MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Annexe 3 – Le Western blot
ANNEXE 3
LE WESTERN BLOT
Le Western blot est une technique de protéomique utilisée pour détecter spécifiquement une protéine dans
un échantillon à l’aide d’un anticorps qui lui est spécifique. Cette technique se déroule en trois étapes :
l’électrophorèse, le transfert sur membrane et l’immunorévélation.
I. ELECTROPHORESE
La première étape du Western blot est l'électrophorèse sur gel. L'électrophorèse est la migration de
particules chargées placées sous l'influence d'un champ électrique au travers d'un gel, généralement de
polyacrylamide. Lorsque les particules chargées sont des protéines, et qu’elles sont séparées en fonction
de leur poids moléculaire, l’électrophorèse est réalisée en conditions dénaturantes, en présence de Sodium
Dodécyl Sulfate (SDS). Cette électrophorèse est plus connue sous le nom de SDS-PAGE : SDS-
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.
Le système utilisé pour le Western blot comprend deux modes successifs de migration électrophorétique,
une isotachophorèse (les protéines sont soumises à un gradient de champ électrique) dans un gel dit de
concentration, puis une électrophorèse de zone monophasique (les protéines sont soumises à un champ
électrique uniforme) dans un gel du de séparation. Le passage de l'une à l'autre se fait avec un
changement de pH et par une augmentation de concentration en acrylamide du gel. L'objectif du gel
d'électrophorèse en deux parties est de limiter les problèmes liés aux faibles quantités de protéines
contenues parfois dans des volumes non négligeables déposés dans les puits. On réalise donc une étape de
concentration des échantillons jusqu'à l'obtention de zones protéiques très fines dans le gel de
concentration (isotachophorèse), qui migreront dans le gel de séparation (électrophorèse de zone). Le gel
possède plusieurs puits de sorte qu'il soit possible d'analyser plusieurs échantillons simultanément.
Les protéines, dénaturées par le SDS, sont très fortement chargées négativement. Les charges négatives
du SDS masquent totalement les charges propres des protéines. La charge de l'ensemble molécule
dénaturée/SDS (et donc sa vitesse de migration) ne dépend alors que de la longueur de la chaîne
protéique. Le gel réticulé de polyacrylamide permet alors de ralentir la migration électrophorétique des
grosses protéines, laissant migrer les petites molécules plus rapidement. Les protéines vont donc être
séparées en fonction de leur poids moléculaire.
II. TRANSFERT SUR MEMBRANE
Une fois l’électrophorèse terminée, les protéines contenues dans le gel sont alors transférées sur une
membrane de nitrocellulose ou de PVDF, par pression (transfert passif) ou par application d’un courant
(transfert actif). Ce processus est nécessaire pour permettre une détection des protéines par les anticorps
qui leur sont spécifiques. La membrane retient les protéines par des interactions non spécifiques de nature
hydrophobe et électrostatique.
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