MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Chapitre IV – Les Protagonistes de la Détergence
H 2 Or
20°C
37°C 60°C
3%
5%
3% 5% 3% 5%
15 min +
+ - + - + - + - + - + -
30 min
-
- + - + - + - + - + - +
Figure IV-16 : Influence de la température sur l’activité enzymatique de la protéase formulée à 3%
et 5% dans l’Aniosyme N2 pour des temps de contact de 15 et 30 minutes. Les influences conjointes
de la température, du temps et de la concentration en protéase n’ont pas d’effet significatif sur la
dégradation de la protéine prion.
Ces résultats montrent une digestion partielle de la protéine prion puisque les profils électrophorétiques
correspondent à celui de la PrPres. L’intensité des signaux de PrPres observée est comparable pour les
différentes variables analysées. Une très légère diminution du signal est néanmoins observée à 60°C avec
la formulation à 5% d’enzymes et pour un temps de contact de 30 minutes.
Ces données montrent que la digestion enzymatique de la PrPsc en PrPres en 15 minutes est effective dès
20°C et que l’augmentation de la température lors de la phase de nettoyage n’a pas d’influence
significative sur la dégradation de la protéine prion.
Il faut atteindre des températures beaucoup plus élevées pour observer une activité protéasique sur la
PrPsc. En effet, les travaux portant sur l’inactivation de la protéine prion associent un prétraitement par la
chaleur (115°C, 40 min), en présence de tensioactif, à un traitement enzymatique consécutif. L’effet
combiné de la chaleur et du traitement enzymatique permet d’observer la digestion complète de la PrPsc
en présence de sarkosyl [Langeveld, et al. 2003]. Cette digestion n’est en revanche que partielle en,
présence de désoxycholate de sodium ou de Triton X-100 [Langeveld, et al. 2003]. Le sarkosyl
favoriserait la solubilisation et la dénaturation de la PrPsc par la chaleur, facilitant par conséquent
l’activité des protéases. Les températures auxquelles l’activité enzymatique est optimisée en présence de
tensioactifs sont incompatibles avec les exigences du nettoyage des DM thermosensibles. De plus,
l’inactivation de la protéine prion n’est pas l’objectif recherché.
Ces travaux permettent également de montrer que la seule nature d’un tensioactif n’est pas un facteur
déterminant. S’il est vrai que l’action combinée de tensioactifs anioniques et de la chaleur augmente la
sensibilité de la protéine prion au traitement enzymatique ultérieur [Jackson, et al. 1999, Langeveld, et al.
2003, Taylor, et al. 1999], cela ne peut être extrapolé pour l’ensemble des tensioactifs anioniques. Ceci
est montré notamment par le deoxycholate de sodium [Langeveld, et al. 2003].
Le pH :
Le pH peut modifier l’activité enzymatique en générant des modifications conformationnelles des
structures secondaires ou tertiaires des enzymes ou en modifiant les charges électriques des chaînes
latérales des acides aminés du site catalytique de l’enzyme. Il existe un pH pour lequel les charges
électriques des chaînes latérales du site catalytique sont plus favorables à l’interaction enzyme-substrat. Il
s’agit du pH optimum de la réaction enzymatique. Le pH optimum de la protéase de l’Aniosyme N2 est
pH 8.
Nous avons évalué l’incidence du pH sur l’activité de la protéase vis-à-vis de la protéine prion d’un HC
témoin et d’un HC de MCJs. Compte tenu de l’efficacité des formulations alcalines vis-à-vis du risque
prions [Baier, et al. 2004, Fichet, et al. 2004, Kasermann et Kempf 2003, Lemmer, et al. 2004], nous
avons privilégié les pH alcalins. La formulation Aniosyme N2 étant une formulation de pH neutre, nous
avons dû ajuster les pH par des solutions alcalines. Etant donné que les acides gras et les triglycérides
- 117 -