MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion<br />
Afin d’augmenter la sensibilité de notre méthode, nous avons utilisé des techniques de concentration de la<br />
PrP. Ces techniques de concentration sont couramment mises en œuvre dans le Laboratoire de Diagnostic<br />
des Maladies à Prion de l’Hôpital Neurologique de <strong>Lyon</strong>. Ces techniques consistent en :<br />
- Une concentration par précipitation sélective de la PrPsc par l’acide phosphotungstique,<br />
initialement décrite par Wadsworth [Wadsworth, et al. 2001] ;<br />
- Une concentration de la PrPsc par ultracentrifugation en présence de Sarkosyl [Bolton, et al.<br />
1984]. Cette dernière technique est également utilisée pour concentrer la PrPres à partir d’un<br />
homogénat de cerveau préalablement traité par la protéinase K.<br />
La protéine prion, ainsi concentrée, sera reprise dans un homogénat de cerveau à 10% permettant de tester<br />
les procédés sur de la PrPsc en milieu lipidique cérébral avec une sensibilité plus adaptée. Le protocole<br />
employé pour la préparation de cette salissure est schématisé sur la figure III-10.<br />
Homogénat 5% -<br />
PBS Sarkosyl 2%<br />
Homogénat 10% -<br />
Sarkosyl 10%<br />
Précipitation<br />
Acide<br />
Phosphotungstique<br />
Centrifugation<br />
Surnageant<br />
Culot de<br />
précipitation (Cp)<br />
repris par H10%<br />
= Cp-H10%<br />
Culot<br />
Surnageant de<br />
l’ultracentrifugation<br />
(Su)<br />
Précipitation<br />
Acide<br />
Phosphotungstique<br />
Surnageant<br />
Surnageant<br />
Ultracentrifugation<br />
CpSu repris par Cp-<br />
H10%<br />
= Cp-H10%-CpSu<br />
Cu repris par<br />
Cp-H10%-CpSu<br />
Adsorption sur fils<br />
d’acier inoxydable<br />
Figure III-10 : Schéma du protocole de concentration de la PrPsc pour la préparation de la<br />
salissure PrPsc en milieu lipidique cérébral. Le culot Cu repris par Cp-H10%-CpSu constitue la<br />
salissure PrPsc en milieu lipidique cérébral utilisée pour l’adsorption sur les fils d’acier inoxydable.<br />
Afin d’établir un parallèle avec la méthode de détection directe de la PrPres sur support, et d’étudier<br />
l’incidence de la nature de la salissure sur l’efficacité du nettoyage, des salissures constituées<br />
exclusivement de PrPsc ou de PrPres du vMCJ seront également préparées par ultracentrifugation. La<br />
préparation des différentes salissures employées dans cette étude est résumée dans le tableau III-4.<br />
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