</strong><br />
mutations de p53 <strong>et</strong> de FGFR3<br />
2. de caractériser d’autres altérations génétiques ou moléculaires connues ou non, en fonction <strong>des</strong><br />
expositions <strong>et</strong> du génotype p53/ FGFR3 par l’utilisation <strong>des</strong> techniques d’analyse à haut débit :<br />
puce a tissus, puce à ADN (transcrits <strong>et</strong> CGH)<br />
3. d’identifier <strong>des</strong> signatures d’exposition professionnelles <strong>et</strong> ou de l’intoxication tabagique, <strong>et</strong> de<br />
disposer de marqueurs étiologiques<br />
4. d’améliorer la prise en charge de ces <strong>tumeurs</strong> par une classification moléculaire tenant<br />
également compte <strong>des</strong> facteurs étiologiques.<br />
La Méthodologie<br />
Collection biologique, caractéristiques anatomocliniques, épidemiologiques <strong>et</strong> analyses :<br />
Les données clinico-pathologiques (endoscopiques <strong>et</strong> histologiques) ont fait l’obj<strong>et</strong> d’un consensus<br />
urologique <strong>et</strong> anatomopathologique dans le cadre du Comité de Cancérologie de l’Association<br />
Française d’Urologie, résumé dans le rapport de l’AFU sur les <strong>tumeurs</strong> superficielles rédigé en 2001<br />
par D Chopin <strong>et</strong> B Gattegno. L’ensemble de ces variables codées de façon exclusive est relevé sur une<br />
base de données relationnelle anonymisée.<br />
Les données épidémiologiques font l’obj<strong>et</strong> d’un questionnaire standardisé recueilli auprès <strong>des</strong> patients<br />
par <strong>des</strong> enquêteurs <strong>et</strong> sont analysées en aveugle par une équipe de Médecine du Travail, de l'Institut<br />
Inter Universitaire de Médecine du Travail de Paris, Ile de France.<br />
Tumorothèque : Ce proj<strong>et</strong> s’appuie donc sur la constitution d’une banque de tissus <strong>et</strong> de sang total. Les<br />
prélèvements proviennent de trois hopitaux : Bichat, Tenon <strong>et</strong> Henri Mondor. Ils sont centralisés dans<br />
le cadre de la tumorothéque <strong>des</strong> services de pathologie respective. Actuellement nous utilisons une<br />
technique de triple extraction qui perm<strong>et</strong> d’isoler, à partir d’un même prélèvement broyé dans le<br />
thiocyanate de guanidine, à l'aide d'un gradient de chlorure de césium, l’ADN, l’ARN <strong>et</strong> les protéines.<br />
L’isolement de l’ADN contrôle est réalisé à partir du sang total. C<strong>et</strong>te méthodologie nous perm<strong>et</strong><br />
d’avoir accès non seulement aux anomalies de l’ADN, mais également à l’ARN <strong>et</strong> pour une partie aux<br />
protéines. L’inconvénient de c<strong>et</strong>te technique est son coût en consommables <strong>et</strong> temps technique.<br />
Cependant la qualité d’obtention du matériel perm<strong>et</strong> la conservation <strong>et</strong> le transport <strong>des</strong> échantillons<br />
dans les différents laboratoires impliqués dans l’étude.<br />
Mutations : Les <strong>tumeurs</strong> utilisées dans ce proj<strong>et</strong> seront génotypées pour P53 <strong>et</strong> FGFR3 qui<br />
caractérisent deux voies spécifiques de carcinogenèse utilisant la technique de DHPLC. Après<br />
amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), nous avons réalisé une PCR<br />
de l’ADN tumoral <strong>et</strong> génomique pour chaque prélèvement <strong>et</strong> pour chaque exon étudié. Dans le cas de<br />
P53, nous avons étudié les exons 2 à 11 <strong>et</strong> en ce qui concerne le FGFR3, les exons 7, 10 <strong>et</strong> 15. En ce<br />
qui concerne les mutations de P53, on utilise une matrice de 100 nanogrammes de l’ADN génomique.<br />
Les amorces utilisées dans l’étude <strong>des</strong> mutations du gène P53 <strong>et</strong> FGFR3 ont fait l’obj<strong>et</strong> de<br />
publications.<br />
Utilisation <strong>des</strong> Puces à ADN : L'analyse <strong>des</strong> nouveaux gènes potentiellement impliqués dans les<br />
groupes de <strong>tumeurs</strong> que nous avons définis sera effectuée dans le cadre de la plateforme de l’IFR10 de<br />
Créteil. Pour l’analyse du transcriptome, les puces Affym<strong>et</strong>rix U133 Plus seront utilisées avec 5 µg<br />
d’ARN par échantillon. Pour l’analyse du génome, nous utiliserons les puces CGH produites par le<br />
laboratoire de Dan Pinkel UCSF, les expériences que nous avons déjà effectuées sur quarante<br />
échantillons montrent que 300ng d’ADN par hybridation sont suffisants.<br />
Tissu Micro-Arrays/Immunohistochimie : La constitution de tissu micro-array apparaît comme<br />
indispensable pour évaluer rapidement les gènes candidats identifiés par les puces à ADN. On<br />
considère que 3 prélèvements par <strong>tumeurs</strong> sont souhaitables pour avoir un échantillon représentatif.<br />
Les analyses immunohistochimiques seront dans certains cas particuliers effectuées sur coupes<br />
congelées. Nous étudierons en particulier les voies de signalisation <strong>des</strong> EGFs (ligands, récepteurs).<br />
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