MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Annexe 3 – Le Western blot<br />
Le principe du transfert est le même que l’électrophorèse de zone. Les protéines dénaturées par le SDS<br />
sont chargées négativement et donc, sous l’influence d’un champ électrique, elles vont migrer de l’anode<br />
vers la cathode. Notons que pour le transfert, les électrodes sont de part et d’autre du gel et non pas dans<br />
le plan du gel comme pour l’électrophorèse.<br />
Le tampon utilisé pour le transfert contient du méthanol. Celui-ci va permettre d’éliminer le SDS des<br />
protéines et favoriser la liaison des protéines à la membrane.<br />
III. L’IMMUNOMARQUAGE<br />
Avant de procéder à l’immunomarquage, tous les sites de fixation potentiels non utilisés de la membrane<br />
doivent être bloqués.<br />
III.1. Blocage ou saturation<br />
Cette opération est importante car elle assure la spécificité de la technique. Sans blocage, les anticorps<br />
appliqués lors de l’étape suivante s’adsorberaient de façon non spécifique sur la membrane. La saturation<br />
est effectuée en trempant la membrane dans une solution d’agent bloquant souvent constituée de protéines<br />
inertes telles que la sérum albumine bovine, la gélatine ou la caséine. Des solutions de lait écremé<br />
peuvent également être utilisées.<br />
III.2. Immunomarquage<br />
Le principe est simple. Il nécessite l’utilisation d’un anticorps spécifique dirigé contre la protéine à<br />
détecter (l’antigène). La membrane est donc incubée en présence d’une solution de cet anticorps, qui va<br />
reconnaître et se fixer spécifiquement sur la protéine. L’excès d’anticorps non fixé est ensuite éliminé et<br />
la membrane est soigneusement rincée. Cet anticorps pourrait être couplé à un marqueur pour être<br />
directement détecté. Il s’agirait d’une méthode directe d’immunorévélation. Cependant, les techniques<br />
d’immunomarquages ont souvent recours à la méthode indirecte, nécessitant un second anticorps appelé<br />
anticorps secondaire. Celui-ci est généralement sélectionné en fonction de sa capacité à reconnaître une<br />
classe spécifique d’immunoglobuline (souvent les IgG) de l’espèce animale dont est issu le premier<br />
anticorps. Par exemple, si l’anticorps primaire est une IgG de souris, l’anticorps secondaire pourrait être<br />
une IgG de cheval anti-IgG de souris.<br />
Afin de pouvoir visualiser la formation des complexes antigène-anticorps, l’anticorps secondaire est<br />
couplé de manière covalente à une enzyme, telle que la péroxydase et c’est l’activité de l’enzyme, en<br />
présence de son substrat, qui sera détectée.<br />
IV. MODE OPERATOIRE<br />
IV.1. Préparation des gels<br />
Le gel de polyacrylamide est formé par la polymérisation du monomère d’acrylamide et de son comonomère<br />
le bisacrylamide. Il est constitué d’un gel de concentration à 4% et d’un gel de séparation à<br />
16%. Le tableau A2-1 présente la composition pour deux gels de 1,5 mm d’épaisseur.<br />
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