MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

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Annexe 3 – Le Western blot Les conditions de migration sont les suivantes : Tableau A3-11 : Conditions de migration électrophorétique. Etape Voltage Intensité Puissane Durée Concentration 90 V 100 mA 30 W 0h10 Migration 200 V 100 mA 30 W 1h30 IV.4. Transfert sur membrane de PVDF Les membranes de PVDF hydrophobes sont hydratées successivement par de l’éthanol 95° et de l’eau ultra pure jusqu’à ce qu’elles deviennent parfaitement hydrophiles. Elles sont conservées dans le tampon de transfert (Tris Glycine à 20% de méthanol). Sont également immergés dans ce tampon, les papiers filtres servant d’intercalaires entre les électrodes, le gel et la membrane, comme illustré sur la figure A2- 2. Figure A3-357 : Schéma du montage pour le transfert des protéines du gel vers la membrane de PVDF. Les conditions de transfert sont les suivantes : 20 V 300 mA 30 min - 196 -
Annexe 3 – Le Western blot IV.5. Immunodétection Les différentes étapes décrites dans le paragraphe III.2 sont illustrées pour l’immunodétection par l’Ac 3F4. Blocage PBS lait écremé 5% 1h Anticorps Primaire Ac 3F4 1/10 000 e en PBS Tween 0,1% 1h Rinçage PBS Tween 0,1% Anticorps Secondaire Ac Anti-IgG de souris-HRP 1/20 000 e en PBS Tween 0,1% 30 min Rinçage PBS Tween 0,1% PBS Chimiluminescence SuperSignal (Pierce) ECL Plus (Amersham) Temps d’exposition fonction de l’intensité du signal (de 30 sec à une heure) Développement Film photo Kodak Révélateur / Rinçage / Fixateur 45 sec / 30 sec / 45 sec - 197 -
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N° d’ordre 2006-21 Année 2006 T
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SOMMAIRE INTRODUCTION GENERALE CHAP
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