Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche ...

Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche protéomique
de l’information et par définition le
génome est statique alors que les protéines
exprimées sont des principes
actifs doués de fonctions au sein de
la machinerie cellulaire. Le niveau
d’expression des ARNm n’est pas forcément
le reflet de la nature de l’ensemble
des protéines contenues dans
la cellule tumorale. La traduction des
ARNm en protéines est en effet soumise
à un grand nombre de régulations
post-transcriptionnelles et posttraductionnelles
(glycosylation,
phosphorylation, acétylation…) dont
le rôle est déterminant pour le pouvoir
oncogénique. Ainsi, il a été démontré
que des transformations entre
tumeur bénigne et maligne sont
parfois dues a des modifications posttraductionnelles
non détectées par
l’analyse des ARNm [1].
L’ensemble des protéines contenues
dans la cellule tumorale est encore
plus vaste et plus complexe que le
génome. L’étude de leur nature, de
leur dynamique et de leurs interactions
(cellule tumorale vs cellule
stromale) est donc essentielle pour
une meilleure compréhension des
mécanismes d’initiation, de progression
tumorale et de dissémination
métastatique.
LES MÉTHODES D’ANALYSE
PROTÉOMIQUE
!Le protéome, terme proposé en
1995 par M.R. Wilkins, désigne l’ensemble
des protéines exprimées par
le génome d’une cellule, d’un tissu
ou d’un organe, à un instant donné
et dans un environnement donné.
Son analyse permet une description
dynamique de la régulation de l’expression
des gènes. Elle associe l’étude
des protéines et de leurs modifications
post-traductionnelles, l’identification
des protéines constituant un
complexe protéique (interaction protéine-protéine),
la recherche et l’identification
de protéines impliquées
dans les voies de signalisation.
L’approche protéomique est fondée
sur le couplage de trois technologies
de pointe :
- l’électrophorèse bi-dimensionnelle
(2-DE) qui permet de séparer plusieurs
milliers de protéines d’un
même échantillon,
- la spectrométrie de masse (MS) qui
permet d’identifier ces protéines et
de mettre en évidence leurs modifications
post-traductionnelles,
- la bioinformatique qui permet la
quantification du niveau des protéines
et la constitution de bases de
données.
Méthode classique de
protéomique
!La méthode classique d’électrophorèse
bi-dimensionnelle associée à la
spectrométrie de masse (MALDI-TOF)
repose sur la séparation des protéines
en fonction de deux caractéristiques
biochimiques : le point isoélectrique
(PI) et la masse moléculaire.
La première dimension sépare les
protéines contenues dans l’échantillon
biologique par isoélectro-focalisation
selon leur PI dans un gel à
gradient de pH immobilisé large (pH
3-10) ou étroit (pH 4-7) ou étroit (pH
4-5). La deuxième dimension utilise
l’électrophorèse dénaturante en gel
de polyacrylamide en présence de
SDS qui sépare les protéines selon
leur masse. Une fois la 2-DE réalisée,
les protéines sont révèlées selon différentes
méthodes de détection et les
images, captées par le scanning des
gels, sont traitées par des logiciels
d’analyse d’image dédiés à la
protéomique. Ces logiciels permettent
l’acquisition des données, la diminution
du bruit de fond, l’élimination
des défauts sur les gels, le dénombrement
des taches, leur comparaison
en analyse différentielle, leur
quantification par les mesures d’intensité
et de volume. Les taches d’intérêt,
chacune pouvant contenir une
ou plusieurs protéines, sont découpées
des gels et traitées individuellement
selon des protocoles précis
d’hydrolyse trypsique : déshydratation
du gel, extraction des peptides,
dessalage de l’hydrolysat peptidique
déposé sur plaque spéciale et séché.
L’identification des protéines se fait
par spectrométrie de masse de type
MALDI-MS (Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionisation–Mass
Spectrometry) ou ESI-MS (Electrospray
ionisation) couplée à la chromatographie
liquide (LC). La tache du
mélange séché est bombardée sous
vide par un laser pulsé à 337nm qui
excite les molécules et ionise les
peptides entraînés dans le champ
électrique d’un aimant, qui accélère
les ions vers un détecteur. Tous les
MALDI-MS actuels permettent une
acquisition automatique des données
et des bombardements programmables.
Ils sont équipées du mode de
détection en Temps de Vol (TOF ou
Time ou Flight) et du mode
Réflectron, l’arrivée des peptides
chargés se faisant dans le détecteur
TOF dans l’ordre croissant de masse,
les plus lourds étant ralentis voir éliminés,
le Réflectron permettant de
focaliser la distribution isotopique et
d’améliorer la résolution en diminuant
la dispersion isotopique. L’automatisation
de toutes ces étapes, de la
2DE à l’analyse par MALDI-MS correspond
à ce que l’on appelle la
protéomique à haut débit menant à
identifier plusieurs centaines de protéines
dans un même échantillon.
Deux logiciels MASCOT et
PROFOUND fondés sur des algorithmes
différents permettent d’interroger
les principales banques de données
protéiques SWISSPROT,
PROTSITE et celle de la NCBI (US
National Center for Biology Information)
qui contiennent les traductions
des séquences d’ADN de la GeneBank
et les résultats de clivage par les
protéases de séquences peptidiques
connues. La masse des peptides générés
par la trypsine est comparée
aux cartes peptidiques massives théoriques
déduites des séquences de
chaque protéine présentes dans les
banques de données. Mais la masse
d’un seul peptide ne permet pas
d’identifier la protéine dont il est issu.
Il en faut au moins cinq identiques
aux séquences trouvées dans la protéine.
Le logiciel donne dans l’ordre
statistique décroissant la probabilité
d’identifier la protéine. Dans une tache
de 2-DE, plusieurs protéines peuvent
coexister et le MALDI-MS est capable
de les découvrir en même
temps, le logiciel triant les peptides
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Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1