MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Annexe 3 – Le Western blot
Tableau A3-10 : Préparation des gels pour l’électrophorèse en condition dénaturante.
Réactifs Gel de Séparation 16% Gel de concentration 4%
Solution d’Acryl/Bisacryl 6 ml 0,5 ml
1,5 M Tris/HCl pH 8,8 3,75 ml /
0,5 M Tris/HCl pH 6,8 / 1,25 ml
H 2 O∆ 5 ml 3,15 ml
SDS 10% 150 µl 50 µl
Persulfate d’ammonium 10% 100 µl 25 µl
TEMED 10 µl 5 µl
Volume final 15 ml 5 ml
Le gel de séparation à 16% est coulé en entre deux plaques sur une hauteur de 6 cm. Il est ensuite
recouvert d’alcool iso-butylique pour niveler la surface et empêcher le contact avec l’O 2 qui inhibe la
polymérisation. Après polymérisation (20 à 30 minutes), l’alcool isobutylique est éliminé et la surface du
gel est rincée à l’eau distillée. Le gel de concentration à 4% est coulé et un peigne est immédiatement
introduit pour la formation des puits de dépôts. La polymérisation du gel est obtenue en 15 minutes. Le
peigne est enlevé et les puits sont rinçés avec le tampon de migration Tris Glycine SDS (Biorad).
IV.2. Préparations des échantillons
Les échantillons à séparer doivent être préparé dans une solution de dénaturation :
SDS 4% ................................................. 2g
Glycine 192 mM .............................. 0,72g
Saccharose 5% ................................... 2,5g
Tris-HCl 25 Mm................................ 0,2 g
H 2 O UP ............................................30 ml
BBP ............................................ qq grains
Mercaptoéthanol 2% ...........................1ml
H 2 O UPqsp.......................................30 ml
IV.3. Migration
Un volume prédéfini des échantillons à analyser est déposé dans chaque puit du gel. Les échantillons sont
alors soumis à l’influence d’un champ électrique.
Figure A3-2 : Dépôt des échantillons pour l’électrophorèse.
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