MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

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Annexe 2 – Marquage des protéines par l’Iode 125 Tampon phosphate/BSA : 1,3 g de KH2PO4 7,2 g de Na 2 HPO 4 5 g de BSA (sérum albumine bovine) 1 g de NaN 3 Qsp 1 litre d’eau permutée Solution de Chloramine T (CAT) à 2 mg/ml en tampon phosphate 0,05M Solution de pyrosulfite (MBS) à 3 mg/ml en tampon phosphate 0,05M Solution de KI à 10 mg/ml en tampon phosphate 0,05M Préparation des la colonne Séphadex : Equilibrer la colonne avec 50 ml de tampon phosphate/BSA avec un débit de 1ml/min. Eliminer ensuite l’excès de tampon à la surface du gel après avoir arrêter la pompe. Le gel est prêt. V. MARQUAGE DES PROTEINES Dans un tube de 5 ml, ajouter rapidement : - 5 µl de NaI125 IMS30 (# 100 µCi pour HSA et 90 µCi pour HFN) - 10 µl de tampon phosphate 0,25M - 2 µg d’HSA ou 10 µg d’HFN - 10 µl de CAT Agiter pendant 20 secondes - 50 µl de MBS - 10 µl de KI - 1 ml de tampon phosphate/BSA Déposer délicatement le contenu du tube à la surface du gel de Séphadex. Faire pénétrer la solution dans le gel en évitant de le laisser sécher. Eluer en tampon phosphate/BSA à 1 ml/min. Recueillir les fractions toutes les minutes dans des tubes de 5 ml bouchés. Compter l’activité du tube de marquage et des fractions d’élution sur un Bioscan QC 2000. Pooler les 3 premières fractions contenant le plus d’activité. DPM 160000000 140000000 120000000 100000000 80000000 60000000 40000000 20000000 0 0 2 4 6 8 10 12 Numéro de fraction DPM 70000000 60000000 50000000 40000000 30000000 20000000 10000000 0 0 2 4 6 8 10 12 Numéro de fraction Figure A2-55 : Séparation par perméation sur gel de l’HSA- 125 I des iodures Figure A2-56 : Séparation par perméation sur gel de l’HFN- 125 I des iodures - 192 -
Annexe 3 – Le Western blot ANNEXE 3 LE WESTERN BLOT Le Western blot est une technique de protéomique utilisée pour détecter spécifiquement une protéine dans un échantillon à l’aide d’un anticorps qui lui est spécifique. Cette technique se déroule en trois étapes : l’électrophorèse, le transfert sur membrane et l’immunorévélation. I. ELECTROPHORESE La première étape du Western blot est l'électrophorèse sur gel. L'électrophorèse est la migration de particules chargées placées sous l'influence d'un champ électrique au travers d'un gel, généralement de polyacrylamide. Lorsque les particules chargées sont des protéines, et qu’elles sont séparées en fonction de leur poids moléculaire, l’électrophorèse est réalisée en conditions dénaturantes, en présence de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS). Cette électrophorèse est plus connue sous le nom de SDS-PAGE : SDS- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis. Le système utilisé pour le Western blot comprend deux modes successifs de migration électrophorétique, une isotachophorèse (les protéines sont soumises à un gradient de champ électrique) dans un gel dit de concentration, puis une électrophorèse de zone monophasique (les protéines sont soumises à un champ électrique uniforme) dans un gel du de séparation. Le passage de l'une à l'autre se fait avec un changement de pH et par une augmentation de concentration en acrylamide du gel. L'objectif du gel d'électrophorèse en deux parties est de limiter les problèmes liés aux faibles quantités de protéines contenues parfois dans des volumes non négligeables déposés dans les puits. On réalise donc une étape de concentration des échantillons jusqu'à l'obtention de zones protéiques très fines dans le gel de concentration (isotachophorèse), qui migreront dans le gel de séparation (électrophorèse de zone). Le gel possède plusieurs puits de sorte qu'il soit possible d'analyser plusieurs échantillons simultanément. Les protéines, dénaturées par le SDS, sont très fortement chargées négativement. Les charges négatives du SDS masquent totalement les charges propres des protéines. La charge de l'ensemble molécule dénaturée/SDS (et donc sa vitesse de migration) ne dépend alors que de la longueur de la chaîne protéique. Le gel réticulé de polyacrylamide permet alors de ralentir la migration électrophorétique des grosses protéines, laissant migrer les petites molécules plus rapidement. Les protéines vont donc être séparées en fonction de leur poids moléculaire. II. TRANSFERT SUR MEMBRANE Une fois l’électrophorèse terminée, les protéines contenues dans le gel sont alors transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF, par pression (transfert passif) ou par application d’un courant (transfert actif). Ce processus est nécessaire pour permettre une détection des protéines par les anticorps qui leur sont spécifiques. La membrane retient les protéines par des interactions non spécifiques de nature hydrophobe et électrostatique. - 193 -
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N° d’ordre 2006-21 Année 2006 T
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