MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion
Nettoyage et/ou désinfection :
Une fois séchés, les fils sont collectés dans des tubes de 1,5 ml et incubés en présence de 1 ml de la
formulation à tester. Les tubes sont placés sur un agitateur rotatif assurant une bonne agitation mécanique
des fils dans la formulation. Les conséquences d’une agitation mécanique inappropriée seront illustrées
dans la discussion de la méthode.
Les procédés évalués sont présentés dans le tableau III-6. Les fils sont rincés pendant 3 minutes à l’issue
du traitement et entre chaque étape du procédé par de l’eau du réseau. Le désinfectant évalué dans les
procédés de nettoyage et de désinfection est l’Anioxy Twin Cu à 2,4% pendant 15 ou 30 minutes. La
sélection de l’Anioxy Tween Cu, par les Laboratoires ANIOS, comme le désinfectant de référence dans la
validation du procédé est en relation avec les évolutions possibles que pourraient subir ce produit
désinfectant dans le cadre des traitements des DM thermosensibles.
Tableau III-6 : Procédés de nettoyage et de désinfection évalués vis-à-vis de la protéine prion du
vMCJ en milieu lipidique.
1 er nettoyage 2 nd nettoyage Désinfection
Formulation Temps Formulation Temps Formulation Temps
Aniosyme N2 0,5% 10 min Aniosyme N2 0,5% 5 min
Anioxy Twin Cu 2,4% 15 min
Anioxy Twin Cu 2,4% 30 min
Aniosyme N2 0,5% 10 min Aniosyme DD1 0,5% 5 min
Anioxy Twin Cu 2,4% 15 min
Anioxy Twin Cu 2,4% 30 min
Aniosyme DD1 0,5% 10 min Aniosyme N2 0,5% 5 min
Anioxy Twin Cu 2,4% 15 min
Anioxy Twin Cu 2,4% 30 min
Aniosyme DD1 0,5% 10 min Aniosyme DD1 0,5% 5 min
Anioxy Twin Cu 2,4% 15 min
Anioxy Twin Cu 2,4% 30 min
Le contrôle de la détergence est effectué par une incubation de 40 fils dans 1 ml de l’eau du réseau
utilisée pour la dilution des formulations.
Les fils ne subissant aucun traitement sont conservés en boite de pétri à température ambiante. Ces fils
seront le contrôle positif de l’adsorption.
Après traitement, les fils sont à nouveau séchés une nuit en boite de pétri sous hotte à flux laminaire.
Traitement et analyse des effluents du nettoyage :
Les effluents du 1 er et 2 nd nettoyage sont collectés et analysés en Western blot afin de s’assurer de la
désorption de la protéine prion à partir des fils d’acier inoxydable. L’activité enzymatique des
formulations Aniosyme N2 et DD1 est inhibée par le chauffage des effluents 10 minutes à 100°C.
Elution des protéines résiduelles :
Afin d’éluer les protéines résiduelles, les fils sont incubés dans 50 µl d’une solution de dénaturation (4%
SDS, 192 mM glycine, 5% saccharose, 25 mM Tris-HCl, 2% β-mercaptoéthanol), traités 2 heures aux
ultrasons puis chauffés 10 minutes à 100°C. La solution de dénaturation est prélevée et 20 µl sont déposés
en Western blot pour la détection de la protéine prion.
Dans le cas des contrôles positifs de l’adsorption, les fils subissent une double désorption. En effet,
n’ayant pas subit de traitement, la quantité de salissure adsorbée est importante et il est nécessaire d’éluer
les protéines dans 2 x 50 µl de solution de dénaturation pour s’assurer d’une désorption maximale de la
PrP. Le facteur dilution (de 2) sera pris en compte dans la conversion des dilutions de l’éluât en nombre
de log de PrP éluée.
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