MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Annexe 3 – Le Western blot
Le principe du transfert est le même que l’électrophorèse de zone. Les protéines dénaturées par le SDS
sont chargées négativement et donc, sous l’influence d’un champ électrique, elles vont migrer de l’anode
vers la cathode. Notons que pour le transfert, les électrodes sont de part et d’autre du gel et non pas dans
le plan du gel comme pour l’électrophorèse.
Le tampon utilisé pour le transfert contient du méthanol. Celui-ci va permettre d’éliminer le SDS des
protéines et favoriser la liaison des protéines à la membrane.
III. L’IMMUNOMARQUAGE
Avant de procéder à l’immunomarquage, tous les sites de fixation potentiels non utilisés de la membrane
doivent être bloqués.
III.1. Blocage ou saturation
Cette opération est importante car elle assure la spécificité de la technique. Sans blocage, les anticorps
appliqués lors de l’étape suivante s’adsorberaient de façon non spécifique sur la membrane. La saturation
est effectuée en trempant la membrane dans une solution d’agent bloquant souvent constituée de protéines
inertes telles que la sérum albumine bovine, la gélatine ou la caséine. Des solutions de lait écremé
peuvent également être utilisées.
III.2. Immunomarquage
Le principe est simple. Il nécessite l’utilisation d’un anticorps spécifique dirigé contre la protéine à
détecter (l’antigène). La membrane est donc incubée en présence d’une solution de cet anticorps, qui va
reconnaître et se fixer spécifiquement sur la protéine. L’excès d’anticorps non fixé est ensuite éliminé et
la membrane est soigneusement rincée. Cet anticorps pourrait être couplé à un marqueur pour être
directement détecté. Il s’agirait d’une méthode directe d’immunorévélation. Cependant, les techniques
d’immunomarquages ont souvent recours à la méthode indirecte, nécessitant un second anticorps appelé
anticorps secondaire. Celui-ci est généralement sélectionné en fonction de sa capacité à reconnaître une
classe spécifique d’immunoglobuline (souvent les IgG) de l’espèce animale dont est issu le premier
anticorps. Par exemple, si l’anticorps primaire est une IgG de souris, l’anticorps secondaire pourrait être
une IgG de cheval anti-IgG de souris.
Afin de pouvoir visualiser la formation des complexes antigène-anticorps, l’anticorps secondaire est
couplé de manière covalente à une enzyme, telle que la péroxydase et c’est l’activité de l’enzyme, en
présence de son substrat, qui sera détectée.
IV. MODE OPERATOIRE
IV.1. Préparation des gels
Le gel de polyacrylamide est formé par la polymérisation du monomère d’acrylamide et de son comonomère
le bisacrylamide. Il est constitué d’un gel de concentration à 4% et d’un gel de séparation à
16%. Le tableau A2-1 présente la composition pour deux gels de 1,5 mm d’épaisseur.
- 194 -