MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Annexe 4 – Les Biais Méthodologiques<br />
II. INCIDENCE DU MODE D’INHIBITION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE<br />
Le second facteur qu’il convient de vérifier avant de conclure à une réelle incidence du tensioactif<br />
anionique sur l’inactivation de la protéine prion est le mode d’inhibition de l’activité enzymatique.<br />
Jusqu’à présent, les enzymes étaient inhibées par la chaleur. L’activité enzymatique étant particulièrement<br />
sensible au pH, nous aurons recours aux pH acides. La précipitation des protéines à l’acide<br />
trichloracétique est particulièrement intéressante dans ce contexte. En effet, la solution de trichloracétique<br />
est une solution acide de pH 2 qui va donc simultanément inhiber l’activité enzymatique et précipiter les<br />
protéines. Cette technique de précipitation est donc à nouveau mise en œuvre sur la formulation de<br />
référence Aniosyme N2 et sur la formulation « A - avec SQ», sans que celles-ci soient préalablement<br />
chauffées. L’essai contrôle consiste à précipiter les protéines à partir de l’eau du réseau (H 2 Or). Les<br />
résultats obtenus sont présentés sur la figure A3-3.<br />
H 2 Or<br />
1/1<br />
1/10<br />
1/100<br />
TCA<br />
A - avec SQ<br />
N2<br />
Figure A4-3: Précipitation des protéines par l’acide trichloracétique (TCA) à partir de la<br />
formulation Aniosyme N2 (N2) et de la formulation « A - avec SQ».<br />
NB : Après la précipitation au TCA, le traitement à la protéinase K ne peut être réalisé en raison de<br />
l’acidité du pH.<br />
Lorsque la protéine prion est précipitée par l’acide trichloracétique à partir de la formulation « A - avec<br />
SQ», celle-ci est clairement mise en évidence, contrairement aux résultats obtenus jusqu’à présent. En<br />
effet, bien qu’il s’agisse essentiellement de PrPres, l’intensité du signal détectée pour la formulation « A -<br />
avec SQ», n’est pas significativement différente de celle observée pour l’eau du réseau avant dilution<br />
(1/1). En revanche, dans le cas de la formulation Aniosyme N2 (N2), l’intensité du signal est nettement<br />
diminuée. Cette diminution du signal est pratiquement de 2 log comparativement à la gamme de dilution<br />
réalisée sur l’eau du réseau.<br />
Associés aux données précédemment obtenues par la précipitation au TCA après chauffage des<br />
formulations, ces résultats montrent que l’inhibition des enzymes par la chaleur introduit un risque de<br />
faux résultats positifs concernant l’inactivation de la protéine prion en présence du tensioactif anionique<br />
(le lauryléthersulfate). Dans ce contexte, l’acidité du pH semble plus appropriée pour l’inhibition<br />
enzymatique. Cependant, si la précipitation au TCA est particulièrement adaptée dans le cas de la<br />
formulation anionique, il n’en est pas ainsi vis-à-vis de la formulation Aniosyme N2.<br />
Compte tenu que la précipitation au TCA permet à la fois d’inhiber l’activité enzymatique et de précipiter<br />
les protéines, il convient de déterminer laquelle de ces deux fonctions est source de faux résultats positifs<br />
vis-à-vis de l’Aniosyme N2. Pour répondre à cette question, nous avons donc conservé le mode<br />
d’inhibition par l’acidité du pH et modifié la technique de précipitation des protéines. Nous avons donc<br />
eu recours à la précipitation des protéines par l’acide phosphotungstique, les enzymes ayant<br />
préalablement été inhibées par l’addition d’acide chlorhydrique 1M, jusqu’à l’obtention d’un pH 3. Les<br />
résultats obtenus par cette méthode pour les formulations Aniosyme N2 et « A - avec SQ» sont présentés<br />
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