MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion
Western blot :
Les protéines de l’éluât sont séparées par électrophorèse SDS/PAGE puis transférées sur une membrane
de PVDF. La PrP est détectée sur la membrane par une méthode indirecte utilisant un anticorps primaire
de souris anti-PrP et un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la peroxydase. La révélation est
réalisée par chimiluminescence. Les conditions opératoires sont présentées dans l’Annexe 3.
III.2.3. Résultats et discussion
Efficacité des procédés de nettoyage vis-à-vis de la PrPsc du vMCJ en milieu lipidique
cérébral :
Dans un premier temps, le double nettoyage par les formulations Aniosyme N2 et DD1 a été évalué vis-àvis
de la « PrPsc en milieu lipidique cérébral » du vMCJ.
Trois procédés du double nettoyage sont testés :
- Le double nettoyage par l’Aniosyme N2 (N2-N2) ;
- Le double nettoyage par l’Aniosyme N2 puis par l’Aniosyme DD1 (N2-DD1) ;
- Le double nettoyage par l’Aniosyme DD1 (DD1-DD1).
Un contrôle de l’efficacité de l’Aniosyme N2 en première intention, sur 10 minutes, est également réalisé
(N2). L’essai contrôle de l’adsorption est inclus et est exprimé en nombre de log de PrP éluée.
Les résultats obtenus pour ces procédés sont présentés sur la figure III-13(a).
(a)
Protéinase K -
(b)
Protéinase K +
N2
N2-N2
N2-DD1
DD1-DD1
2 log
2.6 log
vMCJ
N2
N2-N2
N2-DD1
DD1-DD1
2 log
2.6 log
30 kDa
27 kDa
22 kDa
30 kDa
27 kDa
22 kDa
Figure III-13 : Détection indirecte de la protéine prion du vMCJ résiduelle par Western blot. (a)
sans traitement des fils à la protéinase K, (b) après traitement des fils à la protéinase K
La radiographie du Western blot montre que la PrP n’est pas détectée lorsque les fils subissent :
- Un premier nettoyage par l’Aniosyme N2 pendant 10 min ;
- Un double nettoyage par l’Aniosyme N2.
Un signal de faible intensité est observé lors du double nettoyage par les Aniosyme N2 et DD1.
Cependant, nous ne le considérons pas comme significatif puisque les deux résultats précédents suggèrent
une efficacité de l’Aniosyme N2 dès le 1 er nettoyage.
En revanche, lorsque les fils subissent un double nettoyage par l’Aniosyme DD1, on observe une quantité
importante de PrP résiduelle. Compte tenu de l’intensité des signaux obtenus pour le contrôle de
l’adsorption et de la sensibilité de la méthode (évaluée à 4 log pour le vMCJ), on peut supposer que la
quantité de PrP résiduelle est comprise entre 1,4 et 2 log.
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