MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

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Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion désorption de la PrP résiduelle est trop important, la sensibilité de la détection sera diminuée. Il est donc nécessaire de disposer de support d’adsorption caractérisé par un rapport surface/volume élevé. L’utilisation de courts segments de fils d’acier inoxydable de faible diamètre permet de répondre à ce critère [Lemmer, et al. 2004]. Ces fils d’acier inoxydable étant également employés pour les essais in vivo d’inoculation à l’animal, leur utilisation pour la validation des essais in vitro est d’autant plus pertinente. Les types de PrP des maladies humaines Dans le cadre des maladies humaines à prion, on ne parle pas de souches mais plutôt de types de PrP. Le typage de la PrP est établit suivant son profil électrophorétique après digestion à la protéinase K (figure I- 4). En raison du problème de santé publique provoqué par l’émergence du vMCJ, de sa distribution périphérique et de l’efficacité de sa transmission par le sang, les procédés doivent être évalués prioritairement vis-à-vis de la PrP du vMCJ. Dans cette forme de MCJ, la PrPres est de type 2. Elle est différenciée de la PrPres type 2 des formes sporadiques par sa bande biglycosylée majoritaire (figure I-4). La forme des maladies à prions la plus courante est la forme sporadique de la MCJ (tableau I-2 : Forme de Heidenhain). Ce phénotype de la MCJs est associé à la présence de PrPres de type 1 et à une homozygotie Met/Met au codon 129 (Parchi 1996). Ainsi, l’évaluation des procédés sera également réalisée à partir de PrP de type 1 provenant d’un patient homozygote Met/Met au codon 129. L’adsorption sur fils d’inox à partir d’un simple homogénat de cerveau à 10% pour les formes humaines, ne permet pas d’établir l’efficacité du procédé avec une sensibilité suffisamment importante. En effet, lorsque la PrP, adsorbée à partir de cette salissure, est éluée des fils d’acier inoxydable et que l’éluât est analysé en Western blot, la dernière dilution de l’éluât pour laquelle la PrP est observée est celle au 1/33 ème , correspondant à 1,5 log de PrP (figure III-9). 1 log 1.5 log 2 log Figure III-9 : Limite de détection en Western blot de la PrP humaine adsorbée sur fils d’acier inoxydable à partir d’un homogénat de cerveau 10%. Evaluer l’efficacité des procédés sur 1,5 log n’est pas pertinent compte tenu des sensibilités offertes par les essais in vivo sur l’animal. Il est vrai que travailler sur les formes humaines n’est pas toujours évident. Contrairement aux souches animales qui sont stabilisées et titrées, la quantité de PrPsc dans les formes humaines est variable et dépendante du patient. En effet, la quantité de PrPsc va varier en fonction du stade de la maladie auquel est survenu le décès. Plus le stade sera avancé, plus la quantité de PrPsc sera importante. Mais il faut également préciser que la répartition cérébrale de la PrPsc n’est pas homogène, la quantité de PrPsc dans un homogénat d’une zone cérébrale donnée n’est donc pas représentative de la quantité de PrPsc accumulée au cours du développement de la maladie. - 76 -
Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion Afin d’augmenter la sensibilité de notre méthode, nous avons utilisé des techniques de concentration de la PrP. Ces techniques de concentration sont couramment mises en œuvre dans le Laboratoire de Diagnostic des Maladies à Prion de l’Hôpital Neurologique de <strong>Lyon</strong>. Ces techniques consistent en : - Une concentration par précipitation sélective de la PrPsc par l’acide phosphotungstique, initialement décrite par Wadsworth [Wadsworth, et al. 2001] ; - Une concentration de la PrPsc par ultracentrifugation en présence de Sarkosyl [Bolton, et al. 1984]. Cette dernière technique est également utilisée pour concentrer la PrPres à partir d’un homogénat de cerveau préalablement traité par la protéinase K. La protéine prion, ainsi concentrée, sera reprise dans un homogénat de cerveau à 10% permettant de tester les procédés sur de la PrPsc en milieu lipidique cérébral avec une sensibilité plus adaptée. Le protocole employé pour la préparation de cette salissure est schématisé sur la figure III-10. Homogénat 5% - PBS Sarkosyl 2% Homogénat 10% - Sarkosyl 10% Précipitation Acide Phosphotungstique Centrifugation Surnageant Culot de précipitation (Cp) repris par H10% = Cp-H10% Culot Surnageant de l’ultracentrifugation (Su) Précipitation Acide Phosphotungstique Surnageant Surnageant Ultracentrifugation CpSu repris par Cp- H10% = Cp-H10%-CpSu Cu repris par Cp-H10%-CpSu Adsorption sur fils d’acier inoxydable Figure III-10 : Schéma du protocole de concentration de la PrPsc pour la préparation de la salissure PrPsc en milieu lipidique cérébral. Le culot Cu repris par Cp-H10%-CpSu constitue la salissure PrPsc en milieu lipidique cérébral utilisée pour l’adsorption sur les fils d’acier inoxydable. Afin d’établir un parallèle avec la méthode de détection directe de la PrPres sur support, et d’étudier l’incidence de la nature de la salissure sur l’efficacité du nettoyage, des salissures constituées exclusivement de PrPsc ou de PrPres du vMCJ seront également préparées par ultracentrifugation. La préparation des différentes salissures employées dans cette étude est résumée dans le tableau III-4. - 77 -
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N° d’ordre 2006-21 Année 2006 T
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SOMMAIRE INTRODUCTION GENERALE CHAP
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et quantitativement l’efficacité
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Chapitre I - Les ATNC, un Problème
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