MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Annexe 4 – Les Biais Méthodologiques
Comment expliquer de tels résultats Etant donné la tendance des tensioactifs anioniques à dénaturer les
protéines avec lesquelles ils interagissent, il semble peu évident que ce tensioactif puisse optimiser
l’activité de la protéase au point qu’elle puisse dégrader la quasi-totalité de la PrPsc en 15 minutes. Il est
donc nécessaire de s’assurer que ces résultats ne sont pas la conséquence d’artéfacts méthodologiques.
I. INCIDENCE DES TECHNIQUES DE PRECIPITATION OU DE
CONCENTRATION DE LA PROTEINE PRION
Nous avons souhaité vérifier la fiabilité de la technique de précipitation de la protéine prion par l’acide
phosphotungstique. En effet, il n’est pas exclu que cette technique puisse être incompatible avec la
présence du tensioactif anionique. Ainsi, après inhibition de l’activité enzymatique par la chaleur, nous
avons mis en œuvre deux nouvelles techniques permettant de précipiter ou de concentrer les protéines. Il
s’agit de la technique de précipitation des protéines totales par l’acide trichloracétique (TCA) et de la
technique de concentration de la protéine prion par ultracentrifugation (Ultra). En parallèle, la technique
de précipitation par l’acide phosphotungstique (W) est réalisée sur la formulation de référence et pour la
formulation « A - avec SQ». Ces deux essais contrôles permettent :
- de comparer les techniques de précipitation et de concentration de la PrP vis-à-vis de la
formulation « A - » ;
- de confirmer l’efficacité de cette formulation comparativement à l’Aniosyme N2.
Les résultats sont présentés sur la figure A3-2.
N2
A - avec SQ
W
W
TCA
Ultra
PK - + - + - - - +
Figure A4-2 : Comparaison des techniques de précipitation et de concentration de la PrP à partir
de la formulation anionique en présence de séquestrant « A - avec SQ». W : précipitation par
l’acide phosphotungstique ; TCA : précipitation par l’acide trichloracétique ; Ultra : technique de
concentration par ultracentrifugation ; PK : protéinase K. La formulation de référence est
l’Aniosyme N2 (N2).
NB : Après la précipitation au TCA, le traitement à la protéinase K ne peut être réalisé en raison de
l’acidité du pH.
Les résultats obtenus par la précipitation à l’acide phosphotungstique (W) sur la formulation de référence
et sur la formulation « A - avec SQ» confirment les précédents résultats. La présence du tensioactif
anionique modifie considérablement l’efficacité de la formulation sur l’inactivation de la protéine prion.
Si l’on compare à présent, les trois techniques de précipitation et concentration mises en œuvre, la
précipitation au TCA et l’ultracentrifugation (Ultra) permettent de confirmer les résultats obtenus par la
technique de précipitation à l’acide phosphotungstique. Ces résultats vont donc à l’encontre d’une
incompatibilité entre la technique de précipitation à l’acide phosphotungstique et le tensioactif anionique.
- 200 -