MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon

Chapitre IV – Les Protagonistes de la Détergence
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure IV-9. Le contrôle H 2 Or permet d’observer la PrPc dans
l’homogénat Témoin et, à la fois la PrPc et la PrPsc dans l’homogénat MCJs. Lorsque les homogénats
sont traités par la formulation Aniosyme N2, on observe la disparition du signal de la PrPc dans
l’homogénat témoin et la présence de la PrPres dans l’homogénat MCJs. Ces résultats sont en parfait
accord avec la sensibilité de la PrPc et la résistance partielle de la PrPsc à la digestion enzymatique. Les
contrôles N2Z- et N2P- confirment que les enzymes, et plus spécifiquement la protéase, sont responsables
de la digestion complète et partielle de la PrPc et de la PrPsc respectivement.
H 2 0r N2 N2Z- N2P- P0,8%
MCJs
- + - + - + - + - +
Témoin + - + - + - + - + -
P0,004%
- +
+ -
Figure IV-9 : Western blot de la PrPc (Témoin) et de la PrPsc (MCJs) suite au traitement par
l’Aniosyme N2 (N2) et par la protéase non formulée (P0,004%). Les essais contrôles sont H 2 Or :
eau du réseau, N2Z- : Aniosyme N2 sans enzyme, N2P- : Aniosyme N2 sans la protéase et P0,8% :
la protéase dans l’Aniosyme N2 concentré. L’activité protéasique est responsable de la digestion
complète de la PrPc et de la dégradation partielle de la PrPsc en PrPres. Cependant, la protéase
seule est moins active que la protéase formulée.
Si on considère à présent l’activité de la protéase P0,004% non formulée, on constate que la dégradation
de la PrPc n’est pas totale et ceci est corroboré par les résultats obtenus sur la PrPsc puisque les poids
moléculaires des différentes glycoformes ne sont que partiellement diminués. Ainsi, ces données
montrent que l’activité protéasique est améliorée lorsque les enzymes sont formulées.
C’est donc en raison de cette synergie que nous souhaitons optimiser l’activité enzymatique des
formulations vis-à-vis de la protéine prion.
Lorsque l’on s’intéresse à la dégradation enzymatique des prions dans le cadre de la détergence, il
convient, dans un premier temps, de prendre en considération le rapport entre le volume de la formulation
et celui de la salissure. Ce rapport nous permet de modéliser le volume des bains de nettoyage par rapport
à la surface des dispositifs médicaux. Compte tenu du matériel à notre disposition et de la praticabilité des
essais, nous avons attribué à ce rapport une valeur de 100. Dans ces conditions, la salissure est donc
diluée au 1/100 ème dans la formulation considérée. Il faut donc, dans un deuxième temps, avoir recours à
une technique de précipitation des protéines pour pouvoir détecter la protéine prion en Western blot. De
plus, comme nous l’avons précisé dans le chapitre III, il est nécessaire d’inhiber l’activité des enzymes de
la formulation pour ne pas introduire de biais dans la détection de la protéine prion au temps « t »
considéré. Pour nous conformer au mode d’inhibition rapporté dans la littérature, nous aurons
essentiellement recours à l’inhibition par la chaleur [Jackson, et al. 1999, McLeod, et al. 2004]. Acidifier
le pH de la solution sera néanmoins une alternative à ce mode d’inhibition.
Ces travaux sont réalisés à partir d’un homogénat de cerveau 10% (HC) d’une MCJs. Un volume d’HC
(10 µl) est incubé en présence de 100 volumes de la formulation considérée pendant 15 minutes à
température ambiante sous agitation 3D à 50 rpm. Après avoir inhibé l’activité enzymatique et précipité
la protéine prion par l’acide phosphotungstique, celle-ci est détectée par Western blot avec ou sans
traitement préalable à la protéinase K. Ce traitement par la protéinase K nous permet de disposer d’un
contrôle PrPres. L’anticorps anti-PrP utilisé est le 3F4. Toutes les formulations étudiées sont préparées
sur la base de l’Aniosyme N2. Les enzymes de la formulation sont les mêmes que précédemment, à
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