MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion
Afin de s’assurer que la détection est spécifique de la PrPsc, les mêmes essais ont été réalisés en parallèle
avec un traitement à la protéinase K avant élution. Les résultats de ces essais sont présentés sur la figure
III-13(b) et montrent la présence de PrP résiduelle résistante à la protéinase K. Cela confirme donc que
les signaux observés sur la figure III-13(a) sont spécifiques de la PrPsc résiduelle et constitue également
une confirmation des performances de chaque procédé vis-à-vis de la protéine prion du vMCJ. Lorsque
l’Aniosyme N2 est utilisé en première intention dans le double nettoyage, la quantité de PrPsc résiduelle
est inférieure à la limite de détection de notre méthode.
Outre le traitement à la protéinase K, les essais menés sur de la protéine prion normale (PrPc) en milieu
lipidique cérébral pourraient également nous permettre de démontrer la spécificité de notre méthode. En
effet, lorsqu’une salissure exempte de PrPsc, mais préparée dans les mêmes conditions, est utilisée pour
évaluer l’efficacité des procédés, la PrPc n’est jamais détectée (figure III-14). Seul le contrôle de
l’adsorption sans traitement à la protéinase K est observé et témoigne de la présence effective de la PrPc
avant nettoyage. Le signal de la PrPc disparaît lorsque les fils sont traités à la protéinase K puisque cette
isoforme est sensible à la digestion enzymatique. Cela suggère à la fois une bonne efficacité de
l’ensemble des procédés vis-à-vis de la PrPc adsorbée et également que la PrP détectée dans le cas de la
salissure du vMCJ est bien l’isoforme pathologique de la protéine.
Protéinase K - Protéinase K +
T ads
N2
N2-DD1
DD1-DD1
T ads
N2
N2-DD1
DD1-DD1
Figure III-14 : Détection indirecte de la protéine prion cellulaire résiduelle par Western blot
Certaines observations viennent néanmoins compliquer cette interprétation. La première observation
concerne la quantité de PrPc adsorbée. Bien que la salissure de PrPc soit préparée dans les mêmes
conditions que la PrPsc, la quantité de PrPc adsorbée sur les fils n’est pas comparable à celle de la PrPsc.
Cela est dû d’une part au fait que la quantité de PrPc dans un cerveau est moins importante
comparativement à celle de la PrPsc puisque cette dernière s’accumule. Le cerveau d’une souris malade
contiendrait cinq fois plus de PrP que celui d’une souris saine [Flechsig, et al. 2001]. D’autre part, les
techniques mises en œuvre pour la concentration de la protéine prion sont relativement spécifiques de
l’isoforme pathologique [Wadsworth, et al. 2001]. Ainsi, si les procédés peuvent être évalués sur 4 log de
PrP dans le cas du vMCJ, cette sensibilité est réduite à 1,5 log dans le cas de la PrPc.
La seconde observation concerne la composition enzymatique des formulations Aniosyme N2 et DD1. La
PrPc étant sensible aux protéases, ces enzymes vont donc dégrader la PrPc pendant la phase de nettoyage.
Cependant, si ces enzymes sont actives sur la PrPc, leur activité devrait également être observée sur la
PrPsc et se traduire par une diminution des masses moléculaires des différentes glycoformes, comme cela
est observé suite à une digestion par la protéinase K. Or, si l’on observe le signal obtenu pour le double
nettoyage par l’Aniosyme DD1 sur la figure III-13(a), les masses moléculaires des glycoformes ne sont
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