MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Chapitre II – Evaluation du Nettoyage
masques laryngés ainsi que sur des lames de laryngoscopes après nettoyage et stérilisation [Miller, et al.
2001].
Les souillures microbiennes peuvent être bactériennes, virales et/ou fongiques. L’introduction de
microorganismes, tels que Enterococcus faecium, Candida albicans, Staphylococcus aureus ou
Pseudomonas aeruginosa, dans les souillures tests est courante et permet d’évaluer les méthodes de
nettoyage et de désinfection [Alfa et Nemes 2004, Bloss et Kampf 2004, Mackcow et Pauly 1998,
Merritt, et al. 2000, Peterson et Mackcow 1997, Vickery, et al. 2004]. Ces souillures microbiennes sont
bien adaptées pour évaluer l’efficacité de la désinfection, mais il faut rester critique quand ces souillures
servent à l’évaluation du nettoyage puisqu’une surface pourrait être plus facilement débarrassée des
microorganismes que des composés organiques amorphes et notamment des protéines. Bien que le
biofilm soit extrêmement adhérant [Pajkos, et al. 2004, Vickery, et al. 2004], son développement et sa
résistance au nettoyage sont probablement plus liés à la géométrie du DM qu’à l’efficacité de la solution
de nettoyage elle -même.
La méthode d’évaluation du nettoyage doit également tenir compte du niveau de propreté attendu. Ce
critère ne peut pas non plus être défini précisément. Dans le cas où le risque prion est omis, le seuil de
propreté pourrait être défini par le niveau requis pour l’utilisation du dispositif à nettoyer. En revanche, en
tenant compte du risque prion, le niveau de propreté requis devient plus abstrait, la dose minimale
infectieuse n’étant pas établie. Dans ce contexte, il semble important d’augmenter la sensibilité des
méthodes mises en œuvres pour évaluer le nettoyage, notamment vis-à-vis des protéines. Les techniques
analytiques habituellement mises en œuvre ont recours aux méthodes de dosage des protéines. Parmi ces
méthodes, on rencontre essentiellement des méthodes colorimétriques et fluorimétriques.
Les méthodes colorimétriques disponibles pour le dosage des protéines sont nombreuses :
- La réaction du Biuret est basée sur la formation d’un complexe pourpre entre le biuret (NH2-
CO-NH-CO-NH2) et deux liaisons peptidiques consécutives en présence de cuivre et en milieu
alcalin. Le complexe de coordination ainsi formé adsorbe fortement à 545 nm. Malgré sa
spécificité, cette méthode est peu sensible.
- La méthode de Bradford est basée sur l’adsorption du bleu de Coomassie sur les protéines en
milieu acide. Le complexe formé adsorbe à 590 nm. Cette méthode est relativement sensible (2 à
5 µg/ml) mais interfère avec les détergents. Elle montre également une réactivité différente visà-vis
des diverses protéines.
- La méthode de Lowry combine une réaction du biuret et une réaction au réactif de Folin-
Ciocalteu. Ce dernier, à base d’acide phosphotungstomolybdique, réagit avec les résidus tyrosine
et tryptophane, et à moindre mesure avec les résidus cystéine et hystidine pour donner une
coloration bleue qui s’ajoute à celle du biuret. L’absorbance est lue à 750 nm. Sa sensibilité est
de 5 à 10 µg/ml et est peu spécifique. Elle interfère également avec de nombreuses substances et
notamment avec de nombreux détergents. Enfin, la loi de Beer Lambert n’étant pas parfaitement
vérifiée, la zone de linéarité de la réaction est étroite. Toutefois, des améliorations ont été
apportées, notamment avec le kit DC Biorad, permettant son utilisation dans le cadre de
l’évaluation du nettoyage [Chartier, et al. 2001].
- La méthode au BCA (BiCinchoninique Acid) utilise le pouvoir réducteur des protéines en milieu
alcalin pour réduire les ions cuivriques en ions cuivreux qui vont alors réagir avec l’acide
bicinchoninique pour former un complexe coloré pourpre d’intensité proportionnelle à la
concentration de protéines. L’adsorbance est lue à 562 nm. C’est une méthode extrêmement
intéressante car elle est compatible avec la plupart des tensioactifs ioniques et non ioniques. Elle
permet un dosage des protéines totales dans une gamme de valeurs comprises entre 0,5 et 20
µg/ml.
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