MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Annexe 3 – Le Western blot<br />
ANNEXE 3<br />
LE WESTERN BLOT<br />
Le Western blot est une technique de protéomique utilisée pour détecter spécifiquement une protéine dans<br />
un échantillon à l’aide d’un anticorps qui lui est spécifique. Cette technique se déroule en trois étapes :<br />
l’électrophorèse, le transfert sur membrane et l’immunorévélation.<br />
I. ELECTROPHORESE<br />
La première étape du Western blot est l'électrophorèse sur gel. L'électrophorèse est la migration de<br />
particules chargées placées sous l'influence d'un champ électrique au travers d'un gel, généralement de<br />
polyacrylamide. Lorsque les particules chargées sont des protéines, et qu’elles sont séparées en fonction<br />
de leur poids moléculaire, l’électrophorèse est réalisée en conditions dénaturantes, en présence de Sodium<br />
Dodécyl Sulfate (SDS). Cette électrophorèse est plus connue sous le nom de SDS-PAGE : SDS-<br />
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.<br />
Le système utilisé pour le Western blot comprend deux modes successifs de migration électrophorétique,<br />
une isotachophorèse (les protéines sont soumises à un gradient de champ électrique) dans un gel dit de<br />
concentration, puis une électrophorèse de zone monophasique (les protéines sont soumises à un champ<br />
électrique uniforme) dans un gel du de séparation. Le passage de l'une à l'autre se fait avec un<br />
changement de pH et par une augmentation de concentration en acrylamide du gel. L'objectif du gel<br />
d'électrophorèse en deux parties est de limiter les problèmes liés aux faibles quantités de protéines<br />
contenues parfois dans des volumes non négligeables déposés dans les puits. On réalise donc une étape de<br />
concentration des échantillons jusqu'à l'obtention de zones protéiques très fines dans le gel de<br />
concentration (isotachophorèse), qui migreront dans le gel de séparation (électrophorèse de zone). Le gel<br />
possède plusieurs puits de sorte qu'il soit possible d'analyser plusieurs échantillons simultanément.<br />
Les protéines, dénaturées par le SDS, sont très fortement chargées négativement. Les charges négatives<br />
du SDS masquent totalement les charges propres des protéines. La charge de l'ensemble molécule<br />
dénaturée/SDS (et donc sa vitesse de migration) ne dépend alors que de la longueur de la chaîne<br />
protéique. Le gel réticulé de polyacrylamide permet alors de ralentir la migration électrophorétique des<br />
grosses protéines, laissant migrer les petites molécules plus rapidement. Les protéines vont donc être<br />
séparées en fonction de leur poids moléculaire.<br />
II. TRANSFERT SUR MEMBRANE<br />
Une fois l’électrophorèse terminée, les protéines contenues dans le gel sont alors transférées sur une<br />
membrane de nitrocellulose ou de PVDF, par pression (transfert passif) ou par application d’un courant<br />
(transfert actif). Ce processus est nécessaire pour permettre une détection des protéines par les anticorps<br />
qui leur sont spécifiques. La membrane retient les protéines par des interactions non spécifiques de nature<br />
hydrophobe et électrostatique.<br />
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