MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

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Annexe 4 – Les Biais Méthodologiques sur la figure A3-4(a) et sont comparés aux essais contrôles précipités par l’acide trichloracétique et présentés sur la figure A3-4(b). W N2 A - avec SQ PK - + - + - + (a) (b) N2 TCA A - PK - - - - Figure A4-4 : Comparaison des techniques de précipitation des protéines associées à l’inhibition des enzymes par l’acidité du pH. (a) Précipitation par l’Acide phosphotungstique (W), (b) Précipitation par l’acide trichloracétique (TCA). La comparaison des résultats obtenus pour la formulation Aniosyme N2 par la précipitation à l’acide phosphotungstique (figure A3-4(a-N2) et par l’acide trichloracétique (figure A3-4 (b-N2) suggèrent que la fonction de précipitation de l’acide trichloracétique est responsable des faux résultats positifs obtenus. Dans les deux cas, l’activité enzymatique est inhibée par l’acidité du pH. Les résultats obtenus pour la formulation « A - avec SQ» par ces deux techniques de précipitation ne sont pas de différents. Ceux-ci suggèrent que l’inhibition enzymatique par l’acidité du pH, en présence de tensioactif anionique, n’introduit pas de biais dans la méthodologie et ce quelle que soit la technique de précipitation mise en œuvre. Les résultats présentés ont mis en évidence les problèmes méthodologiques rencontrés. Il est extrêmement compliqué de s’intéresser à la triade prion-enzymes-tensioactifs. Etudier l’activité enzymatique vis-à-vis de la protéine prion en présence de tensioactifs constitue un véritable challenge. En effet, en présence du tensioactif anionique (le lauryléthersulfate), l’inhibition de l’activité enzymatique par la chaleur introduit des risques de faux résultats positifs quelle soit la technique de précipitation ou de concentration utilisée. En présence des tensioactifs de l’Aniosyme N2, c’est la technique de précipitation par l’acide trichloracétique qui génère de tels risques et ce indépendamment du mode d’inhibition de l’activité enzymatique. Au regard de ces données, l’inhibition de l’activité enzymatique par l’acidité du pH associée à la technique de précipitation par l’acide phosphotungstique offre donc les meilleurs compromis méthodologique. - 202 -
Annexe 5 – Calculs des épaisseurs équivalentes ANNEXE 5 CALCULS DES EPAISSEURS EQUIVALENTES III. EPAISSEUR DE LA COUCHE DE BSA : INTERFACE PROTEINE/METAL hν BSA θ e - d ↔ Si l’on admet que la couche de BSA déposée est homogène, nous pouvons évaluer son épaisseur. En effet, la variation d’intensité des pics du substrat est due à l’atténuation du signal par la couche de protéine déposée et son épaisseur peut être estimée par la relation suivante : Substrat I S = I S ∞ × e ⎛ −d ⎞ ⎜ ⎟ ⎝ λsin θ ⎠ Avec : I S∞ et I S : l’intensité des pics du substrat avant et après évaporation de la BSA ; d : l’épaisseur de la couche (en nm) λ : le libre parcours moyen de l’électron du substrat émis à travers la couche de protéine (en nm) ; θ : angle de détection des photoélectrons. Pour θ = 90° : I d = −λ ln I Le libre parcours moyen λ, généralement considéré comme étant égale à la racine carré de l’énergie cinétique (Ec) du photoélectrons émis, peut être calculé plus précisément selon la formule de Seah [Seah et Dench 1979] appliquée aux polymères organiques : S S ∞ λ 49 Ec d = + 2 0,11 Ec λ d = −3 10 ρλn Avec : λ d : le libre parcours moyen exprimé en mg/m² ; Ec : l’énergie cinétique des photoélectrons émis ; λ n : le libre parcours moyen exprimé en nm ρ : la densité volumique exprimée en kg/m 3 . - 203 -
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N° d’ordre 2006-21 Année 2006 T
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