MR thèse 2006-21 - Bibliothèque Ecole Centrale Lyon
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Chapitre IV – Les Protagonistes de la Détergence<br />
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure IV-9. Le contrôle H 2 Or permet d’observer la PrPc dans<br />
l’homogénat Témoin et, à la fois la PrPc et la PrPsc dans l’homogénat MCJs. Lorsque les homogénats<br />
sont traités par la formulation Aniosyme N2, on observe la disparition du signal de la PrPc dans<br />
l’homogénat témoin et la présence de la PrPres dans l’homogénat MCJs. Ces résultats sont en parfait<br />
accord avec la sensibilité de la PrPc et la résistance partielle de la PrPsc à la digestion enzymatique. Les<br />
contrôles N2Z- et N2P- confirment que les enzymes, et plus spécifiquement la protéase, sont responsables<br />
de la digestion complète et partielle de la PrPc et de la PrPsc respectivement.<br />
H 2 0r N2 N2Z- N2P- P0,8%<br />
MCJs<br />
- + - + - + - + - +<br />
Témoin + - + - + - + - + -<br />
P0,004%<br />
- +<br />
+ -<br />
Figure IV-9 : Western blot de la PrPc (Témoin) et de la PrPsc (MCJs) suite au traitement par<br />
l’Aniosyme N2 (N2) et par la protéase non formulée (P0,004%). Les essais contrôles sont H 2 Or :<br />
eau du réseau, N2Z- : Aniosyme N2 sans enzyme, N2P- : Aniosyme N2 sans la protéase et P0,8% :<br />
la protéase dans l’Aniosyme N2 concentré. L’activité protéasique est responsable de la digestion<br />
complète de la PrPc et de la dégradation partielle de la PrPsc en PrPres. Cependant, la protéase<br />
seule est moins active que la protéase formulée.<br />
Si on considère à présent l’activité de la protéase P0,004% non formulée, on constate que la dégradation<br />
de la PrPc n’est pas totale et ceci est corroboré par les résultats obtenus sur la PrPsc puisque les poids<br />
moléculaires des différentes glycoformes ne sont que partiellement diminués. Ainsi, ces données<br />
montrent que l’activité protéasique est améliorée lorsque les enzymes sont formulées.<br />
C’est donc en raison de cette synergie que nous souhaitons optimiser l’activité enzymatique des<br />
formulations vis-à-vis de la protéine prion.<br />
Lorsque l’on s’intéresse à la dégradation enzymatique des prions dans le cadre de la détergence, il<br />
convient, dans un premier temps, de prendre en considération le rapport entre le volume de la formulation<br />
et celui de la salissure. Ce rapport nous permet de modéliser le volume des bains de nettoyage par rapport<br />
à la surface des dispositifs médicaux. Compte tenu du matériel à notre disposition et de la praticabilité des<br />
essais, nous avons attribué à ce rapport une valeur de 100. Dans ces conditions, la salissure est donc<br />
diluée au 1/100 ème dans la formulation considérée. Il faut donc, dans un deuxième temps, avoir recours à<br />
une technique de précipitation des protéines pour pouvoir détecter la protéine prion en Western blot. De<br />
plus, comme nous l’avons précisé dans le chapitre III, il est nécessaire d’inhiber l’activité des enzymes de<br />
la formulation pour ne pas introduire de biais dans la détection de la protéine prion au temps « t »<br />
considéré. Pour nous conformer au mode d’inhibition rapporté dans la littérature, nous aurons<br />
essentiellement recours à l’inhibition par la chaleur [Jackson, et al. 1999, McLeod, et al. 2004]. Acidifier<br />
le pH de la solution sera néanmoins une alternative à ce mode d’inhibition.<br />
Ces travaux sont réalisés à partir d’un homogénat de cerveau 10% (HC) d’une MCJs. Un volume d’HC<br />
(10 µl) est incubé en présence de 100 volumes de la formulation considérée pendant 15 minutes à<br />
température ambiante sous agitation 3D à 50 rpm. Après avoir inhibé l’activité enzymatique et précipité<br />
la protéine prion par l’acide phosphotungstique, celle-ci est détectée par Western blot avec ou sans<br />
traitement préalable à la protéinase K. Ce traitement par la protéinase K nous permet de disposer d’un<br />
contrôle PrPres. L’anticorps anti-PrP utilisé est le 3F4. Toutes les formulations étudiées sont préparées<br />
sur la base de l’Aniosyme N2. Les enzymes de la formulation sont les mêmes que précédemment, à<br />
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