MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion<br />
De par l’utilisation d’anticorps, nous pourrions également attribuer l’absence de signal à leur<br />
inaccessibilité au site antigénique. En effet, les molécules tensioactives modifient la conformation et/ou<br />
l’orientation des protéines au cours des étapes de nettoyage [Wahlgren et Arnebrant 1991]. Elles<br />
pourraient donc diminuer voire masquer les épitopes initialement accessibles.<br />
L’utilisation de la PrPres comme salissure pour la méthode de détection directe sur support présente à la<br />
fois des avantages et des inconvénients. Détecter spécifiquement la présence de PrPsc n’est possible que<br />
si la PrPc est préalablement digérée par la protéinase K puisque l’Ac anti-PrP employé est un Ac<br />
séquentiel. De ce fait, travailler avec de la PrPres assure la spécificité de la détection. Cependant, la PrPsc<br />
n’est que partiellement résistante à la dégradation enzymatique puisque sa partie N-terminale y est<br />
sensible. Les propriétés de la PrPres sont donc modifiées par rapport à la PrPsc et ces différences<br />
pourraient avoir des conséquences sur l’efficacité d’un procédé notamment lorsque celui-ci implique<br />
l’utilisation de molécules tensioactives et d’enzymes. En effet, la PrPres est obtenue suite à un traitement<br />
enzymatique à la protéinase K. La question de la sensibilité de cette PrPres à un second traitement<br />
enzymatique est donc posée et nous tenterons d’y apporter des éléments de réponses.<br />
La PrPres constitue une nouvelle fois une salissure de nature essentiellement protéique, modélisant<br />
probablement le pire des scénarios. Cependant, il est important de prendre en considération la présence<br />
des autres constituants de la matière organique. Ainsi, dans les étapes suivantes, les procédés mettant en<br />
œuvre le double nettoyage par les formulations Aniosyme N2 et DD1 sont évalués vis-à-vis de la PrPsc<br />
dans une salissure plus représentative et plus complexe.<br />
III.2. Détection indirecte de la PrP adsorbée sur fils d’acier inoxydable<br />
La finalité de notre projet est de démontrer in vitro l’efficacité d’un procédé vis-à-vis du risque prion.<br />
Dans un premier temps, les procédés seront évalués sur une salissure complexe contenant de la protéine<br />
prion du vMCJ. Dans un deuxième temps, et compte tenu de l’incidence que semble avoir la nature de<br />
salissure sur l’efficacité du nettoyage, certains procédés seront également évalués sur des salissures<br />
protéiques de PrPsc et de PrPres également issues du vMCJ. Enfin, pour s’assurer de l’absence de<br />
spécificité des procédés de nettoyage et de désinfection, ceux-ci seront évalués vis-à-vis de protéine prion<br />
issue de différentes souches animales et de la forme sporadique de la MCJ.<br />
Après avoir présenté le principe de la méthode de détection indirecte de la protéine prion adsorbée sur fils<br />
d’acier inoxydable, nous présenterons les types de PrP humaine et les salissures qui leur sont associés<br />
ainsi que les souches animales étudiées.<br />
III.2.1. Principe<br />
Afin d’évaluer les performances du double nettoyage et de la désinfection vis-à-vis de la PrPsc dans une<br />
salissure plus représentative, il est nécessaire de pouvoir dissocier l’isoforme cellulaire de l’isoforme<br />
pathologique de la protéine prion. Une détection spécifique directe n’est donc plus possible. Il est<br />
nécessaire d’avoir recours à une méthode indirecte de détection et donc de procéder à une élution des<br />
protéines résiduelles après nettoyage et/ou désinfection. La PrPsc résiduelle dans l’éluât peut alors être<br />
spécifiquement mise en évidence par Western blot. Parallèlement, un traitement préalable des substrats<br />
d’acier inoxydable par la protéinase K, avant élution, permettra de confirmer la présence de PrPsc<br />
résiduelle adsorbée.<br />
Les fils d’acier inoxydable<br />
Cette méthodologie nécessite de faire un compromis entre spécificité et sensibilité. En effet, comme il<br />
l’est expliqué précédemment, la spécificité de la détection n’est assurée qu’après élution de la PrP<br />
résiduelle du support sur lequel elle est adsorbée. Or, si le volume de la solution d’élution nécessaire à la<br />
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