MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Chapitre III – Efficacité du Nettoyage et/ou de la Désinfection vis-à-vis de la protéine prion
De par l’utilisation d’anticorps, nous pourrions également attribuer l’absence de signal à leur
inaccessibilité au site antigénique. En effet, les molécules tensioactives modifient la conformation et/ou
l’orientation des protéines au cours des étapes de nettoyage [Wahlgren et Arnebrant 1991]. Elles
pourraient donc diminuer voire masquer les épitopes initialement accessibles.
L’utilisation de la PrPres comme salissure pour la méthode de détection directe sur support présente à la
fois des avantages et des inconvénients. Détecter spécifiquement la présence de PrPsc n’est possible que
si la PrPc est préalablement digérée par la protéinase K puisque l’Ac anti-PrP employé est un Ac
séquentiel. De ce fait, travailler avec de la PrPres assure la spécificité de la détection. Cependant, la PrPsc
n’est que partiellement résistante à la dégradation enzymatique puisque sa partie N-terminale y est
sensible. Les propriétés de la PrPres sont donc modifiées par rapport à la PrPsc et ces différences
pourraient avoir des conséquences sur l’efficacité d’un procédé notamment lorsque celui-ci implique
l’utilisation de molécules tensioactives et d’enzymes. En effet, la PrPres est obtenue suite à un traitement
enzymatique à la protéinase K. La question de la sensibilité de cette PrPres à un second traitement
enzymatique est donc posée et nous tenterons d’y apporter des éléments de réponses.
La PrPres constitue une nouvelle fois une salissure de nature essentiellement protéique, modélisant
probablement le pire des scénarios. Cependant, il est important de prendre en considération la présence
des autres constituants de la matière organique. Ainsi, dans les étapes suivantes, les procédés mettant en
œuvre le double nettoyage par les formulations Aniosyme N2 et DD1 sont évalués vis-à-vis de la PrPsc
dans une salissure plus représentative et plus complexe.
III.2. Détection indirecte de la PrP adsorbée sur fils d’acier inoxydable
La finalité de notre projet est de démontrer in vitro l’efficacité d’un procédé vis-à-vis du risque prion.
Dans un premier temps, les procédés seront évalués sur une salissure complexe contenant de la protéine
prion du vMCJ. Dans un deuxième temps, et compte tenu de l’incidence que semble avoir la nature de
salissure sur l’efficacité du nettoyage, certains procédés seront également évalués sur des salissures
protéiques de PrPsc et de PrPres également issues du vMCJ. Enfin, pour s’assurer de l’absence de
spécificité des procédés de nettoyage et de désinfection, ceux-ci seront évalués vis-à-vis de protéine prion
issue de différentes souches animales et de la forme sporadique de la MCJ.
Après avoir présenté le principe de la méthode de détection indirecte de la protéine prion adsorbée sur fils
d’acier inoxydable, nous présenterons les types de PrP humaine et les salissures qui leur sont associés
ainsi que les souches animales étudiées.
III.2.1. Principe
Afin d’évaluer les performances du double nettoyage et de la désinfection vis-à-vis de la PrPsc dans une
salissure plus représentative, il est nécessaire de pouvoir dissocier l’isoforme cellulaire de l’isoforme
pathologique de la protéine prion. Une détection spécifique directe n’est donc plus possible. Il est
nécessaire d’avoir recours à une méthode indirecte de détection et donc de procéder à une élution des
protéines résiduelles après nettoyage et/ou désinfection. La PrPsc résiduelle dans l’éluât peut alors être
spécifiquement mise en évidence par Western blot. Parallèlement, un traitement préalable des substrats
d’acier inoxydable par la protéinase K, avant élution, permettra de confirmer la présence de PrPsc
résiduelle adsorbée.
Les fils d’acier inoxydable
Cette méthodologie nécessite de faire un compromis entre spécificité et sensibilité. En effet, comme il
l’est expliqué précédemment, la spécificité de la détection n’est assurée qu’après élution de la PrP
résiduelle du support sur lequel elle est adsorbée. Or, si le volume de la solution d’élution nécessaire à la
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