MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

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Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion Afin de s’assurer que la détection est spécifique de la PrPsc, les mêmes essais ont été réalisés en parallèle avec un traitement à la protéinase K avant élution. Les résultats de ces essais sont présentés sur la figure III-13(b) et montrent la présence de PrP résiduelle résistante à la protéinase K. Cela confirme donc que les signaux observés sur la figure III-13(a) sont spécifiques de la PrPsc résiduelle et constitue également une confirmation des performances de chaque procédé vis-à-vis de la protéine prion du vMCJ. Lorsque l’Aniosyme N2 est utilisé en première intention dans le double nettoyage, la quantité de PrPsc résiduelle est inférieure à la limite de détection de notre méthode. Outre le traitement à la protéinase K, les essais menés sur de la protéine prion normale (PrPc) en milieu lipidique cérébral pourraient également nous permettre de démontrer la spécificité de notre méthode. En effet, lorsqu’une salissure exempte de PrPsc, mais préparée dans les mêmes conditions, est utilisée pour évaluer l’efficacité des procédés, la PrPc n’est jamais détectée (figure III-14). Seul le contrôle de l’adsorption sans traitement à la protéinase K est observé et témoigne de la présence effective de la PrPc avant nettoyage. Le signal de la PrPc disparaît lorsque les fils sont traités à la protéinase K puisque cette isoforme est sensible à la digestion enzymatique. Cela suggère à la fois une bonne efficacité de l’ensemble des procédés vis-à-vis de la PrPc adsorbée et également que la PrP détectée dans le cas de la salissure du vMCJ est bien l’isoforme pathologique de la protéine. Protéinase K - Protéinase K + T ads N2 N2-DD1 DD1-DD1 T ads N2 N2-DD1 DD1-DD1 Figure III-14 : Détection indirecte de la protéine prion cellulaire résiduelle par Western blot Certaines observations viennent néanmoins compliquer cette interprétation. La première observation concerne la quantité de PrPc adsorbée. Bien que la salissure de PrPc soit préparée dans les mêmes conditions que la PrPsc, la quantité de PrPc adsorbée sur les fils n’est pas comparable à celle de la PrPsc. Cela est dû d’une part au fait que la quantité de PrPc dans un cerveau est moins importante comparativement à celle de la PrPsc puisque cette dernière s’accumule. Le cerveau d’une souris malade contiendrait cinq fois plus de PrP que celui d’une souris saine [Flechsig, et al. 2001]. D’autre part, les techniques mises en œuvre pour la concentration de la protéine prion sont relativement spécifiques de l’isoforme pathologique [Wadsworth, et al. 2001]. Ainsi, si les procédés peuvent être évalués sur 4 log de PrP dans le cas du vMCJ, cette sensibilité est réduite à 1,5 log dans le cas de la PrPc. La seconde observation concerne la composition enzymatique des formulations Aniosyme N2 et DD1. La PrPc étant sensible aux protéases, ces enzymes vont donc dégrader la PrPc pendant la phase de nettoyage. Cependant, si ces enzymes sont actives sur la PrPc, leur activité devrait également être observée sur la PrPsc et se traduire par une diminution des masses moléculaires des différentes glycoformes, comme cela est observé suite à une digestion par la protéinase K. Or, si l’on observe le signal obtenu pour le double nettoyage par l’Aniosyme DD1 sur la figure III-13(a), les masses moléculaires des glycoformes ne sont - 82 -
Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion pas différentes de celles observées pour le contrôle de l’adsorption. Cela pose donc la question de la part de l’activité enzymatique dans les procédés de nettoyage. En résumé, la faible sensibilité offerte par la salissure de PrPc et les interrogations concernant le rôle des enzymes dans le nettoyage compromet, en l’état actuel de nos connaissances, la possibilité d’une détection indirecte et spécifique de la PrPsc sans confirmation préalable par un traitement à la protéinase K. Efficacité des procédés de nettoyage vis-à-vis des salissures protéiques PrPsc et PrPres du vMCJ : Les méthodes précédentes : le PND, la méthode isotopique et la méthode de détection directe de la PrPres sur support, nous ont permis de constater une incidence possible de la nature de la salissure sur l’efficacité du procédé. En effet, des formulations présentant des PND élevés sur une salissure riche en lipides s’avéraient peu efficaces vis-à-vis d’une salissure protéique. Bien que ces salissures protéiques ne soient pas représentatives de la nature réelle des salissures, nous souhaitions vérifier ces observations visà-vis de la protéine prion. Nous avons donc évalué les procédés du double nettoyage par les Aniosyme N2 et DD1 sur de la PrPsc et de la PrPres (partiellement) purifiées provenant du vMCJ. Les résultats sont présentés sur la figure III-15(a) pour la PrPsc et III-15(b) pour la PrPres. (a) PrPsc (b) PrPres N2-N2 N2-DD1 DD1-DD1 2 log 2.6 log vMCJ N2-N2 N2-DD1 DD1-DD1 2 log 2.6 log 30 kDa 27 kDa 22 kDa 30 kDa 27 kDa 22 kDa Figure III-15 : Détection indirecte de la PrPsc résiduelle (a) et de la PrPres résiduelles (b) du vMCJ par Western blot. Quel que soit le procédé du double nettoyage testé, la PrPsc résiduelle est détectée par Western blot. Une classification des performances est cependant possible. Le double nettoyage par l’Aniosyme N2 est plus efficace que le double nettoyage par les Aniosyme N2 et DD1, lui-même plus efficace que le double emploi de l’Aniosyme DD1. Dans le cas du double nettoyage par l’Aniosyme N2, nous constatons une digestion partielle de la PrPsc objectivée par une diminution des poids moléculaires de l’ensemble des glycoformes, donnant une allure caractéristique de la PrPres du vMCJ. Ceci témoigne d’une activité enzymatique des protéases contenues dans cette formulation. La PrP détectée est donc de la PrPres. Ce résultat nous permet également de suggérer une activité des protéases de la formulation, à la surface des supports, sur les protéines adsorbées. Pour le procédé Aniosyme N2 puis DD1, la diminution des masses moléculaires des glycoformes ne semble que partielle. Cette diminution n’étant pas observée pour le double nettoyage par l’Aniosyme DD1, ceci traduit une activité enzymatique plus ou moins efficace suivant la formulation puisque les concentrations et la nature des enzymes sont identiques pour les deux formulations. - 83 -
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N° d’ordre 2006-21 Année 2006 T
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SOMMAIRE INTRODUCTION GENERALE CHAP
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