MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Annexe 4 – Les Biais Méthodologiques
II. INCIDENCE DU MODE D’INHIBITION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE
Le second facteur qu’il convient de vérifier avant de conclure à une réelle incidence du tensioactif
anionique sur l’inactivation de la protéine prion est le mode d’inhibition de l’activité enzymatique.
Jusqu’à présent, les enzymes étaient inhibées par la chaleur. L’activité enzymatique étant particulièrement
sensible au pH, nous aurons recours aux pH acides. La précipitation des protéines à l’acide
trichloracétique est particulièrement intéressante dans ce contexte. En effet, la solution de trichloracétique
est une solution acide de pH 2 qui va donc simultanément inhiber l’activité enzymatique et précipiter les
protéines. Cette technique de précipitation est donc à nouveau mise en œuvre sur la formulation de
référence Aniosyme N2 et sur la formulation « A - avec SQ», sans que celles-ci soient préalablement
chauffées. L’essai contrôle consiste à précipiter les protéines à partir de l’eau du réseau (H 2 Or). Les
résultats obtenus sont présentés sur la figure A3-3.
H 2 Or
1/1
1/10
1/100
TCA
A - avec SQ
N2
Figure A4-3: Précipitation des protéines par l’acide trichloracétique (TCA) à partir de la
formulation Aniosyme N2 (N2) et de la formulation « A - avec SQ».
NB : Après la précipitation au TCA, le traitement à la protéinase K ne peut être réalisé en raison de
l’acidité du pH.
Lorsque la protéine prion est précipitée par l’acide trichloracétique à partir de la formulation « A - avec
SQ», celle-ci est clairement mise en évidence, contrairement aux résultats obtenus jusqu’à présent. En
effet, bien qu’il s’agisse essentiellement de PrPres, l’intensité du signal détectée pour la formulation « A -
avec SQ», n’est pas significativement différente de celle observée pour l’eau du réseau avant dilution
(1/1). En revanche, dans le cas de la formulation Aniosyme N2 (N2), l’intensité du signal est nettement
diminuée. Cette diminution du signal est pratiquement de 2 log comparativement à la gamme de dilution
réalisée sur l’eau du réseau.
Associés aux données précédemment obtenues par la précipitation au TCA après chauffage des
formulations, ces résultats montrent que l’inhibition des enzymes par la chaleur introduit un risque de
faux résultats positifs concernant l’inactivation de la protéine prion en présence du tensioactif anionique
(le lauryléthersulfate). Dans ce contexte, l’acidité du pH semble plus appropriée pour l’inhibition
enzymatique. Cependant, si la précipitation au TCA est particulièrement adaptée dans le cas de la
formulation anionique, il n’en est pas ainsi vis-à-vis de la formulation Aniosyme N2.
Compte tenu que la précipitation au TCA permet à la fois d’inhiber l’activité enzymatique et de précipiter
les protéines, il convient de déterminer laquelle de ces deux fonctions est source de faux résultats positifs
vis-à-vis de l’Aniosyme N2. Pour répondre à cette question, nous avons donc conservé le mode
d’inhibition par l’acidité du pH et modifié la technique de précipitation des protéines. Nous avons donc
eu recours à la précipitation des protéines par l’acide phosphotungstique, les enzymes ayant
préalablement été inhibées par l’addition d’acide chlorhydrique 1M, jusqu’à l’obtention d’un pH 3. Les
résultats obtenus par cette méthode pour les formulations Aniosyme N2 et « A - avec SQ» sont présentés
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