MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Annexe 3 – Le Western blot<br />
Tableau A3-10 : Préparation des gels pour l’électrophorèse en condition dénaturante.<br />
Réactifs Gel de Séparation 16% Gel de concentration 4%<br />
Solution d’Acryl/Bisacryl 6 ml 0,5 ml<br />
1,5 M Tris/HCl pH 8,8 3,75 ml /<br />
0,5 M Tris/HCl pH 6,8 / 1,25 ml<br />
H 2 O∆ 5 ml 3,15 ml<br />
SDS 10% 150 µl 50 µl<br />
Persulfate d’ammonium 10% 100 µl 25 µl<br />
TEMED 10 µl 5 µl<br />
Volume final 15 ml 5 ml<br />
Le gel de séparation à 16% est coulé en entre deux plaques sur une hauteur de 6 cm. Il est ensuite<br />
recouvert d’alcool iso-butylique pour niveler la surface et empêcher le contact avec l’O 2 qui inhibe la<br />
polymérisation. Après polymérisation (20 à 30 minutes), l’alcool isobutylique est éliminé et la surface du<br />
gel est rincée à l’eau distillée. Le gel de concentration à 4% est coulé et un peigne est immédiatement<br />
introduit pour la formation des puits de dépôts. La polymérisation du gel est obtenue en 15 minutes. Le<br />
peigne est enlevé et les puits sont rinçés avec le tampon de migration Tris Glycine SDS (Biorad).<br />
IV.2. Préparations des échantillons<br />
Les échantillons à séparer doivent être préparé dans une solution de dénaturation :<br />
SDS 4% ................................................. 2g<br />
Glycine 192 mM .............................. 0,72g<br />
Saccharose 5% ................................... 2,5g<br />
Tris-HCl 25 Mm................................ 0,2 g<br />
H 2 O UP ............................................30 ml<br />
BBP ............................................ qq grains<br />
Mercaptoéthanol 2% ...........................1ml<br />
H 2 O UPqsp.......................................30 ml<br />
IV.3. Migration<br />
Un volume prédéfini des échantillons à analyser est déposé dans chaque puit du gel. Les échantillons sont<br />
alors soumis à l’influence d’un champ électrique.<br />
Figure A3-2 : Dépôt des échantillons pour l’électrophorèse.<br />
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