MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Annexe 4 – Les Biais Méthodologiques<br />
Comment expliquer de tels résultats Etant donné la tendance des tensioactifs anioniques à dénaturer les<br />
protéines avec lesquelles ils interagissent, il semble peu évident que ce tensioactif puisse optimiser<br />
l’activité de la protéase au point qu’elle puisse dégrader la quasi-totalité de la PrPsc en 15 minutes. Il est<br />
donc nécessaire de s’assurer que ces résultats ne sont pas la conséquence d’artéfacts méthodologiques.<br />
I. INCIDENCE DES TECHNIQUES DE PRECIPITATION OU DE<br />
CONCENTRATION DE LA PROTEINE PRION<br />
Nous avons souhaité vérifier la fiabilité de la technique de précipitation de la protéine prion par l’acide<br />
phosphotungstique. En effet, il n’est pas exclu que cette technique puisse être incompatible avec la<br />
présence du tensioactif anionique. Ainsi, après inhibition de l’activité enzymatique par la chaleur, nous<br />
avons mis en œuvre deux nouvelles techniques permettant de précipiter ou de concentrer les protéines. Il<br />
s’agit de la technique de précipitation des protéines totales par l’acide trichloracétique (TCA) et de la<br />
technique de concentration de la protéine prion par ultracentrifugation (Ultra). En parallèle, la technique<br />
de précipitation par l’acide phosphotungstique (W) est réalisée sur la formulation de référence et pour la<br />
formulation « A - avec SQ». Ces deux essais contrôles permettent :<br />
- de comparer les techniques de précipitation et de concentration de la PrP vis-à-vis de la<br />
formulation « A - » ;<br />
- de confirmer l’efficacité de cette formulation comparativement à l’Aniosyme N2.<br />
Les résultats sont présentés sur la figure A3-2.<br />
N2<br />
A - avec SQ<br />
W<br />
W<br />
TCA<br />
Ultra<br />
PK - + - + - - - +<br />
Figure A4-2 : Comparaison des techniques de précipitation et de concentration de la PrP à partir<br />
de la formulation anionique en présence de séquestrant « A - avec SQ». W : précipitation par<br />
l’acide phosphotungstique ; TCA : précipitation par l’acide trichloracétique ; Ultra : technique de<br />
concentration par ultracentrifugation ; PK : protéinase K. La formulation de référence est<br />
l’Aniosyme N2 (N2).<br />
NB : Après la précipitation au TCA, le traitement à la protéinase K ne peut être réalisé en raison de<br />
l’acidité du pH.<br />
Les résultats obtenus par la précipitation à l’acide phosphotungstique (W) sur la formulation de référence<br />
et sur la formulation « A - avec SQ» confirment les précédents résultats. La présence du tensioactif<br />
anionique modifie considérablement l’efficacité de la formulation sur l’inactivation de la protéine prion.<br />
Si l’on compare à présent, les trois techniques de précipitation et concentration mises en œuvre, la<br />
précipitation au TCA et l’ultracentrifugation (Ultra) permettent de confirmer les résultats obtenus par la<br />
technique de précipitation à l’acide phosphotungstique. Ces résultats vont donc à l’encontre d’une<br />
incompatibilité entre la technique de précipitation à l’acide phosphotungstique et le tensioactif anionique.<br />
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