Oncognse des tumeurs respiratoires et urognitales - Service d ...
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GETU<br />
Groupe d’Etude <strong>des</strong> Tumeurs Urologique GETU<br />
Centre de Recherches Chirurgicales <strong>et</strong> <strong>Service</strong> d’Urologie<br />
__________________<br />
Affiliation actuelle : INSERM EMI 03 37<br />
"Oncogénèse <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> <strong>respiratoires</strong> <strong>et</strong> urogénitales"<br />
Le GETU est la structure de recherche qui anime l’activité scientifique du service d’Urologie de<br />
l’hôpital Henri Mondor .C<strong>et</strong>te structure accueille au sein de l’AP-HP <strong>des</strong> urologues en formation dans<br />
le cadre du DEA de Sciences chirurgicale ainsi que <strong>des</strong> chirurgiens d’universités hors de l’Ile de<br />
France <strong>et</strong> <strong>des</strong> chercheurs étrangers. Ce groupe de recherche a pris naissance au Centre de Recherches<br />
Chirurgicales en 1984, <strong>et</strong> a depuis obtenu plusieurs reconnaissances dans le cadre <strong>des</strong> EPST : (EA<br />
Paris XII, Formation associé <strong>et</strong> puis Centre Claude Bernard, EMI INSERM. Le groupe appartient a<br />
l’IFR10 (IM3) <strong>et</strong> est un <strong>des</strong> membres fondateurs du futur Centre de Recherche de l’INSERM dans le<br />
cadre d’un département d’immuno-oncologie. Une part importante de l’activité d’enseignement <strong>et</strong> de<br />
recherche du service d’urologie se déroule effectivement au CRCHM. <strong>et</strong> son objectif est de soutenir<br />
l’activité clinique d’oncourologie y compris les aspects fonctionnels <strong>et</strong> mini invasifs de la chirurgie<br />
oncologique <strong>et</strong> de former les cadres de la discipline.<br />
L’Urologie est impliquée au CRCHM dans :<br />
1° Une activité d’Enseignement <strong>des</strong> Techniques Laparoscopiques,<br />
responsable Professeur CC Abbou, participants : docteur Salomon, docteur Hoznek<br />
2° Des activités de recherche :<br />
• La plus importante étant l’Oncologie Urologique, dirigée par le Professeur D Chopin, dans le<br />
cadre de l'EMI INSERM 03-37.<br />
• Une activité centrée sur la thérapie Tissulaire de l’incontinence urinaire, proj<strong>et</strong> émergeant dont le<br />
responsable est le Docteur R. Yiou (c<strong>et</strong>te activité s'appuie sur deux EMI Inserm, celle du<br />
Professeur D Chopin <strong>et</strong> celle du Professeur Gherardi Inserm E.00-11)<br />
• Une activité d'évaluation <strong>et</strong> de recherche <strong>des</strong> techniques laparoscopiques <strong>et</strong> robotisées, activité<br />
dirigée par le Professeur Abbou <strong>et</strong> le animée par le docteur Salomon <strong>et</strong> le docteur P. Anthiphon,<br />
chirurgien en activité libérale.<br />
Formation assurée par le GETU - 2000 - 2004<br />
NOM DEA THESE IHP CCA POSITION ACTUELLE<br />
3° cycle HM HM<br />
PATARD J.J. 1996, Urologie oui PU-PH CHRU Rennes, 2004<br />
SAINT F. 2001, Urologie oui oui PU-PH Amiens, 2004<br />
de la TAILLE A. 2001, Urologie oui oui AP- HP Henri Mondor<br />
VORDOS V. En thèse, Urologie oui oui AP-HP Henri Mondor<br />
QUINTELA R. 2002 non oui Privé Brésil<br />
WALLERAND H. en thèse, Urologie UCLA USA<br />
ZINI L. 2003 en thèse, Urologie Interne CHRU de Lille<br />
LECOEUR C. 2004 Vétérinaire<br />
SWIEB S. 2004 Interne étranger Henri Mondor<br />
DAHER A. 2002 Maître de Conférence Univ.Beyrouth<br />
LE FRERE BELDA, MA 2003, Pathologie oui PH Pathologie HEGP
GETU<br />
Membres de l'Equipe (mai 2004)<br />
NOM Statut ETP<br />
ABBOU Claude PU-PH, Urologie Paris XII 0,3<br />
CHOPIN Dominique PU-PH, Urologie Paris XII 0,5<br />
LAGRANGE Jean-Léon PU-PH, Radiothérapie, Paris XII 0,3<br />
JOUAULT Hélène MCU-PH Université Paris XII 0,3<br />
KOUYOUMDJIAN J.Claude MCU-PH, Université Paris XII 0,3<br />
FIET Jean Faculté Pharmacie, Paris V 1<br />
VACHEROT Francis MC Université Paris XII 0,3<br />
ALLORY yves AHU Pathologie 0,3<br />
DE LA TAILLE Alexandre CCA Urologie 0,3<br />
VORDOS Dimitri CCA Urologie 0,3<br />
HOZNEK Andras PH Urologie 0,3<br />
SALOMON Laurent PH Urologie 0,3<br />
GIL DIEZ DE MEDINA Sixtina PH Urologie 1<br />
MAILLE Pascale IE Contractuelle AP-HP (Claude Bernard) 1<br />
SOYEUX Pascale Agent technique contractuelle Université 1<br />
HUGUENIN Sandra Thèse, Univ. Paris XII 1<br />
BAKKAR Ashraf Thèse, Univ. Paris XI 1<br />
NICOLLE Gaëlle Thèse, Univ. Paris XII 1<br />
SOARES QUERIRES Luis Thèse, Univ. Paris XIII 1<br />
WALLERAND Hervé Thèse, Univ. Paris XII 1<br />
LECOEUR Constant DEA, Paris XII 1<br />
TERRY Stéphane DEA, Université Paris Sud 1<br />
SWIEB Salem DEA Univ. Paris XII 1<br />
DELEVALLEZ Guillaume<br />
Contrat Apprentissage Inserm BTS<br />
Biochimie<br />
1<br />
I. RESUME DES Proj<strong>et</strong>s SCIENTIFIQUES<br />
1. Oncogénèse Urogénitale<br />
Oncogenèse prostatique. Nous avons identifié, grâce à un modèle cellulaire, un nouveau gène dans le<br />
cancer prostatique hormonorésistant codant pour une protocadhérine appelée protocadhérine-PC<br />
(pPC). Son expression est induite au cours de l'acquisition de la résistance aux agents proapoptotiques.<br />
Une de nos hypothèses de travail est que la pPC serait impliquée dans la modification de<br />
la distribution intra-cellulaire de la ß-caténine <strong>et</strong> l'activation du récepteur <strong>des</strong> androgènes. Les objectifs<br />
sont : 1) d’identifier les partenaires protéiques qui sont associés aux fonctions de c<strong>et</strong>te protéine, 2) de<br />
développer <strong>des</strong> outils pour bloquer spécifiquement les fonctions de c<strong>et</strong>te protéine, 3) d’évaluer le rôle<br />
de la protocadhérine-PC comme nouveau marqueur biologique du cancer de la prostate via la création<br />
de puces à tissu <strong>et</strong> du développement d’anticorps, 4) de situer la protocadhérine-PC par rapport aux<br />
autres anomalies moléculaires observées au stade de l’échappement hormonal.<br />
Oncogenèse urothéliale. Nous avons les premiers, identifié les mutations activatrices du gène du<br />
récepteur FGFR3, présentes dans 40% <strong>des</strong> cas incidents. Ces mutations définissent ainsi un groupe<br />
alternatif de <strong>tumeurs</strong> par rapport à celles qui présentent <strong>des</strong> mutations de P53 en ce qui concerne le<br />
stade, le grade <strong>et</strong> la progression tumorale. Le profil de mutation de ces deux gènes pose les bases<br />
d’une classification moléculaire <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> urothéliales (TU). Nous avons démontré le rôle <strong>des</strong><br />
récepteurs aux facteurs de croissance épidermique dans un modèle de cicatrisation de l’urothélium <strong>et</strong><br />
dans la prolifération de lignées cellulaires de <strong>tumeurs</strong> urothéliales. Les objectifs sont d’utiliser ces<br />
observations <strong>et</strong> ces modèles pour<br />
2
GETU<br />
• caractériser ou hiérarchiser les altérations moléculaires critiques de la progression tumorale, dans<br />
une approche de type épidémiologie moléculaire<br />
• identifier <strong>des</strong> éléments de réponse à la thérapeutique<br />
• tester de nouvelles approches thérapeutiques centrées sur la signalisation <strong>des</strong> tyrosines kinases <strong>et</strong><br />
<strong>des</strong> molécules d’adhésion.<br />
Autogreffes de cellules musculaires « précurseur » dans les incontinences par insuffisance<br />
sphinctérienne.<br />
Les incontinences urinaires <strong>et</strong> fécales <strong>des</strong> pathologies associées une baisse du tonus sphinctérien<br />
posent <strong>des</strong> problèmes thérapeutiques non résolus. Nous proposons une nouvelle approche<br />
thérapeutique basée sur l’autogreffe de cellule précurseur musculaire (cpm). Nous avons montré chez<br />
le rat que <strong>des</strong> autogreffes cpm dans un sphincter urétral préalablement détruit par électrocoagulation<br />
aboutit à la formation de nouvelles fibres musculaires fonctionnelles qui augmentent la force de<br />
contraction du sphincter. Le but du proj<strong>et</strong> présenté est de restituer, par une autogreffe de cpm, <strong>des</strong><br />
sphincters urétral <strong>et</strong> anal physiologiques ayant une activité tonique basale dans un modèle<br />
d’insuffisance sphinctérienne développé sur le gros animal (la truie). Les objectifs spécifiques sont :<br />
a. Une évaluation fonctionnelle sphinctérienne urétrale <strong>et</strong> anale par bilan manométrique <strong>et</strong><br />
électrophysiologique du sphincter normal <strong>et</strong> lésé suivant notre modèle,<br />
b. La mise au point de techniques de culture de cpm en condition grade clinique <strong>et</strong> leur marquage à<br />
l’aide de marqueurs repérables en IRM.<br />
c. La mise au point de techniques d’injection intrasphinctérienne urétrale de cpm par voie<br />
endoscopique,<br />
d. L’évaluation de la greffe de cpm par les métho<strong>des</strong> précédemment citées.<br />
Planification <strong>et</strong> simulation d'interventions endoscopique standardisées <strong>et</strong> robotisées<br />
Ce proj<strong>et</strong> a pour objectif d’adapter les techniques de chirurgie laparoscopique classiques ou robotisées<br />
en fonction de l’anatomie corporelle rétropéritoneale <strong>et</strong> lésionnelle rénale. Il est basé sur la<br />
reconstruction d’image <strong>et</strong> le logiciel Chir (INRIA).<br />
II. 10 publications sélectionnées<br />
.<br />
1. Daher A., De Boer W.I., Le Frère Belda M.A., Kheuang L., Abbou C.C., Radvanyi F., M.C. Jaurand, Thiery<br />
J.P., Gil Diez de Medina S., Chopin D.K. Growth, differentiation and Senescence of Normal Human<br />
Urothelium in organ like culture. European Urology, 2004<br />
2. Huguenin, S., Vacherot, F., Kheuang, L., Fleury-Feith, J., Jaurand, M. C., Bolla, M., Riffaud, J. P., and<br />
Chopin, D. K. Antiproliferative effect of nitrosulindac (NCX 1102), a new nitric oxide-donating nonsteroidal<br />
anti-inflammatory drug, on human bladder carcinoma cell lines. Mol Cancer Ther, 3: 291-298,<br />
2004<br />
3. Antiphon, P., Hoznek, A., Benyoussef, A., de lataille, A., Cicco, A., Elard, S., G<strong>et</strong>tman, M. T., Katz, R.,<br />
Vordos, D., Salomon, L., Chopin, D. K., and Abbou, C. C. Compl<strong>et</strong>e solo laparoscopic radical<br />
prostatectomy: initial experience. Urology, 61: 724-728; discussion 728-729, 2003.<br />
4. Bakkar, A. A., Wallerand, H., Radvanyi, F., Lahaye, J. B., Pissard, S., Lecerf, L., Kouyoumdjian, J. C.,<br />
Abbou, C. C., Pairon, J. C., Jaurand, M. C., Thiery, J. P., Chopin, D. K., and de Medina, S. G. FGFR3 and<br />
TP53 gene mutations define two distinct pathways in urothelial cell carcinoma of the bladder. Cancer Res,<br />
63: 8108-8112, 2003<br />
5. Daher, A., de Boer, W. I., El-Marjou, A., van der Kwast, T., Abbou, C. C., Thiery, J. P., Radvanyi, F., and<br />
Chopin, D. K. Epidermal growth factor receptor regulates normal urothelial regeneration. Lab Invest, 83:<br />
1333-1341, 2003<br />
6. Katz, R., Nadu, A., Olsson, L. E., Hoznek, A., de la Taille, A., Salomon, L., and Abbou, C. C. A simplified<br />
5-step model for training laparoscopic ur<strong>et</strong>hrovesical anastomosis. J Urol, 169: 2041-2044, 2003.<br />
7. Yiou, R., Yoo, J. J., and Atala, A. Restoration of functional motor units in a rat model of sphincter injury by<br />
muscle precursor cell autografts. Transplantation, 76: 1053-1060, 2003<br />
8. Chopin; D., Barei-Moniri, R., Maille, P., Le Frère Belda, M.A., Muscatelli-Groux, B., Merendino, N.,<br />
Lecerf, L. , Stoppaciaro, A. and Velotti, F. Human urinary bladder transitional cell carcinomas acquire the<br />
functional FAS Ligand during tumor progression. Am J Pathol, 162 : 1139-1149, 2003<br />
9. De La Taille, A. Rubin, M.A., Chen, M.W., Vacherot, F., De Medina, S.G., Burchardt, M., Buttyan, R. and<br />
Chopin, D. B<strong>et</strong>a-Catenin-related anomalies in apoptosis-resistant and hormone-refractory prostate cancer<br />
cells. Clin Cancer Res, 9 : 1801-1807, 2003<br />
3
GETU<br />
10. Chen, M. W., Vacherot, F., De La Taille, A., Gil-Diez-De-Medina, S., Shen, R., Friedman, R. A., Burchardt,<br />
M., Chopin, D. K., and Buttyan, R. The emergence of protocadherin-PC expression during the acquisition of<br />
apoptosis-resistance by prostate cancer cells. Oncogene, 21: 7861-7871, 2002.<br />
III. Différents protocoles de recherche clinique <strong>et</strong> enquêtes épidémiologiques en santé publique<br />
en cours<br />
1. Facteurs professionnels <strong>et</strong> paramètres clinico-biologiques du cancer vésical. Responsable<br />
scientifique : J.C. PAIRON: ARC, CNAMTS, Ministère de l’Emploi <strong>et</strong> de la Solidarité, Ligue<br />
contre le Cancer<br />
2. Etude <strong>des</strong> mutations du récepteur <strong>des</strong> androgènes dans les cancers de la prostate localisés <strong>et</strong> les<br />
cancers métastatiques avant <strong>et</strong> pendant le traitement par déprivation androgénique <strong>et</strong> après<br />
échappement hormonal. Responsable scientifique : D. CHOPIN, PHRC National<br />
3. Evaluation prospective d’un test de surveillance <strong>des</strong> récidives du cancer de la vessie par analyse de<br />
l’ADN urinaire, D CHOPIN PHRC National<br />
IV. Principaux résultats <strong>et</strong> prospective scientifique<br />
IV.1. Progression tumorale<br />
IV.1.1. Oncogénèse prostatique. Identification d'un gène de résistance à l'apoptose dans le cancer<br />
prostatique hormonorésistant : la protocadhérine-PC. F. Vacherot, A. de la Taille, J. Fi<strong>et</strong>.<br />
Il y a plus de 50 ans que Charles Huggins a démontré l'utilité de la castration dans le traitement du<br />
cancer avancé de la prostate. Ce traitement est exceptionnellement curatif, une population cellulaire<br />
devenant inévitablement résistante au traitement hormonal, ces cellules étant également résistantes aux<br />
traitements non hormonaux comme la radiothérapie <strong>et</strong> la chimiothérapie. Afin d'identifier le produit de<br />
gènes associés au développement de l'hormonorésistance, nous avons sélectionné, à partir de la lignée<br />
cellulaire LNCap hormonosensible, deux variants hormonorésistants utilisant le TPA <strong>et</strong> la privation en<br />
sérum qui entraîne l'apoptose de 80% <strong>des</strong> cellules LNCap parentales. Après 5 cycles de traitement, 2<br />
variants ont pu être sélectionnés : LNCap-TR (résistante au TPA) <strong>et</strong> LNCap-SSR (résistante à la<br />
privation en sérum).<br />
Privation en<br />
sé rum<br />
Expansion<br />
<strong>des</strong> cellules vivantes<br />
Sélection répétée<br />
X 4<br />
LNCaP-SSR<br />
ATG ATG TAA<br />
Exon<br />
10 nM TPA<br />
Expansion<br />
<strong>des</strong> cellules vivantes<br />
Sélection répétée<br />
X 4<br />
LNCaP-TR<br />
Forme<br />
membranaire<br />
C C<br />
D C C C C<br />
Forme<br />
membranaire<br />
NLS<br />
Site de fixation<br />
à la β-caténine<br />
Figure 1 :le modèle cellulaire<br />
Figure 2 : Structure de la protocadhérine PC (pPC)<br />
Grâce à ce modèle cellulaire (figure 1), le produit d'un nouveau gène fortement exprimé dans les<br />
lignées TR-SRR a été identifié par hybridation différentielle. Ce gène code pour un nouveau membre<br />
<strong>des</strong> protocadhérines, la protocadhérine-PC (figure 2). Nos résultats démontrent le rôle antiapoptotique<br />
de la protocadhérine-PC <strong>et</strong> suggèrent fortement son implication dans la transition de l'adénocarcinome<br />
prostatique vers le stade hormonorésistant.<br />
Nous avons montré l'existence d'une liaison entre la b<strong>et</strong>acaténine <strong>et</strong> la protocadhérine-PC associée à<br />
une re-localisation nucléaire de la b<strong>et</strong>acaténine <strong>et</strong> une activation de la voie de transcription LEF/TCF.<br />
Ces observations nous ont amenés à étudier dans un premier temps, l'expression de la b<strong>et</strong>acaténine au<br />
niveau du cancer de la prostate , <strong>et</strong> nous avons observé une localisation anormale nucléaire de la<br />
b<strong>et</strong>acaténine dans 60% <strong>des</strong> cancers hormonorésistants, alors qu'il n'y a aucune mutation, ou<br />
4
GETU<br />
exceptionnellement, de la b<strong>et</strong>acaténine dans le cancer de la prostate. Les hypothèses actuelles sur les<br />
altérations de la b<strong>et</strong>acaténine dans la progression du cancer de la prostate, sont que la b<strong>et</strong>acaténine est<br />
capable d'entrer dans le noyau par un mécanisme indépendant du complexe APC <strong>et</strong> pourrait<br />
éventuellement se lier aux récepteurs <strong>des</strong> androgènes <strong>et</strong> être responsable d'un <strong>des</strong> mécanismes de son<br />
activation en l'absence du ligand. Nous avons envisagé d’<strong>et</strong>udier de façon plus précise la fonction de la<br />
pPC, <strong>et</strong> de developper <strong>des</strong> outils pour bloquer son action.<br />
Proj<strong>et</strong> Actuel<br />
L'objectif de notre démarche de recherche est de caractériser les modifications induites au<br />
niveau du tissu prostatique par la privation androgénique <strong>et</strong> d’identifier <strong>des</strong> anomalies<br />
moléculaires critiques impliquées dans l’acquisition de la résistance au traitement hormonal du<br />
cancer prostatique afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, nous<br />
avons récemment caractérisé un nouveau membre de la famille <strong>des</strong> protocadhérines, la<br />
protocadhérine-PC. Son expression est induite au cours de l’acquisition de la résistance aux<br />
stimuli apoptotiques <strong>et</strong> elle est sur exprimée dans le cancer en échappement hormonal. La<br />
transfection <strong>des</strong> cellules prostatiques par un vecteur perm<strong>et</strong>tant l’expression de la<br />
protocadhérine-PC leur confère une résistance à l’apoptose induite par le phorbol ester. Son<br />
mécanisme d'action serait associé à la β-caténine qui vient d'être décrite comme nouveau coactivateur<br />
du récepteur <strong>des</strong> androgènes<br />
Les objectifs spécifiques de ce proj<strong>et</strong> sont de préciser le rôle de la protocadhérine-PC dans la<br />
transition vers l'hormonorésistance du cancer de la prostate <strong>et</strong> de placer c<strong>et</strong>te altération<br />
moléculaire parmi celles décrites à ce stade. Nous évaluerons également le rôle de marqueur de<br />
la protocadhérine-PC.<br />
Afin de répondre à ces objectifs, nous proposons de réaliser les expérimentations suivantes.<br />
a- Relation Protocadhérine-PC, récepteur <strong>des</strong> androgènes <strong>et</strong> la β-caténine<br />
Nous avons observé dans un modèle in vivo de xénogreffe que l’augmentation de la protocadhérine-<br />
PC est associée avec la suppression <strong>des</strong> androgènes <strong>et</strong> nous avons démontré un rôle antiapoptotique de<br />
c<strong>et</strong>te protéine. En collaboration avec l’équipe de Ralph Buttyan (Columbia, NY) nous avons observé,<br />
dans un modèle de double hybride chez la levure, que la protocadhérine-PC est capable de se lier avec<br />
la protéine FHL2 qui est un co-activateur du RA.<br />
Il nous semble important d'évaluer si l’activité de la protocadhérine-PC serait associée à l'activation du<br />
récepteur <strong>des</strong> androgènes. Pour cela plusieurs approches seront étudiées. Dans un premier temps, les<br />
cellules LNCaP, TR <strong>et</strong> SSR qui sont <strong>des</strong> lignées possédant une forme mutée du RA seront transfectées<br />
avec un plasmide contenant les éléments de réponse au RA couplé à un gène reporter qui est la<br />
luciférase. La mesure de l’activité de la luciférase nous indiquera si l’activité transcriptionnelle du RA<br />
serait plus important ou non au niveau <strong>des</strong> cellules LNCaP-TR <strong>et</strong> SSR qui sont <strong>des</strong> lignées<br />
surexprimant la protocadhérine-PC comparé à lignée parentale LNCaP. Par ailleurs les cellules<br />
tumorales prostatiques (DU 145 <strong>et</strong> PC 3) ne possédant pas de RA, seront co-transfectées avec <strong>des</strong><br />
plasmi<strong>des</strong> contenant les ADNc codant pour ces deux protéines. L'activation du RA sera visualisée<br />
selon la technique décrite précédemment. Dans l'hypothèse où la protocadhérine-PC serait capable<br />
d'activer les activités transcriptionnelles du RA, une immunoprécipitation sera réalisée afin d’étudier<br />
les liaisons protocadhérine-PC <strong>et</strong> RA.<br />
La β-caténine a été récemment décrite comme un nouveau co-activateur du RA. Nous disposons au<br />
laboratoire <strong>des</strong> vecteurs d’expression exprimant la β-caténine (la forme sauvage <strong>et</strong> mutée). Selon le<br />
protocole d’étude similaire de celui du récepteur <strong>des</strong> androgènes, nous étudierons le rôle de la<br />
protocadhérine-PC dans la délocalisation de la β-caténine qui pourrait conduire à l'activation du RA.<br />
Dans l’objectif de pouvoir contrôler l’expression de la protocadhérine-PC <strong>et</strong> de pouvoir ainsi étudier<br />
sa régulation, nous créons, à partir <strong>des</strong> lignées LNCaP, PC-3 <strong>et</strong> DU 145, <strong>des</strong> lignées inductibles<br />
utilisant les systèmes T-Rex <strong>et</strong> Ecdysone (Invitrogen). Nous avons obtenu 2 clones issus de la lignée<br />
PC3 qui produisent de façon inductible la protocadhérine-PC. La sélection <strong>des</strong> clones issus <strong>des</strong> lignées<br />
LNCaP <strong>et</strong> DU 145 transfectées avec le plasmide contenant l’ADNc de la protocadhérine-PC est<br />
5
GETU<br />
actuellement en cours. L’obtention de ces cellules nous perm<strong>et</strong>tra d’approfondir nos connaissances sur<br />
les mécanismes moléculaires mis en jeux par la protocadhérine-PC pour perm<strong>et</strong>tre aux cellules<br />
tumorales de résister à l’apoptose induite par le traitement hormonal.<br />
b– Identifier les mécanismes moléculaires associés à la surexpression de la protocadhérine-PC<br />
Pour déterminer les gènes qui pourraient être régulés par la protocadhérine-PC <strong>et</strong> qui participeraient à<br />
la progression tumorale <strong>et</strong> à l’échappement hormonal, nous envisageons d’utiliser la technique <strong>des</strong><br />
puces à ADN. Nous comparerons le niveau d’expression <strong>des</strong> gènes <strong>des</strong> cellules surexprimant la<br />
protocadhérine-PC (LNCaP-TR, SSR, LNCaP-T6-2) comparé à la lignée parentale LNCaP. Selon les<br />
résultats obtenus, nous utiliserons ensuite les cellules contenant le système inductible de la<br />
protocadhérine-PC pour étudier la régulation <strong>des</strong> gènes cibles qui auraient été identifiés. Ces données<br />
devraient nous perm<strong>et</strong>tre de mieux comprendre les fonctions de la protocadhérine-PC <strong>et</strong> d’identifier de<br />
nouvelles cibles thérapeutiques. Pour l’analyse du transcriptome seront utilisés les puces U133A <strong>et</strong><br />
U133B avec au minimum 10 microgrammes d’ARN par échantillon. Les données du transcriptome <strong>et</strong><br />
du génome seront analysées en collaboration avec les services de l’Institut Curie, de Statistiques<br />
(Directeur Bernard Asselain) <strong>et</strong> de Bioinformatique (Directeur Emmanuel Barillot).<br />
c– Mise au point <strong>des</strong> protocole pour inhiber l'expression du gène de la protocadhérine-PC<br />
Nos étu<strong>des</strong> ont démontrés une surexpression de la protocadhérine PC dans le cancer en échappement<br />
hormonal. L’inhibition de l’expression de c<strong>et</strong>te protéine constitue donc une approche thérapeutique<br />
potentielle. Pour cela nous envisageons de développer l’approche d’interférence d’ARN pour inhiber<br />
l'expression de c<strong>et</strong>te molécule <strong>et</strong> de bloquer ainsi ses fonctions.<br />
L’interférence d’ARN consiste en un mécanisme d’inhibition spécifique <strong>des</strong> gènes. Ce phénomène est<br />
provoqué par l’activation du complexe RISC (RNA-induced silencing complex) qui clive un ARNm<br />
cible empêchant donc sa traduction. Ce complexe est activé par <strong>des</strong> siRNA (small interfering ARN)<br />
qui sont de courts oligonucléoti<strong>des</strong> double brins de 21 nucléoti<strong>des</strong> environ <strong>et</strong> dont l’extrémité 3’ est<br />
libre sur 2 nucléoti<strong>des</strong><br />
Pour réprimer l'expression de la protocadhérine PC, nous utiliserons dans un premier temps les<br />
cellules LNCaP-TR <strong>et</strong> SSR pour la mise au point <strong>des</strong> séquences de nucléoti<strong>des</strong> perm<strong>et</strong>tant d'inhiber<br />
spécifiquement l'expression de la c<strong>et</strong>te protéine. Le <strong>des</strong>ign <strong>des</strong> séquences ainsi que leur synthèse<br />
seront confiés à la société Dharmacon Reseach. Plusieurs siRNA seront testés afin de définir la<br />
séquence la plus efficace. L’inconvénient de l’interférence par <strong>des</strong> siRNA est que le phénomène ne<br />
dure pas plus de 48h à 72h. A ce stade, il reste toujours de la protéine endogène. Pour surmonter ce<br />
problème, nous construirons, dans un second temps, <strong>des</strong> vecteurs d’expression perm<strong>et</strong>tant de produire<br />
<strong>des</strong> shRNA (transcrits RNA sous forme d’épingle à cheveux qui seront ensuite clivés par le complexe<br />
DICER pour aboutir à <strong>des</strong> siRNA). Ces vecteurs seront ensuite transfectées dans les cellules LNCaP-<br />
TR <strong>et</strong> SSR pour évaluer leur efficacité de bloquer l’expression de la protocadhérine PC à long terme.<br />
Nous envisageons également de construire <strong>des</strong> vecteurs d’expression de shRNA.<br />
d- Production <strong>et</strong> fonctions <strong>des</strong> anticorps monoclonaux anti-protocadhérine-PC<br />
Nous avons obtenu un anticorps monoclonal (clone C32) reconnaissant spécifiquement la<br />
protocadhérine-PC sur tissus prostatiques humains <strong>et</strong> par ELISA. D’autres souris sont actuellement en<br />
cours d’immunisation. Nous espérons ainsi obtenir de nouveaux anticorps reconnaissant différents<br />
épitopes de la molécule. L’obtention de ces anticorps nous perm<strong>et</strong>tra de développer notre proj<strong>et</strong> de<br />
recherche sur l’étude <strong>des</strong> mécanismes d'action de la protocadhérine PC, mais aussi d'évaluer la<br />
protocadhérine-PC comme marqueur biologique du cancer de la prostate.<br />
e- Evaluation de l’eff<strong>et</strong> <strong>des</strong> anticorps anti-protocadhérine-PC sur <strong>des</strong> cellules tumorales prostatiques<br />
Une <strong>des</strong> étapes de la caractérisation de la fonction de la protocadhérine-PC passe par l’étude de l’eff<strong>et</strong><br />
de la présence <strong>des</strong> anticorps anti-protocadhérine-PC sur le développement <strong>et</strong> la croissance in vitro <strong>et</strong> in<br />
vivo <strong>des</strong> cellules résistantes à l’apoptose (LNCaP-TR <strong>et</strong> -SSR). Il est donc prévu d’étudier dans un<br />
premier temps, le comportement de ces cellules cultivées en présence <strong>des</strong> anticorps ou microinjectées<br />
avec ces protéines <strong>et</strong> d’évaluer leur sensibilité plus accrue aux différents stimuli apoptotiques.<br />
6
GETU<br />
f- Mise au point d’un dosage ELISA de la Protocadhérine-PC<br />
La poursuite de l’obtention d’anticorps monoclonaux sera de m<strong>et</strong>tre au point un dosage ELISA. Nous<br />
disposons un appareil, le BIAcore, nous perm<strong>et</strong>tant d'analyser l'affinité <strong>des</strong> anticorps vis-à-vis de la<br />
protocadhérine-PC <strong>et</strong> de les sélectionner ensuite en fonction de leur reconnaissance aux différents<br />
épitopes. C<strong>et</strong>te première étape nous perm<strong>et</strong>tra d'isoler les anticorps intéressants qui seront ensuite<br />
utilisés dans la mise au point du test d'ELISA. L'anticorps ayant la meilleure affinité vis-à-vis de la<br />
protocadhérine-PC sera fixé sur plaque de 96 puits <strong>et</strong> utilisé pour la capture de la protéine<br />
recombinante. Après lavage <strong>des</strong> protéines non fixées, la détection du complexe antigène/anticorps se<br />
fera par l'incubation avec un mélange de plusieurs anticorps monoclonaux biotinylés, suivie d'une<br />
étape de révélation avec de la streptavidine couplée à un traceur fluorescence.<br />
g- Création d’une banque de Tissue MicroArrays<br />
La technique <strong>des</strong> tissue microarrays est un outil performant, rapide <strong>et</strong> rentable pour étudier l’intérêt<br />
clinique <strong>des</strong> nouvelles molécules Elle a pour finalité de concentrer sur 1 lame plusieurs centaines<br />
d’échantillons pouvant provenir de plusieurs centaines de patients différents (voir principe ci après).<br />
Nous avons entrepris, sur la cohorte de patients du service d’urologie de l’Hôpital Henri Mondor, en<br />
collaboration avec le service d’anatomopathologie, de réaliser une puce à tissu comprenant 30<br />
échantillons d’adénome de la prostate obtenus après résection transuréthrale de la prostate ou<br />
adénomectomie, 250 tissus de cancer de la prostate au stade localisé (après prostatectomie radicale par<br />
voie coelioscopique ou par voie rétropubienne) <strong>et</strong> 50 tissus de patients présentant un cancer de la<br />
prostate en hormono-échappement ayant bénéficié d’une résection transuréthrale de la prostate pour<br />
obstacle sous vésical. Pour chacun de ces patients, les données cliniques <strong>et</strong> anatomopathologiques sont<br />
collectées sur fichier informatisé anonymisé qui a permis l’évaluation <strong>des</strong> différentes techniques<br />
chirurgicales utilisées dans le service d’urologie.<br />
h- Place de la protocadhérine-PC dans le cancer de la prostate en échappement hormonal<br />
La comparaison de l’expression de la protocadhérine-PC aux autres molécules impliquées dans le<br />
cancer de la prostate en échappement hormonal sera étudiée par RT-PCR quantitative <strong>et</strong>/ou<br />
immunohistochimie. Les transcrits concernés sont ceux : du récepteur <strong>des</strong> androgènes ; <strong>des</strong> familles de<br />
facteurs de croissance <strong>et</strong> de leurs récepteurs comme EGF, FGF, IGF <strong>et</strong> HARP ; certains marqueurs<br />
neuroendocriniens comme l’adrénomédulline, <strong>des</strong> marqueurs <strong>des</strong> gènes de résistance à l’apoptose<br />
comme bcl2 <strong>et</strong> la clustérine.<br />
IV.1. 2. Oncogénèse urothéliale. D., Chopin, J.L Lagrange, D. Vordos<br />
Deux types de recherches sont développées :<br />
• l’utilisation de modèles in vitro pour évaluer de nouvelles thérapeutiques<br />
• l’étude <strong>des</strong> altérations moléculaires <strong>et</strong> génétiques <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> urothéliales dans un but<br />
étiopathogénique <strong>et</strong> pronostique<br />
IV.1. 2.1 - Modèles in vitro de culture de l'urothélium<br />
Nous avons étudié la croissance, la différentiation <strong>et</strong> la sénescence de l'urothélium humain normal<br />
dans un modèle de culture pseudo organo typique. Des explants d'urothélium humain normal ont été<br />
micro disséqués <strong>et</strong> placés sur <strong>des</strong> membranes semi poreuses prétraitées par différents composants de la<br />
matrice extra cellulaire avec un milieu défini. Ces cultures ont été maintenues pour une durée de 30<br />
jours pendant laquelle nous avons étudié la prolifération cellulaires par l'incorporation de Brdu, la<br />
différentiation par l'expression <strong>des</strong> cytokératines <strong>et</strong> de l'uroplakine. Nous avons également étudié<br />
l'expression <strong>des</strong> facteurs de croissance de la famille de l'EGF par RT-PCR quantitative, ainsi que la<br />
sénescence en mesurant l'expression <strong>des</strong> transcrits de p16 <strong>et</strong> l'activité β-galactosidase endogène,<br />
Utilisant le collagène 4 qui est le composant de la matrice le plus efficace. Nous pouvons utiliser ce<br />
modèle à l'état d'équilibre du 15 ème au 30 ème jour. Dans les 15 premiers jours, on un pic de<br />
prolifération(15%) qui s'associe à la production d'HB-EGF d'amphiréguline <strong>et</strong> de TGF-α. A partir du<br />
15 ème jour la prolifération r<strong>et</strong>ombe à 3 à 5 %. L'expression <strong>des</strong> cytokératines <strong>et</strong> de l'uroplakine est<br />
stable a confluence. Une activité significative de sénescence apparaît à J.25. Ces résultats montrent<br />
que ce modèle maintient les caractéristiques de l'urothélium humain in vivo <strong>et</strong> peut être utilisé entre le<br />
15 ème <strong>et</strong> le 25 ème jour. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour étudier l'implication <strong>des</strong> facteurs de<br />
croissance de la famille de l'EGF <strong>et</strong> celle du récepteur à l'EGF au cours de la cicatrisation urothéliale.<br />
Les mécanismes de cicatrisation étant en partie impliqués <strong>et</strong> déviés au cours de la cancérogenèse<br />
7
GETU<br />
urothéliale. Utilisant à partir du 15 ème jour nous avons réalisé <strong>des</strong> cultures à confluence nous avons<br />
réalisé <strong>des</strong> blessures circulaires de 4 mm de diamètre la régénération a été étudiée dans un milieu<br />
défini grâce à un analyseur d'images à 4, 24 <strong>et</strong> 28 heures. La prolifération a été étudiée par<br />
incorporation de Brdu <strong>et</strong> l'expression <strong>des</strong> facteurs de croissance par RT-PCR. Le rôle du récepteur à<br />
l'EGF a été étudié utilisant <strong>des</strong> anticorps bloquants ainsi que <strong>des</strong> inhibiteurs de l'activité tyrosine<br />
kinase de ce récepteur (AG1478). Nous avons étudié le rôle de l'amphiréguline de l'EGF du TGF-α <strong>et</strong><br />
de l'HBEGF à <strong>des</strong> doses réceptives de 20 ng/ml, 100 ng/ml ml, 20 ng/ ml <strong>et</strong> 20 ng/ml. Dans ce modèle<br />
la cicatrisation spontanée est obtenue en 48 heures. Elle est inhibée par l'AG418 <strong>et</strong> les anticorps de 50<br />
<strong>et</strong> 30 % respectivement. C<strong>et</strong>te inhibition s'accompagne d'une inhibition de la prolifération <strong>et</strong> de la<br />
migration cellulaire. La régénération est marquée par une augmentation de production de gène<br />
HBEGF au niveau <strong>des</strong> ARN sans changement au niveau de la quantité du récepteur. C<strong>et</strong>te cicatrisation<br />
est accélérée par l'addition exogène de TFG-α HB-EGF <strong>et</strong> TGF-α. Il n'y a pas d'eff<strong>et</strong> de l'EGF par luimême.<br />
Ces résultats montrent qu'il existe une boucle autocrine impliquant le récepteur à l'EGF <strong>et</strong> l'HBEGF<br />
dans la cicatrisation urothéliale <strong>et</strong> que le récepteur à l'EGF est donc une cible potentielle pour contrôler<br />
la prolifération <strong>des</strong> cellules urothéliales<br />
Figure 1 : Eff<strong>et</strong> d’un inhibiteur de l’EGFR (AG1478) sur la cicatrisation urotheliale<br />
A<br />
4h<br />
B<br />
24h<br />
C<br />
48h<br />
Serum free<br />
D<br />
E<br />
F<br />
AG1478<br />
IV 1. 2.2 - Modèle in vitro de la thérapie ciblée <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> urothéliales sur le récepteur à l'EGF<br />
La surexpression du récepteur à l'EGF au cours de la cancérogénèse <strong>et</strong> de la progression <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong><br />
urothéliales est bien établie. Nous avons mis en évidence une relation entre la surexpression du<br />
récepteur à l'EGF <strong>et</strong> la prolifération cellulaire ainsi que le pronostic. Nous avons également établi une<br />
lignée cellulaire qui présente une amplification du gène de récepteur <strong>et</strong> qui répond aux facteurs de<br />
croissance de la famille de l'EGF (lignée 1207). Ces éléments associés au rôle du récepteur à l'EGF<br />
dans la cicatrisation urothéliale nous a amené à étudié le rôle <strong>des</strong> inhibiteurs spécifiques du récepteur à<br />
l'EGF comme thérapeutiques potentielles dans le cancer urothéliale. En collaboration avec les<br />
laboratoires Astra Zeneca, nous avons étudié les faits du Gefitinib (Iressa). Nous avons étudié<br />
l'expression <strong>des</strong> récepteurs Erb-B (1, 2 <strong>et</strong> 3) sur 6 lignées cellulaires (D24, J82, RT112, SD 24 SD148<br />
10-07). Il existe une corrélation entre le niveau d'expression <strong>des</strong> transcrits <strong>et</strong> le niveau <strong>des</strong> protéines.<br />
Parmi les ligands exprimés de façon endogène par ces lignées cellulaires, le TGF-α, l' HEBGF <strong>et</strong><br />
l'amphériguline sont les plus importants. L'EGF est peu ou pas exprimé. L'Epiréguline est exprimé<br />
dans SD24 <strong>et</strong> SD148. Nous avons observé en utilisant deux inhibiteurs l'AG14 78 <strong>et</strong> le ZT 18 39, un<br />
eff<strong>et</strong> significatif sur la prolifération est observé avec les lignées 64 7V <strong>et</strong> 1207. Ces résultats montrent<br />
alors qu'il existe un eff<strong>et</strong> dose du ZT 18 89 sur la lignée 1207 avec une IC50 à 0,25 µM. C<strong>et</strong>te<br />
diminution de la prolifération s'associe à une augmentation de la proportion <strong>des</strong> cellules en phase GA.<br />
8
GETU<br />
Les résultats de l'étude de la signalisation du récepteur à l'EGF montrent que la sensibilité aux<br />
inhibiteurs de ce récepteur n'est pas liée à son expression mais à son activation. En eff<strong>et</strong>, seules les<br />
lignées 64 7V <strong>et</strong> 1207 possèdent une autophosphorylation du REGF avec une activation de la voie <strong>des</strong><br />
MAK <strong>et</strong> également de la voie Akt qui est impliquée dans la résistance à l'apoptose. Nous avons étudié<br />
la phosphorisation spontanée du récepteur de la Tyrosine 1068 sur 29 <strong>tumeurs</strong> urothéliales de la vessie<br />
<strong>et</strong> c<strong>et</strong>te phosphorisation est r<strong>et</strong>rouvée dans 46 % <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> superficielles <strong>et</strong> 81 % <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong><br />
invasives. Ces résultats suggèrent que l'eff<strong>et</strong> du Gefitinib (Iressa, ZD 1839) ne dépend pas de<br />
l'expression du récepteur mais de l'incubateur spécifique de sa voie de signalisation. C<strong>et</strong>te observation<br />
peut avoir <strong>des</strong> implications cliniques importantes pour l'utilisation de ces nouvelles moléculaires en<br />
cancérologie.<br />
a)<br />
Figure 2 a <strong>et</strong> b : Inhibition dose dépendante de la viabilité <strong>et</strong> de la phosphorylation<br />
Du REGF par ZD1839.<br />
Inhibitory effect of IRESSA<br />
100<br />
inhibition (%)<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
1207<br />
0<br />
0 0,5 1 1,5 2<br />
Concentration (µM)<br />
b)<br />
Dans le cadre de ce proj<strong>et</strong>, nous voulons préciser les indications de la thérapie ciblée sur l'EGFR dans<br />
les <strong>tumeurs</strong> urothéliales de la vessie.<br />
9
GETU<br />
IV. 1.2.3 - Epidémiologie moléculaire. Analyse génomique, D. Chopin, JP. Pairon<br />
Le proj<strong>et</strong> analyse les étapes critiques moléculaires <strong>et</strong> génétiques <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> urothéliales en tenant<br />
compte <strong>des</strong> facteurs étiologiques moyens qui sont le tabac <strong>et</strong> l'exposition professionnelle, nous avons<br />
généré les résultats suivants :<br />
Analyse épidémiologique<br />
Dans le cadre d’une étude épidémiologique prospective, cas- contrôle multicentrique regroupant les<br />
centres suivants de l’AP-HP : Henri Mondor, Ambroise Paré, Bichat, Tenon <strong>et</strong>, le Centre<br />
Intercommunal de Créteil, nous avons inclus 250 cas incidents de cancer de la vessie chez <strong>des</strong><br />
individus de sexe masculin, d'origine caucasienne <strong>et</strong> parallèlement, 250 individus porteurs d'adénome<br />
de prostate comme témoins. Une enquête professionnelle <strong>et</strong> environnementale a été effectuée chez<br />
tous les cas, une analyse de l’intoxication tabagique a été effectuée chez les cas <strong>et</strong> les témoins. Une<br />
analyse à ce stade a permis de caractériser c<strong>et</strong>te cohorte quant à l’intoxication tabagique <strong>et</strong> aux<br />
expositions professionnelles.<br />
Influence du tabagisme<br />
Il existe une n<strong>et</strong>te sur représentation <strong>des</strong> fumeurs <strong>et</strong> <strong>des</strong> ex-fumeurs chez les cas par rapport aux<br />
témoins p
GETU<br />
Les résultats de c<strong>et</strong>te étude épidémiologique démontrent l’importance du tabac <strong>et</strong> <strong>des</strong> facteurs<br />
d’exposition professionnel dans l’oncogénèse <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> de la vessie <strong>et</strong> la gravité <strong>des</strong> formes liées au<br />
tabac.<br />
Pathologie moléculaire du cancer vésical, génotype <strong>des</strong> voies de carcinogenèse <strong>et</strong> agressivité tumorale<br />
Depuis de nombreuses années, la notion de deux maladie au sein du spectre que représentent les<br />
<strong>tumeurs</strong> urothéliales de la vessie « two pathways of urothelial carcinoma » est suggérée sur un<br />
faisceau d’arguments :<br />
• Les étu<strong>des</strong> épidémiologiques ont montré que la majorité <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> invasives (80%) se<br />
présentent comme telles au diagnostic initial sans antécédent de <strong>tumeurs</strong> superficielles<br />
• Les cartographies <strong>des</strong> pièces de cystectomie qui montrent <strong>des</strong> mo<strong>des</strong> d’invasions différents entre<br />
les <strong>tumeurs</strong> papillaires diffuses qui poussent comme <strong>des</strong> fronts <strong>et</strong> se limitent le plus souvent à<br />
l’effraction de la lamina propria, <strong>et</strong> l’invasion pénétrante en flèche du muscle <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong><br />
infiltrantes dérivés <strong>des</strong> CIS,<br />
• Le risque de progression très différent <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> papillaires par rapport aux <strong>tumeurs</strong> soli<strong>des</strong> non<br />
papillaires<br />
• L’association à du carcinome in situ <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> papillaires G1 G2 qui progressent<br />
• Le risque majeur de progression du CIS diffus en l’absence de traitement.<br />
Nous avons contribué à la caractérisation sur le plan génétique de ce concept. En eff<strong>et</strong> nous avons<br />
identifié que les mutations du gène FGFR3 étaient l’altération génétique la plus fréquente dans les<br />
<strong>tumeurs</strong> urothéliales de la vessie <strong>et</strong> caractérisaient les <strong>tumeurs</strong> papillaires <strong>et</strong> de bas grade, ayant un<br />
faible taux de récidive à l’inverse de celle de TP53. Nous avons, les premiers, fait l’observation que<br />
les mutations de ces deux gènes étaient mutuellement exclusives, au diagnostic initial, <strong>et</strong> définissaient<br />
une voie génétique alternative dans l’oncogenèse vésicale (figure 1). Ces résultats <strong>et</strong> ceux de nos<br />
étu<strong>des</strong> épidemiologiques nous incitent à évaluer ces mutations en fonction du contexte étiologique, ce<br />
qui perm<strong>et</strong>trait de mieux comprendre les mécanismes endogènes <strong>et</strong> exogènes de la carcinogénèse<br />
vésicale. C’est dans ce cadre que nous pourrons progresser dans l’identification <strong>des</strong> altérations clés <strong>des</strong><br />
différentes voies de progression tumorale, en utilisant les nouvelles techniques d’analyse du vivant à<br />
haut débit sur <strong>des</strong> groupes de <strong>tumeurs</strong> ayant déjà un classifiant génotypique.<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
FGFR3mut/p53wt<br />
FGFR3wt/P53wt<br />
FGFR3wt/P53mut<br />
FGFR3mut/P53mut<br />
TA T1 T2-T4<br />
Figure 1 : Génotypage de 86 <strong>tumeurs</strong> urothéliales au diagnostic initial. Les doubles mutations sont quasiexclusives.<br />
Il existe une très forte association significative entre le stade (Ta-T1/T2->T2) le grade (G1-G2/G3) <strong>et</strong><br />
les génotypes FGFR3 mut-TP53wt versus FGFR2wt-TP53mut. (OR=29.07 95% IC 5.26-160.66 <strong>et</strong> OR= 12.73<br />
95% IC 3.07-52.78) . Il existe un groupe important de <strong>tumeurs</strong> n’ayant aucune <strong>des</strong> mutations de ces deux gènes.<br />
Ces deux mutations constituent les bases d’une caractérisation moléculaire <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> urothéliales, <strong>et</strong><br />
fournissent un canevas d’analyse <strong>des</strong> autres altérations génétiques <strong>et</strong> moléculaires connues ou non décrites dans<br />
les <strong>tumeurs</strong> urothéliales.<br />
11
GETU<br />
Etapes du proj<strong>et</strong> <strong>et</strong> Bases Méthodologiques<br />
L’objectif général de ce proj<strong>et</strong> est de caractériser sur le plan moléculaire <strong>et</strong> génétique, les <strong>tumeurs</strong><br />
urothéliales de la vessie au diagnostic initial en fonction de l’intoxication tabagique <strong>et</strong> de l’exposition<br />
professionnelle.<br />
Les objectifs spécifiques sont :<br />
1. d’identifier <strong>des</strong> mécanismes exogènes <strong>et</strong> endogènes de carcinogenèse vésicale en fonction <strong>des</strong><br />
mutations de p53 <strong>et</strong> de FGFR3<br />
2. de caractériser d’autres altérations génétiques ou moléculaires connues ou non, en fonction <strong>des</strong><br />
expositions <strong>et</strong> du génotype p53/ FGFR3 par l’utilisation <strong>des</strong> techniques d’analyse à haut débit :<br />
puce a tissus, puce à ADN (transcrits <strong>et</strong> CGH)<br />
3. d’identifier <strong>des</strong> signatures d’exposition professionnelles <strong>et</strong> ou de l’intoxication tabagique, <strong>et</strong> de<br />
disposer de marqueurs étiologiques<br />
4. d’améliorer la prise en charge de ces <strong>tumeurs</strong> par une classification moléculaire tenant<br />
également compte <strong>des</strong> facteurs étiologiques.<br />
La Méthodologie<br />
Collection biologique, caractéristiques anatomocliniques, épidemiologiques <strong>et</strong> analyses :<br />
Les données clinico-pathologiques (endoscopiques <strong>et</strong> histologiques) ont fait l’obj<strong>et</strong> d’un consensus<br />
urologique <strong>et</strong> anatomopathologique dans le cadre du Comité de Cancérologie de l’Association<br />
Française d’Urologie, résumé dans le rapport de l’AFU sur les <strong>tumeurs</strong> superficielles rédigé en 2001<br />
par D Chopin <strong>et</strong> B Gattegno. L’ensemble de ces variables codées de façon exclusive est relevé sur une<br />
base de données relationnelle anonymisée.<br />
Les données épidémiologiques font l’obj<strong>et</strong> d’un questionnaire standardisé recueilli auprès <strong>des</strong> patients<br />
par <strong>des</strong> enquêteurs <strong>et</strong> sont analysées en aveugle par une équipe de Médecine du Travail, de l'Institut<br />
Inter Universitaire de Médecine du Travail de Paris, Ile de France.<br />
Tumorothèque : Ce proj<strong>et</strong> s’appuie donc sur la constitution d’une banque de tissus <strong>et</strong> de sang total. Les<br />
prélèvements proviennent de trois hopitaux : Bichat, Tenon <strong>et</strong> Henri Mondor. Ils sont centralisés dans<br />
le cadre de la tumorothéque <strong>des</strong> services de pathologie respective. Actuellement nous utilisons une<br />
technique de triple extraction qui perm<strong>et</strong> d’isoler, à partir d’un même prélèvement broyé dans le<br />
thiocyanate de guanidine, à l'aide d'un gradient de chlorure de césium, l’ADN, l’ARN <strong>et</strong> les protéines.<br />
L’isolement de l’ADN contrôle est réalisé à partir du sang total. C<strong>et</strong>te méthodologie nous perm<strong>et</strong><br />
d’avoir accès non seulement aux anomalies de l’ADN, mais également à l’ARN <strong>et</strong> pour une partie aux<br />
protéines. L’inconvénient de c<strong>et</strong>te technique est son coût en consommables <strong>et</strong> temps technique.<br />
Cependant la qualité d’obtention du matériel perm<strong>et</strong> la conservation <strong>et</strong> le transport <strong>des</strong> échantillons<br />
dans les différents laboratoires impliqués dans l’étude.<br />
Mutations : Les <strong>tumeurs</strong> utilisées dans ce proj<strong>et</strong> seront génotypées pour P53 <strong>et</strong> FGFR3 qui<br />
caractérisent deux voies spécifiques de carcinogenèse utilisant la technique de DHPLC. Après<br />
amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), nous avons réalisé une PCR<br />
de l’ADN tumoral <strong>et</strong> génomique pour chaque prélèvement <strong>et</strong> pour chaque exon étudié. Dans le cas de<br />
P53, nous avons étudié les exons 2 à 11 <strong>et</strong> en ce qui concerne le FGFR3, les exons 7, 10 <strong>et</strong> 15. En ce<br />
qui concerne les mutations de P53, on utilise une matrice de 100 nanogrammes de l’ADN génomique.<br />
Les amorces utilisées dans l’étude <strong>des</strong> mutations du gène P53 <strong>et</strong> FGFR3 ont fait l’obj<strong>et</strong> de<br />
publications.<br />
Utilisation <strong>des</strong> Puces à ADN : L'analyse <strong>des</strong> nouveaux gènes potentiellement impliqués dans les<br />
groupes de <strong>tumeurs</strong> que nous avons définis sera effectuée dans le cadre de la plateforme de l’IFR10 de<br />
Créteil. Pour l’analyse du transcriptome, les puces Affym<strong>et</strong>rix U133 Plus seront utilisées avec 5 µg<br />
d’ARN par échantillon. Pour l’analyse du génome, nous utiliserons les puces CGH produites par le<br />
laboratoire de Dan Pinkel UCSF, les expériences que nous avons déjà effectuées sur quarante<br />
échantillons montrent que 300ng d’ADN par hybridation sont suffisants.<br />
Tissu Micro-Arrays/Immunohistochimie : La constitution de tissu micro-array apparaît comme<br />
indispensable pour évaluer rapidement les gènes candidats identifiés par les puces à ADN. On<br />
considère que 3 prélèvements par <strong>tumeurs</strong> sont souhaitables pour avoir un échantillon représentatif.<br />
Les analyses immunohistochimiques seront dans certains cas particuliers effectuées sur coupes<br />
congelées. Nous étudierons en particulier les voies de signalisation <strong>des</strong> EGFs (ligands, récepteurs).<br />
12
GETU<br />
Analyse : Une <strong>des</strong> étapes limitantes dans les étu<strong>des</strong> faisant appel à la technologie <strong>des</strong> puces est<br />
l’analyse. Nous avons mis en place <strong>des</strong> outils d’analyse en collaboration notamment avec l’Institut<br />
Curie (UMR144) <strong>et</strong> la société ISoft dans le cadre d’un proj<strong>et</strong> financé par le ministère de la Recherche<br />
(Biogen 74, Réseau GenHomme – BioIngénierie 2001). Ce proj<strong>et</strong> initial a été poursuivi dans le cadre<br />
d’un proj<strong>et</strong> européen (http://isoft.free.fr/hkis/) <strong>et</strong> une plate-forme d’analyse sera disponible au mois<br />
d’Octobre<br />
Nombre de suj<strong>et</strong>s nécessaires /nombre de prélèvements : Dans la précédente étude épidémiologique<br />
nous avons pu collecter 150 prélèvements sang/<strong>tumeurs</strong> sur 250 patients inclus. L’objectif est de<br />
disposer de 300 prélèvements compte tenu de l’expérience acquise <strong>et</strong> de la sélection <strong>des</strong> centres<br />
structurés pour la collection de prélèvement dans le cadre de la démarche tumorothèque à l’AP-HP<br />
,nous estimons raisonnable de collecter sur ces 3 centres 200 cas incidents sur 2 ans. Nous estimons<br />
ainsi disposer de 60 cas de <strong>tumeurs</strong> de non fumeurs <strong>et</strong> de 60 cas de patients exposés a <strong>des</strong><br />
carcinogènes professionnels. Le génotypage <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> a été effectuée sur 110 cas <strong>et</strong> le sera sur<br />
l’ensemble <strong>des</strong> prélèvements réalisés. L’analyse genomique sera réalisé sur 3 groupes de 60 <strong>tumeurs</strong><br />
non-fumeurs/Exposés/fumeurs<br />
Résultats attendus<br />
L'analyse <strong>des</strong> altérations génétique <strong>et</strong> moléculaire <strong>des</strong> gènes critiques <strong>des</strong> <strong>tumeurs</strong> urothéliales dans le<br />
cadre de ce proj<strong>et</strong> pourrait :<br />
- Apporter une aide pour relier les expositions aux carcinogènes au processus tumoral<br />
- Proposer une prise en charge médico-sociale optimale chez les patients en améliorant la<br />
reconnaissance de leur origine professionnelle<br />
- Apporter les bases moléculaires pour la compréhension de la carcinogenèse urothéliale <strong>et</strong><br />
l’identification de cibles moléculaires<br />
V. Thérapie Cellulaire de l’Incontinence Urinaire par Insuffisance sphincterienne Activités de<br />
Recherche . Dr R Yiou<br />
Evaluation de l'autogreffe de cellules précurseurs musculaires dans un modèle d'insuffisance<br />
sphinctérienne urétrale chez la truie.<br />
L’incontinence urinaire d’effort affecte 10% <strong>des</strong> femmes actives <strong>et</strong> 40% <strong>des</strong> femmes de plus de 60<br />
ans, soit au total près d’1,5 millions de femmes en France. Les dépenses publiques allouées à<br />
l’incontinence urinaire s’élèvent à plus de deux milliards d’euros par an en France. Il s’agit donc d’un<br />
véritable problème de santé publique.<br />
Les principaux facteurs étiologiques de l’incontinence urinaire sont les traumatismes obstétricaux, les<br />
accouchements multiples <strong>et</strong> la chirurgie pelvienne, en raison <strong>des</strong> dommages musculaires <strong>et</strong><br />
aponévrotiques qu’ils engendrent. Une hypermobilité vésico-urétrale <strong>et</strong>/ou une insuffisance<br />
sphinctérienne urétrale sont présentes dans la majorité <strong>des</strong> cas. L’insuffisance sphinctérienne urétrale<br />
est le résultat d’une baisse du tonus sphinctérien. Parmi les principales options thérapeutiques –<br />
médicaments, rééducation <strong>et</strong> chirurgie – seule la chirurgie a démontré une réelle efficacité dans les<br />
formes sévères d’insuffisance sphinctérienne. La mise en place d’une bandel<strong>et</strong>te sous urétrale<br />
synthétique ou aponévrotique ou l’injection péri urétrale de substances inertes, visant à augmenter la<br />
résistance à l’écoulement urinaire, constituent les traitements chirurgicaux de premières intentions.<br />
Cependant, le taux de récidives à long terme de ces techniques est relativement élevé.<br />
Chez l’homme, l’incontinence urinaire survient habituellement après une intervention sur la prostate<br />
lorsque le sphincter urétral a été lésé. La rééducation ou <strong>des</strong> injections péri urétrales sont rarement<br />
efficaces <strong>et</strong> la seule possibilité thérapeutique est bien souvent la mise en place d’un sphincter artificiel.<br />
V.1 Justification de la recherche<br />
Nous proposons une nouvelle stratégie thérapeutique de l’insuffisance sphinctérienne visant à<br />
augmenter le tonus sphinctérien par une autogreffe de cellules précurseurs musculaires (cpm).<br />
L’insuffisance sphinctérienne urétrale peut être considérée comme une myopathie complexe affectant<br />
un p<strong>et</strong>it muscle <strong>et</strong> est donc candidate pour un traitement par injection de cpm.<br />
13
GETU<br />
Depuis 1998, le Dr R. Yiou a initié une activité de recherche à l’EMI 11 INSERM <strong>et</strong> au Centre de<br />
Recherches Chirurgicales de l’hôpital Henri Mondor dans le but de m<strong>et</strong>tre au point les bases<br />
anatomiques <strong>et</strong> biologiques de la thérapie cellulaire de l’insuffisance sphinctérienne.<br />
Il a montré que le sphincter strié urétral, bien qu’ayant une origine embryologique différente<br />
(mésoderme splanchnique) <strong>des</strong> muscles striés squel<strong>et</strong>tiques (somites), dispose d’un programme de<br />
différentiation myogénique standard impliquant l’activation de cellules précurseurs musculaires<br />
sphinctériennes intrinsèques (cellules satellites) (Yiou <strong>et</strong> al., Anatomy and Embryology, 2003). Ce<br />
travail a ouvert de nouvelles perspectives de traitement de l’insuffisance sphinctérienne, s’inspirant<br />
<strong>des</strong> connaissances acquises dans le cadre <strong>des</strong> myopathies génétiquement déterminées. En eff<strong>et</strong>, <strong>des</strong><br />
traitements connus pour favoriser la régénération <strong>des</strong> muscles striés squel<strong>et</strong>tiques <strong>et</strong> agissant<br />
directement ou indirectement sur les cpm sont désormais applicables au sphincter strié urétral. Il a été<br />
montré à l’aide d’un modèle de lésion sphinctérienne transitoire chez la souris, que <strong>des</strong> cpm extraites<br />
de muscle de la patte interagissent avec les cpm sphinctériennes pour former de nouvelles fibres<br />
musculaires mosaïques <strong>et</strong> accélérer le processus de régénération (Yiou <strong>et</strong> al., 2002). Yiou <strong>et</strong> al. (2003)<br />
ont ensuite testé chez le rat l’autogreffe de cpm sur une lésion irréversible entraînant une fibrose <strong>et</strong><br />
dénervation. Ces expériences ont établi que <strong>des</strong> cpm injectées peuvent se développer dans ce contexte<br />
<strong>et</strong> activent le bourgeonnement <strong>des</strong> terminaisons nerveuses locales résiduelles. Ceci aboutit à la<br />
formation de nouvelles fibres musculaires innervées qui augmentent la force de contraction<br />
sphinctérienne obtenue par stimulation électrique. Ces résultats donnent une justification à la greffe de<br />
cpm dans le traitement de l’insuffisance sphinctérienne car c<strong>et</strong>te pathologie se caractérise sur le plan<br />
histopathologique par une perte de fibres musculaires <strong>et</strong> une dénervation chronique.<br />
L’objectif principal du proj<strong>et</strong> présenté est de démontrer qu’une greffe de cpm peut reconstituer un<br />
sphincter physiologique, c'est-à-dire capable de développer une activité tonique basale permanente,<br />
assurant la continence urinaire. La notion d’activité tonique sphinctérienne constitue la principale<br />
originalité de ce proj<strong>et</strong> de greffe de cpm. En eff<strong>et</strong>, les fibres musculaires sphinctériennes sont de type<br />
I (fonctionnement en mode anaérobie) <strong>et</strong> ont donc la particularité d’exercer <strong>des</strong> contractions toniques<br />
prolongées. S’il est bien établi que la greffe de cpm peut améliorer la force de contraction<br />
électrostimulée d’un muscle squel<strong>et</strong>tique détruit (contraction de type tétanique), il reste à déterminer si<br />
le tonus basal du muscle est aussi modifié. En d’autres termes, les cpm injectées dans un sphincter<br />
urétral ont-elles la capacité de former <strong>des</strong> fibres de type I Les résultats de nos travaux préliminaires<br />
concernant l’action trophique <strong>des</strong> cpm sur les terminaisons nerveuses résiduelles chez le rat perm<strong>et</strong>tent<br />
d’envisager c<strong>et</strong>te éventualité.<br />
IV. 2 Résultats attendus<br />
A l’aide du modèle de lésion sphinctérienne urétrale chez la truie, nous chercherons à déterminer si<br />
une greffe intrasphinctérienne de cellules précurseurs musculaires extraites de muscles périphériques<br />
peut augmenter le tonus sphinctérien. Nous déterminerons la valeur fonctionnelle <strong>des</strong> fibres<br />
musculaires résultant de la différenciation <strong>des</strong> cellules injectées par une double analyse histologique<br />
<strong>et</strong> urodynamique. L’étude histologique déterminera le type <strong>des</strong> fibres nouvellement formées (fibres de<br />
type I ) ainsi que leur état d’innervation. Le bilan urodynamique étudiera le tonus sphinctérien basal<br />
<strong>et</strong> après électrostimulation par la mesure de la pression urétrale. L’utilisation d’un logiciel de<br />
reconstruction tridimensionnelle (Surfdriver), à partir de plusieurs coupes histologiques équidistantes<br />
d’un sphincter traité <strong>et</strong> un suivi IRM perm<strong>et</strong>tra d’évaluer le volume musculaire créé. L’analyse du<br />
rapport volume musculaire créé / nombre de cellules injectées apportera les données nécessaires pour<br />
une future application chez l’homme.<br />
IV. 3 Résultats préliminaires<br />
Le modèle pré clinique d’insuffisance sphinctérienne urétrale chez la truie<br />
Afin de développer un modèle pré clinique d’insuffisance sphinctérienne, nous avons étudié au cours<br />
<strong>des</strong> années 2002-2004 (DEA <strong>des</strong> Dr L. Zini <strong>et</strong> C. Lecoeur) les caractéristiques morphologiques <strong>et</strong><br />
urodynamiques de l’appareil sphinctérien de la truie. Il a été établi que le sphincter strié urétral de c<strong>et</strong><br />
animal présente <strong>des</strong> ressemblances anatomiques <strong>et</strong> fonctionnelles avec le sphincter de l’homme ; en<br />
particulier, il est composé d’une forte proportion en fibres de type I (figure 1) <strong>et</strong> développe une activité<br />
tonique basale quantifiable.<br />
14
GETU<br />
figure 1 : étude immunohistochimique du sphincter strié urétral de truie avec un anticorps anti myosine type I <strong>et</strong><br />
II montrant la présence de fibres à action tonique<br />
Nous avons mis au point une méthode d’évaluation sphinctérienne tout à fait originale comprenant :<br />
• Un bilan urodynamique qui mesure la tonicité du sphincter strié urétral (figure 2).<br />
• Une étude du volume sphinctérien fonctionnel par IRM (collaboration avec l’Ecole Vétérinaire<br />
d’Alfort) (figure 3) <strong>et</strong> par histologie avec reconstruction tridimensionnelle à partir de coupes<br />
histologiques numérisées à intervalles réguliers (logiciel Surfdriver) (figure 4).<br />
figure 2 : bilan urodynamique sur un animal anesthésié montre une pression de clôture correspondant à la force<br />
de contraction tonique basale du sphincter strié urétral.<br />
figure 3 : IRM du sphincter strié urétral de la truie.<br />
figure 4 : Reconstruction 3D du sphincter strié urétral à partir de coupes histologiques numérisées.<br />
figure 5 : Reconstruction 3D du sphincter lésé.<br />
15
GETU<br />
Nous avons établi un modèle de lésion sphinctérienne par électrocoagulation. C<strong>et</strong>te lésion entraîne une<br />
abolition du tonus sphinctérien (figure 6) <strong>et</strong> une perte définitive <strong>des</strong> fibres musculaires <strong>et</strong> de leur<br />
innervation (figure 5,7).<br />
Figure 6: Abolition la pression intra urétrale un mois après lésion du sphincter.<br />
Figure 7 : Aspect histologique du sphincter strié urétral après lésion médiale.<br />
Mise au point de l’injection intra sphinctérienne <strong>et</strong> du suivi in vivo de l’autogreffe de cellules<br />
précurseur musculaire<br />
Nous avons développé une méthode d’extraction <strong>et</strong> de culture de cellules précurseurs musculaires de<br />
truie à partir de fibres musculaires isolées. Ces cellules peuvent être cultivées en milieu grade clinique<br />
<strong>et</strong> forment <strong>des</strong> fibres musculaires exprimant <strong>des</strong> marqueurs myogéniques (Desmine) <strong>et</strong> de cellules<br />
souches (Pax7) (figure 8). En collaboration avec l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort <strong>et</strong><br />
L’université Paris VI, nous avons mis au point différentes techniques de marquage cellulaire pour<br />
suivre l’évolution <strong>des</strong> cpm in vivo :<br />
• Marquage par adénovirus GFP (figure 9).<br />
• Marquage par nanoparticules de Fer perm<strong>et</strong>tant un suivi in vivo par IRM (figure 10).<br />
Figure 8 : Aspect <strong>des</strong> cultures de cellules précurseur musculaire de truie après 10 jours, avec immuno-marquage<br />
anti-<strong>des</strong>mine.<br />
16
GETU<br />
Figure 9 : Marquage <strong>des</strong> cellules précurseur musculaire avec un adénovirus GFP.<br />
Figure 10 : Marquage par <strong>des</strong> nanoparticules de Fer <strong>des</strong> fibres musculaire perm<strong>et</strong>tant un suivi par IRM, in vitro.<br />
Nous avons ensuite testé la faisabilité de l’injection intrasphinctérienne de cpm après repérage<br />
anatomique par voie vaginale. Nous avons établi que le sphincter strié occupe les deux derniers<br />
centimètres de l’urètre <strong>et</strong> est facilement identifiable par voie vaginale <strong>et</strong> extériorisation de l’urètre.<br />
Après lésion par électrocoagulation de la circonférence de l’urètre, une cicatrice fibreuse est visible.<br />
Le repérage par voie vaginale du sphincter urétral normal ou lésé est donc aisé. Il est ensuite possible<br />
d’introduire d’une aiguille souple de 7Fr (18Ga) de diamètre externe <strong>et</strong> de 400 mm de longueur<br />
(Porges). C<strong>et</strong>te aiguille perm<strong>et</strong> d’injecter les cellules par voie vaginale.<br />
Sont donc considérés comme acquis pour la réalisation du proj<strong>et</strong> :<br />
• La <strong>des</strong>cription anatomique de l’appareil sphinctérien chez la truie<br />
• Un modèle de lésion sphinctérienne avec évaluation histologique <strong>et</strong> urodynamique<br />
• Une méthode de culture de cellules précurseurs musculaires<br />
• Une méthode de marquage cellulaire par <strong>des</strong> adénovirus GFP <strong>et</strong> <strong>des</strong> nanoparticules de Fer<br />
• Une méthode d’injection intrasphinctérienne par voie vaginale<br />
Objectifs de la recherche<br />
L’objectif principal de notre proj<strong>et</strong> est donc d’évaluer par <strong>des</strong> métho<strong>des</strong> d’imagerie médicale (IRM),<br />
histologiques <strong>et</strong> urodynamiques l’eff<strong>et</strong> d’une autogreffe de cellules précurseurs musculaires sur le<br />
sphincter urétral de truies rendues incontinentes.<br />
Nous allons tester l’hypothèse selon laquelle <strong>des</strong> cpm extraites de muscles périphériques <strong>et</strong> injectées<br />
dans le sphincter urétral irréversiblement détruit du même animal peuvent former de nouvelles fibres<br />
musculaires fonctionnelles.<br />
Nous étudierons les capacités <strong>des</strong> cpm à migrer dans un sphincter lésé <strong>et</strong> déterminerons le nombre de<br />
sites d’injection nécessaire pour couvrir la totalité d’un sphincter.<br />
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17
GETU<br />
VI. Laparoscopie Urologique, CC. Abbou, P. Antiphon, L. Salomon<br />
VI. 1. Enseignement<br />
C<strong>et</strong> enseignement organisé par le Pr CC Abbou se déroule au CRCHM dans le cadre d’un DIU Paris<br />
XII, Faculté de Médecine de Clermond-Ferrand en partenariat avec la Société Storz. C<strong>et</strong> enseignement<br />
a permis la formation de plus de 400 participants en 5 ans par groupe de 12 personnes.<br />
VI. 2. Travail de recherche : P. Antiphon, L. Salomon, D. Chopin, CC. Abbou<br />
Planification <strong>et</strong> simulation d'interventions endoscopique standardisées <strong>et</strong> robotisées.<br />
Ce travail a été effectué en collaboration avec l'équipe ChIR <strong>et</strong> l'INRIA. L'objectif de ce travail est<br />
d'optimiser la position <strong>des</strong> trocarts au cours de la lomboscopie rétropéritonéale pour la chirurgie<br />
laparoscopique du rein <strong>et</strong> de simuler l'utilisation de robot compte tenu <strong>des</strong> contraintes spécifiques liées<br />
à c<strong>et</strong> abord chirurgical. La méthode est basée sur la mise au point d'un modèle anatomique en trois<br />
dimensions. La modélisation <strong>des</strong> déplacements per opératoires en utilisant le logiciel Stars (Simulation<br />
and Transfert Architecture for Robotic Surgery) qui a été mis au point pour la chirurgie cardiaque. Les<br />
résultats de c<strong>et</strong>te étude que l'acquisition <strong>des</strong> données anatomiques était plus aisée à partir de scanner<br />
qu'en IRM. La segmentation à été réalisée à partir d'images en deux dimensions manuelles les organes<br />
étant définis par l'injection de produits de contraste. C<strong>et</strong>te segmentation, compte tenu de la faible<br />
différente de densité entre les organes intra abdominaux, n'a pas pu être automatisée contrairement aux<br />
structures cutanées <strong>et</strong> osseuses. La reconstruction a été effectuée en plaçant le patient en position<br />
opératoire (décubitus latérale avec un billot) ce qui a permis de simuler le déplacement <strong>des</strong> organes<br />
rétro péritonéaux liés à la position chirurgicale. La reconstruction en 3 dimensions a été réalisée en<br />
utilisant le logiciel Nuage qui perm<strong>et</strong> une reconstruction en 3 dimensions de chaque élément de la<br />
région lombaire aussi bien le rein que les éléments pariétaux.<br />
18
La segmentation<br />
GETU<br />
Segmentation manuelle 2D <strong>des</strong> tissus mous.<br />
Contrôle du résultat de la segmentation.<br />
Reconstruction 3D de la fosse lombaire droite<br />
19
GETU<br />
L'acquisition de c<strong>et</strong>te modélisation a été effectuée au cours d'interventions laparoscopiques réelles<br />
utilisant <strong>des</strong> clichés per opératoires en 2 dimensions <strong>et</strong> la mise en place de repères métalliques cutanés<br />
<strong>et</strong> également sur la face postérieure du rein.<br />
La calibration est en fait en comparant les images pré <strong>et</strong> post opératoires. C<strong>et</strong>te méthode a permis de<br />
définir les zones cibles de l'organe <strong>et</strong> les points d'entrée possibles au niveau cutané. L'optimisation <strong>des</strong><br />
critères de placement <strong>des</strong> trocarts a été définis par <strong>des</strong> algorithmes mathématiques.<br />
Le placement <strong>des</strong> trocarts a été pondérés en fonction <strong>des</strong> critères suivants :<br />
• la dextérité (minimisation de l'angle entre les points d'entrée <strong>et</strong> les cibles de l'organe opéré).<br />
• La séparation (maximalisation de l'espace entre le trocart <strong>et</strong> l'évitement <strong>des</strong> collisions externes.<br />
• L'inversion (minimisation du risque de travailler à contre caméra)<br />
• La symétrie (maximalisation de la vision du champ laparoscopique<br />
• L'obstruction (minimisation du risque de collisions internes entre les instruments)<br />
20
GETU<br />
100% Obstruction 100% Séparation 100% Inversion<br />
100% Dextérité 25% O 25% S 25% I 25% D 0% O 26% S 33% I 41% D<br />
Le positionnement <strong>des</strong> trocarts peut donc être envisagé en fonction de chacun de ces critères<br />
séparément ou en fonction d'une pondération de chacun d'entre eux, ce qui perm<strong>et</strong> de calculer <strong>et</strong><br />
d'identifier de l'anatomie du patient la position optimale théorique <strong>des</strong> trocarts. Dans ce travail nous<br />
avons également étudié les conséquences spécifiques du placement <strong>des</strong> instruments de l'assistant <strong>et</strong><br />
simulé les possibilités d'utilisation du robot <strong>et</strong> du risque de collision potentielle en fonction de la<br />
position opératoire <strong>et</strong> de l'anatomie du patient.<br />
En conclusion, ce travail perm<strong>et</strong> une approche théorique <strong>et</strong> une simulation <strong>des</strong> interventions<br />
laparoscopiques ainsi que l'utilisation potentielle de la robotique chirurgicale en prévoyant les<br />
impossibilités <strong>et</strong> les conflits techniques possibles entre les instruments.<br />
__________________________<br />
21
GETU<br />
GROUPE D'ETUDES DES TUMEURS UROLOGIQUES<br />
Publications 2001 - 2004<br />
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