Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche ...

J. Solassol
Identification de marqueurs tumoraux sériques
par approche protéomique.
Jérôme Solassol
Hôpital Arnaud de Villeneuve - INSERM U540 - Montpellier
Résumé
Les développements récents dans la séparation des protéines, l’analyse des modifications
post-traductionnelles et la protéomique à haut débit et des protéines arrays marquent le début de
l’ère post-génomique. L’avènement récent de nouveaux outils de protéomique, faisant appel à des
techniques de biopuces à protéines, a totalement modifié les perspectives dans ce domaine et a
permis l’émergence du concept de profil d’expression protéique, véritable signature moléculaire
de la tumeur. L’approche protéomique par la technologie SELDI-TOF permet d’identifier des
protéines fonctionnelles et vise, par l’analyse différentielle, à rechercher et préciser leur spécificité
pour la découverte de nouveaux marqueurs tumoraux potentiellement utiles au diagnostic, au
pronostic, au suivi thérapeutique et à l’appréciation prédictive de la réponse au traitement. Les
limites technologiques et le défi analytique de gestion de données à grande échelle sont encore
manifestes. C’est par une approche complémentaire et structurante de la génomique et de la
protéomique que les progrès immédiats peuvent être attendus dans les nouvelles approches diagnostiques
et thérapeutiques des cancers.
Protéomique / Marqueurs tumoraux
!Les connaissances en biologie des
cancers ont considérablement évolué
ces vingt dernières années. Parallèlement
aux innovations technologiques,
de nouvelles définitions moléculaires
et fonctionnelles des tumeurs
solides sont apparues aboutissant
au concept de signature moléculaire
des tumeurs, reflet de l’ensemble
des événements moléculaires
survenant lors du processus tumoral.
Ces événements résultent de
l’implication directe des produits de
l’activité de certains gènes, des fonctions
intégrées provenant des molécules
organiques synthétisées par la
cellule, d’une dérégulation de l’homéostasie
tumorale par des phénomènes
inflammatoires et/ou des modifications
d’activité enzymatique.
L’oncogénèse correspond ainsi à un
processus multi-étapes d’accumulation
au sein des cellules, d’altérations
moléculaires propres à chaque stade
du développement tumoral. Dans le
domaine des altérations génétiques,
les puces à ADN ont permis d’analyser
l’expression génique à l’échelle
du génome et d’identifier un nombre
très élevé d’événements moléculaires
associés à la tumorigénèse. Mais
ces gènes ne sont que les supports
Correspondance : Jérôme Solassol
Hôpital Arnaud de Villeneuve - INSERM U540 - 191 Avenue du Doyen Giraud - 34295 Montpellier Cedex 5 - France
Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1 31

Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche protéomique
de l’information et par définition le
génome est statique alors que les protéines
exprimées sont des principes
actifs doués de fonctions au sein de
la machinerie cellulaire. Le niveau
d’expression des ARNm n’est pas forcément
le reflet de la nature de l’ensemble
des protéines contenues dans
la cellule tumorale. La traduction des
ARNm en protéines est en effet soumise
à un grand nombre de régulations
post-transcriptionnelles et posttraductionnelles
(glycosylation,
phosphorylation, acétylation…) dont
le rôle est déterminant pour le pouvoir
oncogénique. Ainsi, il a été démontré
que des transformations entre
tumeur bénigne et maligne sont
parfois dues a des modifications posttraductionnelles
non détectées par
l’analyse des ARNm [1].
L’ensemble des protéines contenues
dans la cellule tumorale est encore
plus vaste et plus complexe que le
génome. L’étude de leur nature, de
leur dynamique et de leurs interactions
(cellule tumorale vs cellule
stromale) est donc essentielle pour
une meilleure compréhension des
mécanismes d’initiation, de progression
tumorale et de dissémination
métastatique.
LES MÉTHODES D’ANALYSE
PROTÉOMIQUE
!Le protéome, terme proposé en
1995 par M.R. Wilkins, désigne l’ensemble
des protéines exprimées par
le génome d’une cellule, d’un tissu
ou d’un organe, à un instant donné
et dans un environnement donné.
Son analyse permet une description
dynamique de la régulation de l’expression
des gènes. Elle associe l’étude
des protéines et de leurs modifications
post-traductionnelles, l’identification
des protéines constituant un
complexe protéique (interaction protéine-protéine),
la recherche et l’identification
de protéines impliquées
dans les voies de signalisation.
L’approche protéomique est fondée
sur le couplage de trois technologies
de pointe :
- l’électrophorèse bi-dimensionnelle
(2-DE) qui permet de séparer plusieurs
milliers de protéines d’un
même échantillon,
- la spectrométrie de masse (MS) qui
permet d’identifier ces protéines et
de mettre en évidence leurs modifications
post-traductionnelles,
- la bioinformatique qui permet la
quantification du niveau des protéines
et la constitution de bases de
données.
Méthode classique de
protéomique
!La méthode classique d’électrophorèse
bi-dimensionnelle associée à la
spectrométrie de masse (MALDI-TOF)
repose sur la séparation des protéines
en fonction de deux caractéristiques
biochimiques : le point isoélectrique
(PI) et la masse moléculaire.
La première dimension sépare les
protéines contenues dans l’échantillon
biologique par isoélectro-focalisation
selon leur PI dans un gel à
gradient de pH immobilisé large (pH
3-10) ou étroit (pH 4-7) ou étroit (pH
4-5). La deuxième dimension utilise
l’électrophorèse dénaturante en gel
de polyacrylamide en présence de
SDS qui sépare les protéines selon
leur masse. Une fois la 2-DE réalisée,
les protéines sont révèlées selon différentes
méthodes de détection et les
images, captées par le scanning des
gels, sont traitées par des logiciels
d’analyse d’image dédiés à la
protéomique. Ces logiciels permettent
l’acquisition des données, la diminution
du bruit de fond, l’élimination
des défauts sur les gels, le dénombrement
des taches, leur comparaison
en analyse différentielle, leur
quantification par les mesures d’intensité
et de volume. Les taches d’intérêt,
chacune pouvant contenir une
ou plusieurs protéines, sont découpées
des gels et traitées individuellement
selon des protocoles précis
d’hydrolyse trypsique : déshydratation
du gel, extraction des peptides,
dessalage de l’hydrolysat peptidique
déposé sur plaque spéciale et séché.
L’identification des protéines se fait
par spectrométrie de masse de type
MALDI-MS (Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionisation–Mass
Spectrometry) ou ESI-MS (Electrospray
ionisation) couplée à la chromatographie
liquide (LC). La tache du
mélange séché est bombardée sous
vide par un laser pulsé à 337nm qui
excite les molécules et ionise les
peptides entraînés dans le champ
électrique d’un aimant, qui accélère
les ions vers un détecteur. Tous les
MALDI-MS actuels permettent une
acquisition automatique des données
et des bombardements programmables.
Ils sont équipées du mode de
détection en Temps de Vol (TOF ou
Time ou Flight) et du mode
Réflectron, l’arrivée des peptides
chargés se faisant dans le détecteur
TOF dans l’ordre croissant de masse,
les plus lourds étant ralentis voir éliminés,
le Réflectron permettant de
focaliser la distribution isotopique et
d’améliorer la résolution en diminuant
la dispersion isotopique. L’automatisation
de toutes ces étapes, de la
2DE à l’analyse par MALDI-MS correspond
à ce que l’on appelle la
protéomique à haut débit menant à
identifier plusieurs centaines de protéines
dans un même échantillon.
Deux logiciels MASCOT et
PROFOUND fondés sur des algorithmes
différents permettent d’interroger
les principales banques de données
protéiques SWISSPROT,
PROTSITE et celle de la NCBI (US
National Center for Biology Information)
qui contiennent les traductions
des séquences d’ADN de la GeneBank
et les résultats de clivage par les
protéases de séquences peptidiques
connues. La masse des peptides générés
par la trypsine est comparée
aux cartes peptidiques massives théoriques
déduites des séquences de
chaque protéine présentes dans les
banques de données. Mais la masse
d’un seul peptide ne permet pas
d’identifier la protéine dont il est issu.
Il en faut au moins cinq identiques
aux séquences trouvées dans la protéine.
Le logiciel donne dans l’ordre
statistique décroissant la probabilité
d’identifier la protéine. Dans une tache
de 2-DE, plusieurs protéines peuvent
coexister et le MALDI-MS est capable
de les découvrir en même
temps, le logiciel triant les peptides
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J. Solassol
appartenant aux unes et aux autres.
Lorsque la protéine n’est pas présente
dans la banque de données, il est possible
d’obtenir des informations sur
la séquence en acides aminés des
peptides trypsiques en mode MS/MS
(double spectrométrie) à l’aide d’un
spectromètre de masse de type nanoelectro-spray.
Méthode de "puces" à protéines
!Une nouvelle méthode est apparue
appelée SELDI-TOF pour Surface
Enhanced Laser Desorption Ionisation
- Time of Flight. Développée par
Ciphergen biosystems, cette
plateforme protéomique associe le
principe de "puce" à la spectrométrie
de masse. La séparation, la détection
et l’analyse des protéines se font directement
à partir de l’échantillon
biologique avec une sensibilité de
l’ordre de la femtomole. En pratique,
quelques microgrammes de protéines
issues d’échantillonf variés (liquides
biologiques, extraits cellulaire ou
tissulaire) sont directement adsorbés
sur une surface de 2 mm 2 (spot) présentant
des propriétés chromatographiques
variées. En fonction de la
surface chromatographique, le mélange
protéique subit un fractionnement
qui dépend de la propriété chimique
(anionique, cationique, hydrophobe,
hydrophile ou d’affinité aux
métaux) ou biologique (liaison à un
anticorps, un peptide, un récepteur,
un ligand ou un acide nucléique).
Après une série d’étapes de lavage, la
puce à protéine est introduite dans
un spectromètre de masse. Sous l’action
du rayonnement laser, les protéines
liées à la "puce" sont
désorbées/ionisées et analysées en
terme de masse sur charge (m/z)
d’après leur temps de vol pour atteindre
le détecteur. Les signaux traités
par des moyens informatiques sont
traduits en spectre d’abondance relative
vs la masse moléculaire des espèces
détectées. Au final, on obtient
une vue d’ensemble de peptides et
de protéines présents dans l’échantillon
sous la forme de profils protéiques.
Ces derniers sont ensuite normalisés
et calibrés afin de limiter les
biais liés à l’opérateur, à la surface
chromatique ou à l’instrumentation
elle-même.
Ce système est particulièrement intéressant
en analyse différentielle de
type patient/témoin pour mettre en
évidence des profils d’expression
spécifiques. L’analyse statistique de
l’ensemble de ces données est une
des étapes les plus importantes de
l’étude protéomique. Si l’on traite suffisamment
d’échantillons en parallèle,
le logiciel permettant la superposition
de profils pourra établir une statistique
en fonction d’une multitude
d’algorithmes informatiques basés
sur des analyses statistiquement
multivariées (analyse discriminante,
classification hiérarchique…). Ces
algorithmes permettent d’analyser
des données complexes et d’extraire
des spectres de masse la meilleure
combinaison de marqueurs capables
de discriminer chacun des groupes
patient/témoin. Par la suite, l’identification
de marqueurs potentiels nécessite
des étapes de purification supplémentaires
par des méthodes
électrophorétiques ou chromatographiques
classiques afin de caractériser
précisément des protéines d’intérêt.
Cette dernière méthode d’analyse
protéique par SELDI-TOF est une approche
d’accès assez facile sur le plan
technique et de coût acceptable. Méthode
de microanalyse réalisée à partir
de faibles quantités protéiques de
l’ordre du microgramme, elle a une
capacité d’analyse à haut débit des
échantillons, elle permet l’établissement
de profils d’expression protéique
à partir de mélanges complexes,
ce qui facilite son application clinique.
Elle est toutefois encore limitée
dans la taille des protéines qu’elle
peut analyser.
PROTÉOMIQUE ET
APPLICATIONS CLINIQUES DE
LA PLATEFORME SELDI-TOF
!Les premiers travaux publiés par
Petricoin et coll. en 2002 utilisant les
puces à protéines ont consisté à analyser
le sérum de malades atteints de
cancer de l’ovaire et de cancer de la
prostate [2, 3]. Ils rapportaient qu’un
profil protéique spécifique sans identification
de marqueur d’intérêt était
capable de diagnostiquer ce cancer
au stade infra-clinique avec une spécificité
de 95%, une sensibilité de
100% et une valeur prédictive positive
de 94% et de différentier le cancer
de la prostate de l’hyperplasie
bénigne [3]. D’autres exemples pouvaient
être donnés dans le cancer
colo-rectal [4], le cancer du sein [5-
8], l’hépatocarcinome [9], le mélanome
[10] et le cancer du pancréas
[11]. Dans le cancer de la vessie, l’analyse
de protéines urinaires a permis
d’améliorer le diagnostic précoce en
comparaison de l’analyse cytologique
standard des urines [12].
Ces premiers résultats apparemment
spectaculaires et prometteurs ont été
rapidement critiqués, en particulier
par Diamandis, le principal défaut de
la technologie SELDI résidant dans sa
faible reproductibilité [13]. Plusieurs
groupes de recherche utilisant les
mêmes approches expérimentales et
travaillant sur la même pathologie
n’ont pas mis en évidence les mêmes
pics permettant de discriminer le tissu
normal du tissu pathologique et ont
proposé des marqueurs ou des profils
protéiques différents [14]. Les différences
observées dans les profils
protéiques entre sérum contrôle et
sérum des malades porteurs de cancer
n’étaient donc pas exclusivement
liés au cancer. Diamandis a mis en
exergue de nombreux paramètres
qui affectent la reproductibilité de
cette technique : la variabilité dans le
recueil des échantillons, leur traitement,
le type de conservation, la diversité
des groupes de patients, leur
statut hormonal, leurs habitudes alimentaires,
l’usage de médicament,
ainsi que les biais statistiques ou la
variation de la stabilité des spectromètres
de masse et /ou des puces à
protéines [15]. De même la complexité
des outils informatiques augmente
la probabilité d’interprétation
erronée et de résultats non reproductibles.
Par ailleurs, la sensibilité de la détection
n’atteint pas les concentrations
inférieures à un microgramme par mL
alors que les marqueurs tumoraux
Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1 33

Identification de marqueurs tumoraux sériques par approche protéomique
usuels sont à des concentrations
beaucoup plus faibles et ne sont donc
pas suffisamment détectés. De sorte
que jusqu’à présent, dans les quelques
cas où la caractérisation des
marqueurs a été effectuée, les protéines
identifiées correspondent à des
protéines majoritaires du sérum. Il
s’agit de l’Apolipoprotéine A, des formes
tronquées de la transthyrétine,
de la chaîne lourde de l’inhibiteur de
l’alpha trypsine dans le cancer de
l’ovaire [14], de la sous-unité alpha
de l’haptoglobine dans une autre
étude sur le cancer de l’ovaire [16],
de l’hepatocarcinoma Intestine-Pancréas/Pancreatitis-associated
Protein-
I dans le cancer du pancréas [9, 17],
des alpha 1 et alpha 2 défensine dans
la cancer de la vessie [12] ou encore
d’une protéine de liaison à la Vitamine
D dans le cancer de la prostate
[18]. Une des questions posée est de
savoir si ces marqueurs ont leur expression
altérée spécifiquement en
réponse à la prolifération tumorale ou
de manière non spécifique en réponse
à des épiphénomènes dépendant
de la tumeur.
Les biomarqueurs identifi2s jusqu’ici
par SELDI-TOF s’avèrent pour la plupart
être des protéines majoritaires de
la réponse inflammatoire produites
par l’environnement peri-tumoral ou
par les cellules immunitaires plutôt
que par la tumeur elle-même [15, 19,
20]. Ces protéines sont néanmoins
potentiellement instructives s’il est
démontré qu’il s’agit de fragments
protéolytiques dérivés des protéines
inflammatoires de la tumeur, spécifiques
de chaque tumeur en fonction
de son contenu enzymatique [20].
L’observation par Liotta et coll. que
certain des marqueurs identifiés par
SELDI-TOF sont des formes clivées de
protéines sériques de plus haut poids
moléculaire, fait avancer l’hypothèse
que l’abondance de ces marqueurs
clivés est le reflet direct d’événements
pathologiques induits par le
microenvironnement tumoral [21].
Des études récentes montrent que
l’équilibre entre des protéases et
leurs inhibiteurs cellulaires est modifié
dans le sérum et le tissu des
patients en réponse à la prolifération
tumorale [22]. Différentes familles de
protéases comme les métalloprotéases
ou kallikréines plasmatiques
et tissulaires ont leur expression
augmentée ou diminuée dans certains
cancers [23-25]. Ces modifications
de l’expression auraient alors
un retentissement direct sur la capacité
des protéases à cliver des protéines
sériques et à générer ainsi une
signature moléculaire spécifique.
Diamendis stipule que le rapport entre
les protéines majoritaires telles
que l’albumine et les immunoglobulines
et les protéines minoritaires est
tel qu’il est impossible en l’état actuel
de détecter ces protéines minoritaires,
malgré la bonne sensibilité de
la technique SELDI-TOF [15]. Ainsi, le
PSA qui fait partie des protéases dont
l’expression est augmentée dans les
cancers de la prostate [26], n’a jamais
pu être identifiée par le SELDI-TOF. En
fait, il existe d’autres méthodes qui
permettent d’augmenter la concentration
relative des protéines faiblement
représentées. Elles passent par des
étapes successives de pré-fractionnement,
de chromatographie, de précipitation
sélective et de déplétion des
protéines majoritaires [27-30]. Ces
techniques "d’enrichissement" des
protéines peu représentées doivent,
pour être efficaces, éviter l’introduction
de biais supplémentaires. La détection
de cette fraction "mineure" du
sérum, véritable face cachée de l’iceberg,
est un défi technologique qu’il
faut relever pour assurer le développent
fiable du diagnostic des formes
précoces des cancers.
CONCLUSION
!Les nouvelles technologies d’analyse
protéomique prennent leur place
dans l’ère post-génomique. Les premiers
résultats mettent en évidence
le potentiel des analyses à large
échelle en particulier pour l’identification
des profils protéiques différents
dont il est nécessaire d’établir
le rapport avec les mécanismes
physiopathologiques du processus
tumoral. Les limitations technologiques
et les défis analytiques sont encore
élevés et des progrès importants
s’imposent pour établir la complémentarité
entre protéomique d’expression
et protéomique d’interaction.
A l’instar du programme visant à établir
la Carte d’Identité des Tumeurs
Humaines par l’analyse du
transcriptome, l’approche complémentaire,
du gène à la protéine fonctionnelle,
alliant génomique et
protéomique, devrait faire l’objet de
programmes nationaux coordonnés
entre les diverses plateformes
protéomiques cancérologiques pour
concrétiser dans les meilleurs délais
la caractérisation des marqueurs et le
développement de tests non invasifs
prédictifs et diagnostiques des formes
précoces de cancer les plus accessibles
aux moyens thérapeutiques
actuels.
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Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1

J. Solassol
Proteomic approach to tumor marker discovery
A key challenge in clinical proteomic of cancer is the identification of biomarkers that
would allow early detection, diagnosis and monitor progression of the disease to improve longterm
survival of patients. Recent advances in proteomic instrumentation and computational
methodologies offer unique chance to rapidly identify these new candidate markers or pattern of
markers. The combination of retentate affinity chromatography and surfaced-enhanced laser
desorption/ionization time-of-flight (SELDI-TOF) mass spectrometry is one of the most interesting
new approaches for cancer diagnosis using proteomic profiling. This review aims to summarize
the results of studies that have used this new technology method for the early diagnosis of human
cancer. Despite promising results, the use of the proteomic profiling as a diagnostic tool brought
some controversies and technical problems and still requires some efforts to be standardised and
validated.
Proteomic / Tumor biomarkers
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