MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Chapitre II – Evaluation du Nettoyage<br />
masques laryngés ainsi que sur des lames de laryngoscopes après nettoyage et stérilisation [Miller, et al.<br />
2001].<br />
Les souillures microbiennes peuvent être bactériennes, virales et/ou fongiques. L’introduction de<br />
microorganismes, tels que Enterococcus faecium, Candida albicans, Staphylococcus aureus ou<br />
Pseudomonas aeruginosa, dans les souillures tests est courante et permet d’évaluer les méthodes de<br />
nettoyage et de désinfection [Alfa et Nemes 2004, Bloss et Kampf 2004, Mackcow et Pauly 1998,<br />
Merritt, et al. 2000, Peterson et Mackcow 1997, Vickery, et al. 2004]. Ces souillures microbiennes sont<br />
bien adaptées pour évaluer l’efficacité de la désinfection, mais il faut rester critique quand ces souillures<br />
servent à l’évaluation du nettoyage puisqu’une surface pourrait être plus facilement débarrassée des<br />
microorganismes que des composés organiques amorphes et notamment des protéines. Bien que le<br />
biofilm soit extrêmement adhérant [Pajkos, et al. 2004, Vickery, et al. 2004], son développement et sa<br />
résistance au nettoyage sont probablement plus liés à la géométrie du DM qu’à l’efficacité de la solution<br />
de nettoyage elle -même.<br />
La méthode d’évaluation du nettoyage doit également tenir compte du niveau de propreté attendu. Ce<br />
critère ne peut pas non plus être défini précisément. Dans le cas où le risque prion est omis, le seuil de<br />
propreté pourrait être défini par le niveau requis pour l’utilisation du dispositif à nettoyer. En revanche, en<br />
tenant compte du risque prion, le niveau de propreté requis devient plus abstrait, la dose minimale<br />
infectieuse n’étant pas établie. Dans ce contexte, il semble important d’augmenter la sensibilité des<br />
méthodes mises en œuvres pour évaluer le nettoyage, notamment vis-à-vis des protéines. Les techniques<br />
analytiques habituellement mises en œuvre ont recours aux méthodes de dosage des protéines. Parmi ces<br />
méthodes, on rencontre essentiellement des méthodes colorimétriques et fluorimétriques.<br />
Les méthodes colorimétriques disponibles pour le dosage des protéines sont nombreuses :<br />
- La réaction du Biuret est basée sur la formation d’un complexe pourpre entre le biuret (NH2-<br />
CO-NH-CO-NH2) et deux liaisons peptidiques consécutives en présence de cuivre et en milieu<br />
alcalin. Le complexe de coordination ainsi formé adsorbe fortement à 545 nm. Malgré sa<br />
spécificité, cette méthode est peu sensible.<br />
- La méthode de Bradford est basée sur l’adsorption du bleu de Coomassie sur les protéines en<br />
milieu acide. Le complexe formé adsorbe à 590 nm. Cette méthode est relativement sensible (2 à<br />
5 µg/ml) mais interfère avec les détergents. Elle montre également une réactivité différente visà-vis<br />
des diverses protéines.<br />
- La méthode de Lowry combine une réaction du biuret et une réaction au réactif de Folin-<br />
Ciocalteu. Ce dernier, à base d’acide phosphotungstomolybdique, réagit avec les résidus tyrosine<br />
et tryptophane, et à moindre mesure avec les résidus cystéine et hystidine pour donner une<br />
coloration bleue qui s’ajoute à celle du biuret. L’absorbance est lue à 750 nm. Sa sensibilité est<br />
de 5 à 10 µg/ml et est peu spécifique. Elle interfère également avec de nombreuses substances et<br />
notamment avec de nombreux détergents. Enfin, la loi de Beer Lambert n’étant pas parfaitement<br />
vérifiée, la zone de linéarité de la réaction est étroite. Toutefois, des améliorations ont été<br />
apportées, notamment avec le kit DC Biorad, permettant son utilisation dans le cadre de<br />
l’évaluation du nettoyage [Chartier, et al. 2001].<br />
- La méthode au BCA (BiCinchoninique Acid) utilise le pouvoir réducteur des protéines en milieu<br />
alcalin pour réduire les ions cuivriques en ions cuivreux qui vont alors réagir avec l’acide<br />
bicinchoninique pour former un complexe coloré pourpre d’intensité proportionnelle à la<br />
concentration de protéines. L’adsorbance est lue à 562 nm. C’est une méthode extrêmement<br />
intéressante car elle est compatible avec la plupart des tensioactifs ioniques et non ioniques. Elle<br />
permet un dosage des protéines totales dans une gamme de valeurs comprises entre 0,5 et 20<br />
µg/ml.<br />
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