MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Chapitre IV – Les Protagonistes de la Détergence<br />
H 2 Or<br />
20°C<br />
37°C 60°C<br />
3%<br />
5%<br />
3% 5% 3% 5%<br />
15 min +<br />
+ - + - + - + - + - + -<br />
30 min<br />
-<br />
- + - + - + - + - + - +<br />
Figure IV-16 : Influence de la température sur l’activité enzymatique de la protéase formulée à 3%<br />
et 5% dans l’Aniosyme N2 pour des temps de contact de 15 et 30 minutes. Les influences conjointes<br />
de la température, du temps et de la concentration en protéase n’ont pas d’effet significatif sur la<br />
dégradation de la protéine prion.<br />
Ces résultats montrent une digestion partielle de la protéine prion puisque les profils électrophorétiques<br />
correspondent à celui de la PrPres. L’intensité des signaux de PrPres observée est comparable pour les<br />
différentes variables analysées. Une très légère diminution du signal est néanmoins observée à 60°C avec<br />
la formulation à 5% d’enzymes et pour un temps de contact de 30 minutes.<br />
Ces données montrent que la digestion enzymatique de la PrPsc en PrPres en 15 minutes est effective dès<br />
20°C et que l’augmentation de la température lors de la phase de nettoyage n’a pas d’influence<br />
significative sur la dégradation de la protéine prion.<br />
Il faut atteindre des températures beaucoup plus élevées pour observer une activité protéasique sur la<br />
PrPsc. En effet, les travaux portant sur l’inactivation de la protéine prion associent un prétraitement par la<br />
chaleur (115°C, 40 min), en présence de tensioactif, à un traitement enzymatique consécutif. L’effet<br />
combiné de la chaleur et du traitement enzymatique permet d’observer la digestion complète de la PrPsc<br />
en présence de sarkosyl [Langeveld, et al. 2003]. Cette digestion n’est en revanche que partielle en,<br />
présence de désoxycholate de sodium ou de Triton X-100 [Langeveld, et al. 2003]. Le sarkosyl<br />
favoriserait la solubilisation et la dénaturation de la PrPsc par la chaleur, facilitant par conséquent<br />
l’activité des protéases. Les températures auxquelles l’activité enzymatique est optimisée en présence de<br />
tensioactifs sont incompatibles avec les exigences du nettoyage des DM thermosensibles. De plus,<br />
l’inactivation de la protéine prion n’est pas l’objectif recherché.<br />
Ces travaux permettent également de montrer que la seule nature d’un tensioactif n’est pas un facteur<br />
déterminant. S’il est vrai que l’action combinée de tensioactifs anioniques et de la chaleur augmente la<br />
sensibilité de la protéine prion au traitement enzymatique ultérieur [Jackson, et al. 1999, Langeveld, et al.<br />
2003, Taylor, et al. 1999], cela ne peut être extrapolé pour l’ensemble des tensioactifs anioniques. Ceci<br />
est montré notamment par le deoxycholate de sodium [Langeveld, et al. 2003].<br />
Le pH :<br />
Le pH peut modifier l’activité enzymatique en générant des modifications conformationnelles des<br />
structures secondaires ou tertiaires des enzymes ou en modifiant les charges électriques des chaînes<br />
latérales des acides aminés du site catalytique de l’enzyme. Il existe un pH pour lequel les charges<br />
électriques des chaînes latérales du site catalytique sont plus favorables à l’interaction enzyme-substrat. Il<br />
s’agit du pH optimum de la réaction enzymatique. Le pH optimum de la protéase de l’Aniosyme N2 est<br />
pH 8.<br />
Nous avons évalué l’incidence du pH sur l’activité de la protéase vis-à-vis de la protéine prion d’un HC<br />
témoin et d’un HC de MCJs. Compte tenu de l’efficacité des formulations alcalines vis-à-vis du risque<br />
prions [Baier, et al. 2004, Fichet, et al. 2004, Kasermann et Kempf 2003, Lemmer, et al. 2004], nous<br />
avons privilégié les pH alcalins. La formulation Aniosyme N2 étant une formulation de pH neutre, nous<br />
avons dû ajuster les pH par des solutions alcalines. Etant donné que les acides gras et les triglycérides<br />
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